1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Đề tài: Nghiên cứu enzyme

29 49 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 29
Dung lượng 583,04 KB

Nội dung

Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Mời các bạn cùng tham khảo.

LỜI MỞ ĐẦU Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác   của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút   quan tâm của nhiều nhà khoa học   các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được   những cơng dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về cơng nghệ enzyme đã được  tiến hành bởi nhiều tác giả  như  sử  dụng phủ  tạng của lò mổ  để  sản xuất pancrease,  pepsin, tripsin, sử  dụng mầm mạ  để  sản xuất amylase. Đã có những thử  nghiệm cơng   nghệ  như  sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme   bromelain từ vỏ dứa….  Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh,  đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể  do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme   trong các mơ, các điều kiện khơng bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa  của một số  enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số  enzyme trong huyết   tương, hồng cầu hoặc trong các mơ là rất quan trọng trong việc chẩn đốn bệnh. Enzyme  đã trở  thành các cơng cụ  thực tếquan trọng khơng những trong y học mà cả  trong cơng  nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm… Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có  triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong  phú (dứa, đu đủ,… ). Trong q trình chế  biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần  của quả dứa, phần còn lại là phụ  phẩm. Nếu   tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa  có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ơ nhiễm mơi   trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain   có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên  lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu:   Dứa       ăn     nhiệt   đới,   có   nguồn   gốc     Nam   Mỹ   (Brazil,   Argentina,   Paraguay), hiện   những vùng này vẫn có thể  tìm thấy nhiều  giống dứa hoang dại   Hiện nay trên thế  giới, cây dứa được trồng hầu hết  ở  các nước trừ    Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như  là: Hawaii,  Brazil, Philipines, Thailand…Ở  nước ta, dứa trồng từ  Bắc đến  Nam, diện tích trồng cả  nước khoảng 40.000 ha với sản lượng  khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh   trồng dứa nhiều   miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh   Hóa, Tun Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam…  Trên thế giới có khoảng 60­70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3   nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish ­ Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ  biến nhất trên thế  giới, chiếm khoảng  80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng.  Dứa thuộc nhóm này có quả  lớn nhất, mắt phẳng và nơng. Thịt quả  kém vàng, nhiều  nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen ­ Nhóm Queen còn gọi là dứa Hồng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa trồng   phổ  biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc,   các giống Queen Long An, Kiên Giang   các tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long (còn gọi là  khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả  tương đối nhỏ, mắt lồi. Thịt quả  vàng   đậm, giòn, hương thơm, vị  chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế  giới thường dùng để ăn tươi ­ Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng  ở  Thailand, Cuba… Quả  dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả  vàng  nhạt, có chỗ  trắng, vị  chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm này chịu  bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên khơng được phát triển 1.2 Enzyme: Trong cơ thể sống (các tế bào) ln ln xảy ra q trình trao đổi chất. Sự trao đổi   chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ khơng còn tồn tại. Q trình trao đổi của một chất là tập   hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho  các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất  định và đảm bảo cho các phản  ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ  nhịp nhàng trong cơ thể sống.  ENZYME = XÚC TÁC SINH HỌC Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc  tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơchất, làm tăng   đáng kể  tốc độ  các phản  ứng hóa học xảy ra trong mơi trường nước trong các điều kiện  nhiệt độ và pH thích hợp Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân  xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học  (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học khơng chỉ có vai trò quan trọng trong q trình sinh   trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực  khác như: cơng nghệ  chế  biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong cơng nghệ  gen   vào bảo vệ mơi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:  ­ Nguồn động vật.  ­ Nguồn thực vật.  ­ Nguồn vi sinh vật 1.2.1 Phân loại: Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để  thống nhất tên gọi   enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại: ­ Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hố khử ­  Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản  ứng chuyển vị một nhóm (gốc)  nào đó từ chất này sang chất khác ­  Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt  có sự tham gia của nước) ­  Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác q trình phân cắt một nhóm nào đó ra  khỏi hợp chất mà khơng có sự tham gia của nước ­  Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hố, chuyển dạng đồng   phân này sang dạng đồng phân khác ­  Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng  ATP và các chất tương tự 1.2.2 Tổng quan về protease: Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác q trình thủy phân liên kết  peptit ( ­CO­NH­)n trong phân tử  protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối cùng là axit  amin. Ngồi ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit   amin Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về  chức năng từ  mức độ  tế  bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi  khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật ( gan, dạ  dày…). So với   protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước  hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống   nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử  nên rất có thể  tách ra dưới dạng tinh  thể đồng nhất.  Cũng do là phức hệ  gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường   có tính  đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt  để  và đa dạng   Bromelain là  protein­enzyme có nhiều trong quả  dứa và có một ít trong quả  chuối, enzyme này được   phát hiện từ  giữa thế  kỉ  19 nhưng mới được nghiên cứu từ  giữa thế  kỷ  20.  Ở  nước ta   nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 ­1970 1.3 Enzyme Bromelain:  Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC­3.4.22.33 được thu nhận từ họ  bromeliaceae, đặc biệt là từ  thân và trái dