Đồ án phân tích thực phẩm Sản phẩm bột Khoai mì được nghiên cứu với các nội dung: Giới thiệu cây Khoai mì và sản phẩm bột Khoai mì, văn bản qui định chất lượng của sản phẩm bột Khoai mì, phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng, so sánh TCVN 8796:2011 và CODEX STAN 176:1989, kết quả.
MỤC LỤC Tính cấp thiết của đề tài Bột khoai mì – một loại bột có giá trị kinh tế cao. Từ khoai mì chúng ta có thể ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như : thực phẩm, cơng nghệ mỹ phẩm và dược phẩm, cơng nghệ giấy, cơng nghệ dệt, cơng nghệ khai khống, … Đặc biệt trong lĩnh vực cơng nghiệp thực phẩm, bột khoai mì có các ứng dụng khác nhau như: chất ổn định, chất gắn kết, chất làm đặc,… những ứng dụng này là dựa vào từng đặc tính khác nhau của bột mà tạo nên. Nhưng khi muốn thêm bột khoai mì vào một loại thực phẩm nào thì ta cần quan tâm xem bột khoai mì đó có đảm bảo an tồn cho người tiêu dùng ki sử dụng sản phẩm và đạt chất lượng u cầu như đã cơng bố. Để đạt được những điều này chúng ta cần phải có các văn bản quy định mức u cầu chất lượng của sản phẩm bột khoai mì và phương pháp kiểm tra phù hợp Phạm vi và mục tiêu nghiên cứu Tìm hiểu chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm bột Khoai Mì theo Tiêu chuẩn Việt Nam, Codex Tìm hiểu các phương pháp phân tích chỉ tiêu chất lượng cho sản phẩm bột Khoai Mì theo Tiêu chuẩn Việt Nam, AOAC, ISO Đối tượng nghiên cứu Sản phẩm bột Khoai Mì Phương pháp nghiên cứu Thống kê và tổng hợp các Tiêu chuẩn Việt Nam, AOAC Phân tích và so sánh Tiêu chuẩn Việt Nam, Codex Đồ án Phân tích thực phẩm Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 2 Đồ án Phân tích thực phẩm LỜI NĨI ĐẦU Củ khoai mì (củ sắn) là loại lương thực du nhập vào nước ta vào khoảng thế kỷ 18 và được trồng khắp nơi từ Nam tới Bắc, nhiều nhất là vùng trung du miền núi. Cùng với truyền thống trồng khoai mì lâu đời, nhân dân ta đã biết chế biến củ khoai mì làm lượng thực cho người và thức ăn cho gia súc Từ củ khoai mì ta có thể chế biến thành nhiều sản phẩm thực phẩm phong phú khác nhau như: bột khoai mì, nguồn ngun liệu sản xuất đường glucose, sản xuất mì chính, … Trong những sản phẩm trên đáng chú ý là bột Khoai Mì, vì nó được dùng làm ngun liệu rất phổ biến trong nhiều loại thực phẩm như bánh kẹo, mì ăn liền, bánh phở, hủ tiếu,… Để có thể đưa bột Khoai Mì vào làm ngun liệu chính hay phụ liệu của một sản phẩm thực phẩm trước tiên chúng ta cần đảm bảo chất lượng của loại bột ấy. Để thực hiện được điều này chúng ta cần tìm hiểu và thực hiện các quy định, các phương pháp kiểm tra về chất lượng của sản phẩm bột Khoai Mì Đề tài này tiến hành tìm hiểu, tổng hợp, so sánh các quy định về sản phẩm bột khoai mì của cả Việt Nam và Codex Trong q trình làm bài do hiểu biết và tài liệu còn hạn hẹp nên khó tránh khỏi những sai sót mong Cơ bỏ qua Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện PHẦN 1 GIỚI THIỆU CÂY KHOAI MÌ VÀ Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 3 Đồ án Phân tích thực phẩm SẢN PHẨM BỘT KHOAI MÌ 1.1 Cây khoai mì 1.1.1 Cây khoai mì thuộc: Giới (Regnum): Plantae Ngành (Divisio): Magnoliophyta Lớp (Class): Magnoliopsida Bộ (Ordo): Malpighiales Họ (Familia): Euphorbiaceae Chi (Genus): Manihot Lồi (Species): M.esculenta Hình 1: Cây khoai mì 1.1.2 Đặc điểm Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 4 Đồ án Phân tích thực phẩm Khoai mì (hay còn gọi là sắn) có tên khoa học là Manihot Esculenta là cây lương thực ưa ẩm. Ở Việt Nam, khoai mì bao gồm nhiều loại giống. Nhân dân ta thường căn vào kích tấc, màu sắc củ, thân, gân lá và tính chất khoai mì đắng hay ngọt (quyết định bởi hàm lượng acid HCN cao hay thấp) mà tiến hành phân loại. Tuy nhiên, trong cơng nghệ sản xuất bột khoai mì người ta thường chia thành hai loại: khoai mì đắng và khoai mì ngọt − Đặc điểm sinh học Thân: thuộc loại cây gỗ cao từ 2 đến 3m, giữa thân có lõi trắng và xốp nên rất yếu Lá: thuộc loại lá phân thùy sâu, có gân lá nổi rõ mặt sau, thuộc loại lá đơn mọc xen kẽ, xếp trên thân theo chiều xoắn ốc. Cuống lá dài từ 9 đến 20cm có màu xanh, tím hoặc xanh điểm tím Hoa: là hoa đơn tính có hoa đực và cái trên cùng một chùm hoa. Hoa cái khơng nhiều, mọc ở phía dưới cụm hoa và nở trước hoa đực nên cây ln ln được thụ phấn của cây khác nhờ gió và cơn trùng Rễ: mọc từ mắt và mơ sẹo của hom, lúc đầu mọc ngang sau đó cắm sâu xuống đất. Theo thời gian chúng phình to ra và tích lũy bột thành củ Củ khoai mì thường nhọn hai đầu. Kích thước củ tùy thuộc chất đất và điều kiện trồng mà dao động trong khoảng: dài 0,1 – 1,1m; đường kính 2 – 8cm 1.1.3 Phân loại khoai mì Có nhiều loại khác nhau về màu sắc, thân cây, lá, vỏ, thịt củ,… Tuy nhiên, trong cơng nghệ sản xuất bột khoai mì người ta thường chia thành hai loai chính: khoai mì đắng và khoai mì ngọt. Hai loại này khác nhau về hàm lượng tinh bột và hàm lượng độc tố. Nhiều tinh bột thì hiệu quả kinh tế trong sản xuất cao và nhiều độc tố thì quy trình cơng nghệ sản xuất phức tạp Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 5 Đồ án Phân tích thực phẩm Khoai mì đắng hay còn gọi là khoai mì dù. Cây thấp (khơng cao q 1,2m), ít bị đổ khi gió to. Màu vỏ gỗ của củ nâu sẫm, vỏ cùi và thịt đều trắng. Năng suất cao, củ mập, nhiều tinh bột, nhiều mủ và có hàm lượng acid cyanhydric cao. Ăn tươi dễ bị ngộ độc, chủ yếu để sản xuất tinh bột và khoai mì lát Khoai mì ngọt bao gồm tất cả các loại mà hàm lượng acid cyanhydric thấp như: khoai mì vàng, khoai mì đỏ, khoai mì trắng,… Khoai mì vàng hay còn gọi là khoai mì nghệ. Vỏ gỗ của củ màu nâu, vỏ cùi màu trắng, thịt củ màu vàng nhạt, khi luộc màu vàng rõ rệt hơn Khoai mì đỏ: củ dài to, vỏ gõ màu nâu đậm, vỏ cùi dày, màu hơi đỏ, thịt trắng Khoai mì trắng: củ ngắn, mập, vỏ gỗ màu sám nhạt, thịt và vỏ cùi màu trắng Khoai mì ngọt có hàm lượng tinh bột thấp, ít độc tố, ăn tươi khơng ngộ độc, dễ chế biến 1.2 Củ khoai mì 1.2.1 Cấu tạo củ khoai mì Tùy theo giống, điều kiện canh tác và độ màu mỡ của đất mà củ sắn có kích thước: dài 0,1 – 1,2m và đường kính 2 – 12cm. Đường kính thường khơng đều theo chiều dài củ, phần gần cuống to nhưng càng gần chi càng nhỏ. Hình dạng củ khơng đồng nhất. Có củ thẳng, củ cong, có củ lại biến dạng cục bộ. Càng gần chi củ càng mềm vì ít xơ do phát triển sau. Do đó khi thu hoạch khó có thể giữ cho củ ngun vẹn, đó là một trong những khó khăn khi bảo quản tươi − Vỏ gỗ: chiếm 1 – 3% khối lượng củ, có màu trắng, vàng hoặc nâu. Vỏ gỗ cấu tạo từ celluloza và hemicelluloza, hầu như khơng có tinh bột. Nó có tác dụng bảo vệ củ khỏi bị ảnh hưởng cơ học và hóa học của ngoại cảnh, phòng tránh mất nước của củ Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 6 Đồ án Phân tích thực phẩm − Vỏ cùi (vỏ thịt): dày hơn vỏ gỗ nhiều, chiếm khoảng 8 – 15% trọng lượng củ Cấu tạo vỏ cùi gồ lớp tế bào mơ cứng phủ ngồi. Thành phần lớp này cũng chủ yếu là celluloza, gần như khơng có tinh bột nhưng chứa nhiều dịch bào (mủ). Nó cũng giữ vai trò chống mất nước của củ đồng thời phòng các tác động khác từ bên ngồi. Tiếp lớp tế bào mơ cứng là các lớp tế bào mơ mềm. Trong các tế bào này chứa dịch bào và khoảng 5% tinh bột. Những hạt tinh bột này có kích thước rất nhỏ khoảng 5 – 8µm. Khi chế biến khó thu được lượng tinh bột này vì q nhỏ nên tổn thất theo nước thải Tiếp vỏ cùi là khe mủ, nơi tập trung mủ giữa vỏ với thịt sắn − Thịt củ khoai mì: là thành phần chủ yếu của củ. Lớp ngồi là tầng sinh gỗ, thành phần bao gồm cellulose và pentosan. Tiếp trong là thịt sắn với các tế bào chứa tinh bột và protein, glucide hòa tan và nhiều chất vi lượng khác. Những tế bào lớp ngồi thịt củ chứa nhiều tinh bột, càng sâu vào trong hàm lượng tinh bột giảm dần Ngồi lớp tế bào nhu mơ còn chứa các tế bào thành cứng khơng chứa tinh bột, cấu tạo từ celluloza nên cứng như gỗ gọi là xơ. Loại tế bào này nhiều ở đầu cuống, khoai mì lưu niên và những củ biến dạng trong q trình phát triển. Khoai mì lưu 2 mì lưu 2 năm thì có một lớp xơ, lưu 3 năm thì có hai lớp xơ. Theo lượng lớp xơ mà biết khoai mì được lưu bao nhiêu năm − Lõi: ở trung tâm, dọc suốt từ cuống tới cuối củ, chiếm 1 – 2% khối lượng tồn củ, là xương của củ, chức năng vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng cho củ. Càng sát cuống lõi càng lớn và nhỏ dần về phía cuối củ. Lõi cấu tạo chủ yếu từ celluloza. Khoai mì có lõi lớn và nhiều xơ thì hiệu suất và năng suất của máy xát giảm vì xơ cứng, phần thì xơ kẹt vào răng máy hạn chế khả năng phá vỡ tế bào giải phóng tinh bột. Mặt khác, xơ nhiều thì răng máy xát chóng mòn Ngồi ra, còn có các bộ phận khác: cuống, rễ,… Các phần này cấu tạo chủ yếu là celluloza cho nên củ cuống dài và nhiều rễ thì tỷ lệ tinh bột thấp và chế biến khó khăn 1.2.2 Thành phần hóa học của củ khoai mì Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 7 Đồ án Phân tích thực phẩm Thành phần hóa học của củ khoai mì dao động trong khoảng khá rộng tùy thuộc vào loại giống, điều kiện phát triển của cây và thời gian thu hoạch và một số yếu tố khác − Hàm lượng tinh bột của khoai mì cũng phụ thuộc nhiều yếu tố như mức độ già. Đối với giống khoai mì một năm thì vụ chế biến có thể bắt đầu từ tháng 9 và kết thúc vào tháng 4 năm sau, nhưng đào vào tháng 12 và tháng 1 thì hàm lượng tinh bột cao nhất. Tháng 9, tháng 10 củ ít tinh bột, hàm lượng nước cao, lượng chất hòa tan nhiều, vậy nếu chế biến khoai mì non khơng những tỷ lệ thành phẩm thấp mà con khó bảo quản tươi. Sang tháng 2, tháng 3 lượng tinh bột trong củ lại giảm vì một phần phân hủy thành đường để ni mầm non trong khi cây chưa có khả năng quang hợp − Đường khoai mì chủ yếu glucoza lượng mantoza, sacaroza. Khoai mì càng già thì hàm lượng đường càng giảm. Trong chế biến đường hòa tan trong nước thải ra theo nước dịch − Nước: Lượng ẩm trong củ khoai mì tươi rất cao, chiếm khoảng 70% khối lượng tồn củ − Độc tố trong củ khoai mì là hợp chất glucoside (C10H17NO6), bản thân nó khơng độc nhưng trong mơi trường acid nó bị phân hủy và giải phóng ra acid cyanhydric (HCN) là chất rất độc khi ngửi hoặc ăn. Trong chế biến có thể hạn chế tạo ra hoặc loại bỏ nó dễ dàng. Củ khoai mì đắng độc hơn của khoai mì ngọt − Vitamin: Chủ yếu thuộc nhóm B. Trong đó, vitamin B1 có khoảng 0,003mg/%, vitamin B2 khoảng 0,003mg/%, vitamin PP khoảng 0,6mg/% − Hệ enzyme: Trong khoai mì, chất polyphenol hệ enzyme polyphenoloxydaza có ảnh hưởng nhiều tới chất lượng trong bảo quản và chế biên. Khi chưa đào hoạt động chất men trong khoai mì yếu và ổn định, nhưng sau khi đào thì chất men hoạt động mạnh. Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 8 Đồ án Phân tích thực phẩm Polyphenoloxydaza xúc tác q trình oxy hóa polyphenol tạo thành octoquinon sau đó trùng hợp các chất khơng có bản chất phenol như acid amin để hình thành sản phẩm có màu Trong nhóm polyphenoloxydaza có những enzyme oxy hóa các monophenol mà điển hình là tirozinnaza xúc tác sự oxy hóa acid amin tirozin tạo nên quinon tương ứng Sau một số chuyển hóa các quinon này sinh ra sắc tố màu xám đen gọi là melanin. Đây là một trong những ngun nhân làm cho thịt củ có màu đen mà thường gọi là khoai mì chảy nhựa. Vì enzyme tập trung trong mủ ở vỏ cùi cho nên các vết đen cũng xuất hiện trong thịt củ bắt đầu từ lớp ngoại vi Khi khoai mì đã chảy nhựa thì lúc mài xát khó mà phá vỡ tế bào để giải phóng tinh bột do đó hiệu suất lấy tinh bột thấp, mặt khác tinh bột khơng trắng Các enzyme oxy hóa khử cũng hoạt động mạnh làm tổn thất chất khơ của củ Hàm lượng tanin trong củ khoai mì ít nhưng sản phẩm oxy hóa tanin là chất flobafen có màu sẫm đen khó tẩy. Khi chế biến, tanin còn tác dụng với sắt (Fe) tạo thành sắt tannat cũng có màu xám đen. Cả hai chết này đều ảnh hưởng đến màu sắc tinh bột nếu như trong chế biến khơng tách dịch bào nhanh và triệt để Hệ enzyme, tanin, sắc tố và độc tố gây khó khăn cho chế biến và nếu qui trình khơng thích hợp sẽ cho sản phẩm có chất lượng kém 1.2.3 Về giá trị dinh dưỡng Tinh bột Khoai mì chủ yếu là một thức ăn cung cấp năng lượng, 100gram khoai mì khơ cho 348kcal xấp xỉ với ngũ cốc. Trong khoai mì, tinh bột là thành phần quyết định giá trị sử dụng, chiếm khoảng 32,28% tổng các chất có trong củ khoai mì (amylose: 13 – 15%, amylopectin: 85 – 87%) Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 9 Đồ án Phân tích thực phẩm Tinh bột khoai mì có màu trắng. Trong q trình sản xuất nếu củ bị nghiền khi chưa bóc vỏ thì tinh bột thu được có màu rất tối, màu xám của tinh bột ảnh hưởng đến chất lượng cũng như giá cả của sản phẩm Hạt tinh bột khoai mì có kích thước 5 – 40µm, trung bình khoảng 30 µm (hạt lớn 25 – 36µm, hạt nhỏ 5 – 15µm) Tinh bột khoai mì có nhiệt độ hồ hóa trong khoảng 58,5 – 70oC Tinh bột khoai mì có một số tinh chất thuận lợi cho chế biến thực phẩm như: − Tinh bột khoai mì khơng có mùi nên khơng ảnh hưởng đến mùi vị đặc trưng của thực phẩm, ta có thể dùng chúng kết hợp với các thành phần có mùi khác − Tinh bột khoai mì trong nước sau khi gia nhiệt sẽ tạo thành sản phẩm dạng paste trong suốt nên khơng ảnh hưởng đến màu của thực phẩm − Tỷ lệ amylopectin: hàm lượng amylopectin trong tinh bột khoai mì cao nên gel tinh bột có độ nhớt, độ dính cao và khả năng gel bị thối hóa thấp Lipit: Củ có hàm lượng các acid béo tương đối cao (bao gồm cả acid béo no và khơng no) Protein: Củ chỉ có 0,59 – 1,95g protein trong 100g Bảng 1: Thành phần acid amine trong phần thịt ăn được của củ khoai mì tươi Acid amine Lysine Methionine Trytophan Threonine Valine Leucine Isoleucine Arginine Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Hàm lượng (mg/100g) 87 0 36 42 54 40 52 Page 10 [5] ISO 6540:1980, Maize – Determination of moisture content (on milled grains and on whole grains) [6] ISO 24333, Cereals and cereal products – Sampling [7] ISO 24557, Pulses – Determination of moisture content – Air – oven method AOAC Official Method 985.18 α – Zearalenol And Zearalenone in Corn Liquid Chromattographic Method First Action 1985 Final Action 1998 Caution: α – Zearalenol is more estrogenic than zearalenone Handle both compounds with due regard to their biological activity A Principle Ground test sample is extracted with CHCl 3 and cleaned up by liquid – liquid partitioning Toxins are determined by liquid chromatography with fluorescence detection B Apparatus (a) Liquid chromatograph – Equipped with injection valve and 20µL injection loop (b) Iiquid chromatographic column µBondapak reverse phase C 18 (10µm) column, 25cm 4,6mm (Waters Associates, Inc.), or equivalent, with appropriate guard column (c) Detector – Model FS 970 fluorescence detector (replacement Model Spectroflow 980) with variable wavelength exitation and 418nm emission cut – off filter (Applied Biosystems, Inc., 170 Williams Dr, Ramsey, NJ 07446, USA), or equivalent (d) Filter Swinney filter assembly and glass filters (13mm) (gelman Scientific, Inc.), or equivalent (e) Grinder – in Raymond hammer mill equipped with screen having 1/8 in. diameter perforations (f) Membrane filter – Disposable, plastic sealed mini filters with Luer – Lok hub, 0,45µm (3cm diam). (Milex HV, Millipore) or equivalent C Reagents (a) Standard solutions – Prepare stock solutions containing 25µg α – Zearalenol and zearalenone/mL CH3CN of (Pitman – Moore, Inc., PO Box 207, Terre Haute, IN 47808, USA, or equivalent). Transfer 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 and 2.0mL stock solution to separate vials and evaporate solvent to dryness under N 2. Add 10.0mL mobile phase, (b), to each vial and cap tightly. Working standard concentrations are 0.25, 0.5, 1.25, 2.50, and 5.0µg toxin/mL (b) Mobile phase – Combine methanol, CH3CN, and H2O (1.0 + 1.6 +2.0) and degas by sonication or under vacuum. Stir continously during use (c) Sodium chloride solution – Saturated, aqueous (d) Sodium hydroxide solution – 2%. Dissolve 20g NaOH in 1L H2O (e) Diatomaceous earth – Hyflr Super – Cel D Preparation of Sample Grind sample in hammer mill to pass U.S. Standard no.20 sieve M ix well E Extraction Accurately weigh 50g test portion and transfer to 500mL glass – stoppered or screw – cap (Teflon – lined) extraction flask. Add 25g diatomaceous earth and 20mL H2O and rotate flask to accomplish some mixing. Add 250mL CHCl 3, stopper tightly, and shake 15min on wrist – action shaker Filter through fluted paper and collect 50mL extract (10g equivalent) in 100mL graduated cylinder. Transfer to 250mL separator and add 10mL NaCl solution and mix. Add 50mL of 2% NaOH solution and shake vigorously ca 1min Let layers separate and discard lower CHCl 3 layer Add 50mL citric acid solution to separator, mix, and extract zearalenone/zearalenol with 50mL CH 2Cl2. Shake ca 1min, and let phases separate. Drain lower phase through ca 2 in. (40g) anhydrous Na2SO4 in glass funnel with glass wool ball (drain any emulsion at interface through N2SO4). Re – extract aqueous phase with second 50mL CH 2Cl2 and, after phase separate, drain organic layer through Na2SO4 as before. Wash Na2SO4 with 10 – 15mL CHCl2. Evaporate combined CH2Cl2 extract to near dryness on flash evaporator. Transfer residue to 4mL Teflon – lined screw – cap vial with 34 washes of CH 2Cl2. Evaporate to dryness under N2 and dissolve in 0.500mL mobile phase by Vorte – mixinng and filter through 0.45µm filter attached to 1mL syringe F Determination Set flow rate of mobile phase to 2.0mL/min. precondition column with several column volumes of mobile phase. If erratic baseline persists, wash with CH 3CN and re – equilibrate with mobile phase. Set fluorescence detector to 236nm (excitation), 418nm (emission), range 1.0µA, supression high, time constant ca 4 – 6s (0.1 average peak witdth). Set recorder to 2min/cm (5min/in) Inject 20µL of each standard solution and construct standard curve by plotting peak height vs concentration (retention time of α – Zearalenol is 4.5 min and zearalenone is 5.5 min) on C8 column. Check reproducibility of standard curve daily by making at least 2 injections of both standards Inject 20µL test solution from F under identical conditions as used for standards. Identify zearalenone and α – Zearalenol peaks by retention times. Calculate amount of toxins in test sample from following equation: − Zearalenone/α – Zearalenol, ng/g = (PH/PH’) ng standard injected/g test solution injected (0.4g) Where PH and PH’ = peak heights for test solution and standard, respectively. Use standards which give peak heights comparable to test solution peak heights G Confirmation Sequentially inject 20µL zearalenone/α – Zearalenol standard and test soution and determine peak heights at 236 and 274nm (excitation) Calculate peak height ratio, 236/274, for standard and test solution. Peak height ratio for test solution must agree within 5% with peak height ratio for standards AOAC Official Method 986.17 Deoxynivalenol in Wheat Chromatographic Method First Action 1986 Final Action 1990 AOAC – AACC Method Applicable at levels ≥ 300ng/g A Apparatus (a) Grinder – Centrifugal grinding mill equipped with 2mm sieve (Retsch Model ZM 1, available from Brinkmann, or equivalent) (b) Chromatographic tube – Polypropylene (10mm id 50 mm) equipped with plastic filter disk and reservoir (or equivalent plastic syringe) (c) Filter flask – 125 mL fitted with rubber stopper having 7/16 in. (11mm) diameter single hole to hold chromatographic tube (d) TLC plates – Precoate 20 20cm silica gel 60 plates (No5763, E.Merck, or equivalent). Predipped plates: Dip plates in 15% AlCl 3 solution [see B(d)(2)] and let stand in vertical position 5min to drain. Remove residual AlCl 3 from back of plate with wet paper towel. Air – dry 2h and activate 1h at 105oC. Store in dust – tight cabinet (e) Viewing cabinet – Chromato – Vue C 6 (UVP, Inc), or equivalent, fitted with longwave UV lamp (f) Fluorodensitometer – Optimal Camag Model 76511 Cabinet (UVP, Inc) (replacement Model No.027.6610) (CAMAG, Sonnenmattstrasse 11, CH – 4132 Muttenz, Switzerland, or U.S distributor, CAMAG Scientific, Inc., 1200N. 23 rd St, Wilmington, NC 25405, USA) Excitation 366nm, emission filter cutoff 400nm, with SP 4100 electronic integrator (Spectra – Physics, 45757 Northport Loop W, Fremont, CA 94537, USA), or equivalent B Reagents (a) Activated charcoal – Darco G – 60 (J.T.Baker, Inc., No E 343) (b) Alumina – Neutral, activated, 80 – 200mesh No.AXO61 (EMScience), or equivalent (c) Diatomaceous earth – Acid – washed Celite 545 (d) Aluminum chloride solution – (1) Spray reagent – Dissolve 20g AlCl 3.6H2O in 100mL alcohol – H2O (1+1). (2) Dip reagent – Mix 1,5g AlCl 3.6H2O with 15mL H2O and add 85mL alcohol; then mix and warm on steam bath until dissolved (e) Deoxynivalenol (DON) standard solutions – Stock solution – 0.5mg/mL. weigh 5.0mg DON (Sigma Chemical Co), into 10mL glass – stoppered volumetric flask, dilute to volume with ethyl acetate methanol (19+1), and shake vigorously to dissolve. TLC standard solution 20µg/mL. Pipet 1.0mL DON stock solution into 25mL volumetric flask and dilute to volume with ethyl acetate – methanol (19+1) C Sample Preparation Grind 5 – 10lb (2 – 4kg) wheat to pass U.S 20mesh sieve and blend D Extraction Weigh 50g ground, blended wheat into 500mL glass – stoppered Erlenmeyer. Add 200mL CH3CN – H2O (84+16); secure stopper with masking tape Vigorously shake 30min on shaker. Filter through Whatman No.2 paper. Collect 20mL filtrate in 25mL graduated cylinder E Column Chromatography Secure chromatographic tube on 125mL filter flask. Place small ball of glass wool in bottom of tube and add ca 0,1g Celite Weigh 0.7g charcoal, 0.5g alumina, and 0.3g Celite. Place in 50mL beaker and thoroughly mix with spatula. Add mixture to chromatographic tube. Or prepare mixture of charcoal – alumina – Celite (7+5+3) in glass – stoppered Erlenmeyer in quantities enough for number of columns needed. Mix well. Weigh 1.5g mixture for each column. Keep mixture from separating by occasionally mixing Tap tube lightly to settle packing. Apply suction and place ball of glass wool on top. Columns may be prepared ahead of time and stored in upright position in beaker covered with Al foil for use as needed Apply 20mL filtrate from D to column and apply vacuum. Flow rate should be 2 3mL/min with 20cm Hg vacuum. As solution reaches top of packed bed, rinse cylinder with 10mL CH3CNH2O (84+16) and then add rinse to column and continue aspiration until flow stops. Do not let column go dry between addition of extract and addition of wash solution. Cover vacuum nipple tightly with small piece of Al foil and evaporate solvent slowly to dryness on steam bath. (Note: Do not contaminate sample with H 2O droplets remain in flask on cooling. Add 3mL ethyl acetate to residue and heat to boiling on steam bath; then remove from bath and gently swirl to dissolve DON Transfer solution to 2 dram vial and rinse with three 1.5mL portions of ethyl acetate. Evaporate to dryness on steam bath under stream of N2. Retain dry residue for TLC. Final extract represents 5g sample F Quantiation Dissolve residue from E in vial in 100µL CHCl3 – CH3CN (4+1). Apply 5 and 10 µL aliquots of test solution alongside 1,2,5,10, and 20µL working standard solution (20ng DON/µL) spots on scored TLC plate (1cm channels) Develop plate with CHCl 3 – acetone – isopropanol (8+1+1) in unequilibrated tank (development time is ca 1h). remove plate from tank and let solvent evaporate from plate at room temperature, in well ventilated hood ≥ 10min residual solvent can result in fading of DON spots during subsequent operations. For undipped plates, spray evenly with AlCl 3 solution until layer just appears wet. Before heating, briefly examine plate under longwave UV light for possible blue fluorescing interferences Heat plate 7min in upright position in 120 oC convection oven. (Note: analyst may need to optimize time and temperature settings for particular plates used). Place plate on cool surface in dark 1min. observe DON as blue fluorescent spot under longwave UV light at R f ca 0.6. spot should be well resolved from background flourescent spots; 20ng DON standard spot should be discernible from background of TLC plate Lower limit of detection should be determined for other commercial brands of TLC plates when substituted Quantitate DON by comparing fluorescence intensity of test spot with those of standard DON spots visually or densitometrically. When using densitometer, scan spots from top to bottom, parallel to direction of development. Densitometric responses must be confirmed by visual inspection, especially for levels ≤200ng/g response must be linear relative to standard concentration, at least for 100,200, and 400ng spots; 20 and 40ng spots can be used to abtain estimate of concentrations ≤ 100ngg. For quantitation at these lower concentrations, rechromatograph test solution, using more sample extract. After scanning all channels of plate, repeat scan for first spot measured. Values for the scans should agree within instrument replication capabilities as previously determined. Ozone produced by instruments equipped by covering TLC plate before and during densitometric scanning or by venting ozone Calculate amount of DON in test sample, using following formula: DON, ng/g test sample = S (C/X) (V/W) Where S = µLstandard equal to test spot; C = concentration of standard solution (20µg/mL); X = µL test solution that had fluorescence intensity equal to standard spot; V = final volume of test ssolution (µL); and W = amount of test portion represented by final test solution (5g) When dilutions are require, test solution equivalent to 0.75g sample is used for initial determination; therefore, extract solution equivalent to 4.25 test sample remains in vial Reference: JAOAC 69,37 (1986) AOAC Official Method 994.01 Zearalenone in Corn, Wheat, and Feed Enzyme – Linked Immunosorbent (Agri – Screen Method First Action 1994 Final Action 1997 (Applicable to detection of zearalenone in corn, wheat, and pig feed at ≥ 800ng/g) See Tables 994.01A and 994.01B for the results of the interlaboratory study A Principle Detection of zearalenone is based on competitive binding enzyme immunoassay (EIA) using specific monoclonal antibodies Zearalenone is extracted with methanol water 970+30). Extract is filtered and mixed with equal volume of zearalenone enzyme conjugate. Samples and controls are placed into microtiter wells coated with zearalenone – specific monoclonal antibodies Zearalenone present in sample attaches to specific antibodies adsorbed on well Wells are washed to remove unbound zearalenone and zearalenone enzyme conjugate and activated enzyme substrate is added After stop solution is added, concentration of zearalenone in sample depends, inversely, on intensity of color development and is determined visually or spectrophotometrically (approximate levels of zearalenone are interpolated from standard curve) B Antibody Specificity Anti – zearalenone antibodies bind zearalenone analogues, especially α – zearalenol. The cross – reactivity is similar for zearalenone and α – zearalenol (100% and 117%, respectively) Cross – reactivities to other zearalenone analogues are: zearalenol 29%, α – zearalenol 35%, zearalenol 25%. Standard curves constructed with zearalenone standard solutions (3000n/g) provide quality control measure for analytical stability C Apparatus (a) Shaker – Wrist – action shaker, Burrell or equivalent (b) Vials – 4ml; Teflon – lined screw – cap vials (c) Filter paper – Whatman 2V rapid – flow filter paper, or euivalent (d) EIA reader – Photometer with 650nm filter, capable of reading microtiter wells (Biotek Model EL308 available from Biotek Instruments, Inc , or equivalent) (e) Micropipet (optional) – Capable of accurately delivering 100 µl solution (Rainin Pipetteman, or equivalent) Multichannel pipets are acceptable Pre – set pipetting syringes and tips are available in kit form D Reagents (a) Zearalenone enzyme conjugate – Lyophilized (b) Conjugate diluent – Distilled H2O (c) Antibody coated microtiter strip plates – Polystyrene microtiter strip plates, each containing 8 or 12 wells coated with monoclonal antibodies to zearalenone (d) TMB peroxidase substrate (solution A) – Tetramethylbenzidine (Sigma Chemicals, St.Louis, MO 63178, USA), 0.4g/L citrate buffer (pH 4.0). Store 4oC (e) Stop solution – Add 1ml 3% red dye (FD&C No.40), 3,5mg hydrofluoric acid, 10,5g sodium citrate, 6mL 1M NaOH, and 400mg NaEDTA to 1L distilled H2O (f) (g) controls – Methanol water (70+30). Mix (v/v) reagent – grade methanol with distilled H2O (70+30) (g) Standard solutions – Teflon – lined, screw – capped amber vials containing toxin – free corn, wheat, and feed etracts (methanol water) spiked with zearalenone at level (ng/g): 0, 200, 500, 1000, 1500, and 3000. Prepare standard curve at time samples are tested Table 994.01A Interlaboratory study results for determination of zearalenone using visual method Commodity Meana, ng/g 95% confidence intervals Positive Lower limit Upper limit response, % 0 247±27 36 17.2 55.7 Corn 800 96 86.5 99.5 2570±180 100 93.2 100 215±10 26 8.2 52.2 300 37 24.3 51.3 Wheat 1000 100 87.2 100 1027±29 100 93.4 100 352±34 17 8.2 30.3 Pig feed 500 75 61.1 86.0 1295±29 100 86.8 100 a Spiked samples (added concentration) or naturally contaminated samples (concentration determined by LC) Table 994.01B Interlaboratory study results for determination of zearalenone by spectrophotometric method Zearaleno ne added Mean Commodi or founda, sr sR RSDr,% RSDR,% ty determine ng/g d by LC, ng/g 800 940 30 153 3.1 16.3 Corn 2570±180 3191 350 840 11.0 26.3 300 452 70 143 15.5 31.7 Wheat 1027±29 1482 150 236 10.1 15.9 500 613 99 167 16.1 27.2 Pig feed 352±34 255 36 146 13.9 57.1 a First line lists average results for spiked samples, second line lists average results for naturally contaminated samples. Average for spectrophotometric method was calculated from values determined from standard curve Items (a)–(g) are available as AgriScreen Kit for Zearalenone (Neogen Corp., 620 Lesher Pl, Lansing, MI 48912). Validated, alternative reagents are acceptable E General Instructions Store test samples, reagents, and kit components at 48oC. Do not freeze. Bring reagent and kit components to room temperature (2025oC) prior to use. Reagent are stable at room temperature 8 h. Return reagents to 48oC after use. Assay one set of test samples (6/set) at time. Assay each set twice. Determine results (color development) after stop solution is added F Sample Extraction Carefully transfer 20 g test portion to 500 mL glassstopper or screwcap extraction flask. Add 200 mL methanolwater solution (70 + 30), close lightly, and shake for 3 min on wristaction shaker, C(a). Filter through Whatman 2V filter paper, C(c). Collect ca 4 mL. Analyze filtrate immediately or transfer to crewcap vial and store at 4 8oC for ≤24 h G Preparation of Reagent Solutions Bring reagent to room temperature (2025oC) prior to use (1) Enzyme conjugate solution: Transfer conjugate diluent, D(b), to vial, C(b). Replace stopper and gently swirl to mix contents until dissolved. Store in refrigerator for ≥7 days (2) TMB substrate solution: Mix solution A, [D(d)], with solution B, [D(e)]. Mix 1 tube when 8well strip is used (2 tubes/12well). Use same day (3) Remove seal from stop solution vial and set aside for later use. Figure 994.01A – Suggested setup for microtiter wells: visual determination H Zearalenole Determination Using Visual Method (1) Remove from packages equal numbers of mixing wells (redlabeled) and antibody coated wells, D(c), and place in strip holder. Place antibodycoated wells 2 rows behind mixing wells. Reseal packages. Label end of each strip to keep test solution in order. Use 1 well/test solution. See Figure 994.01A (2) Using micropipette transfer 100 µL aliquots of enzyme conjugate solution, G(1), to each mixing well. Discard pipet tip (3) Remove caps from control vials and corresponding test solutions. (e.g., Assay com test solutions with corn control.) Using new pipet tip, add 100 µL control to first mixing well. Mix solutions by depressing and releasing pipet plunger 3 times. Using same pipet tip immediately transfer 100 L mixed solutions to first antibodycoated well (4) With new pipet tip, transfer 100 µL test solution to second mixing well. Mix solutions same way as in (c), and transfer 100 µL mixing well. Mix solutions to second antibodycoated well. Discard pipet tip (5) Repeat step (d) for each test solution and control to be assayed (6) Incubate mixed solutions with antibodycoated wells for 15 min after last well is filled (7) Wash wells after incubation with distilled H2O, Gentle direct H2O stream into each well with wash bottle. Shake out H2O. Repeat wash steps 10x. After last wash tap wells hard enough on paper towel to remove remaining H2O. Do not dry with paper, cloth, or stream of air (8) Transfer 100 µL aliquots of TMB substrate solution, G(2) to each antibodycoated well using new pipet tip (9) Incubate for 15 min and make preliminary observation. Test well containing low levels of zearalenone (ng/g) will develop blue color within 15 min. Positive test solutions (>500 ng/g) will remain clear or light blue. Note blue color develops within 5 Figure 994.01B – Suggested setup for microtiter wells: spectrophotometric determination (10) After 15 min incubation, using new pipet tip add 100 µL aliquots of stop solution, D(f), to each well (11) Screen wells on white, mattefinish background. Test solutions showing less pink color than control are negative. Test solutions showing more pink color than control are positive Repeat steps (1) – (11). Results from both assays should agree Positive results must be confirmed by AOAC Method 985.18 (see 49.9.02) I Zearalenone Determination by Spectrophotometric Method Perform as in H(1) – (11) using 12well microtiter strips of mixing wells and antibody coated wells, D(c) ( see Figure 994.01B), Use 1 uncoated well from black marked package to blank microtiter well reader, I(a) (a) Set blank on microtiter well reader with uncoated well containing only 100 µL enzyme conjugate, G(1), and 100 µL stop solution, D(f) (b) Determine and record absorbance, A, for standard solutions, D(i), and test solutions. Assign 100% A to 0 ng/g standard solution. Divide A value of test well by A value of 0 ng/g standard solution. Repeat this procedure for all remaining wells. Prepare graph by plotting on logitlog paper A values of standard solutions (%) versus zearalenone concentration (ng/g). Draw bestfit line through points obtained. Read from standard curve approximate level of zearalenone in test samples. Assay test solutions at same time standard curve is prepared for test samples matrix (corn, wheat, or feed) (c) Repeat assay on test solution and record results (d) Average results of duplicate assays to determine approximate level of zearalenone in test sample [Note: 650 nm filter provides measure of blue color development. EIA reader equipped with this filter ignores red color. Positive results must be confirmed by AOAC Method 985.18 (see 49.9.02).] Reference: J. AOAC Int. 77, 1500(1994). Revised: March 1998 ... Chất phụ gia thực phẩm Đúng theo pháp luật của đất nước nơi sản phẩm được bán Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 20 Đồ án Phân tích thực phẩm Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 21 Đồ án Phân tích thực phẩm. .. Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện PHẦN 1 GIỚI THIỆU CÂY KHOAI MÌ VÀ Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 3 Đồ án Phân tích thực phẩm SẢN PHẨM BỘT KHOAI MÌ 1.1 Cây khoai mì 1.1.1 Cây khoai mì thuộc: Giới (Regnum): ... Chất lượng thực tế tổng qt Bột khoai mì thực phẩm phải an tồn và phù hợp để con người tiêu dùng Đề tài: Sản phẩm bột khoai mì Page 18 Đồ án Phân tích thực phẩm Bột khoai mì thực phẩm phải khơng có vị lạ, mùi và cơn trùng sống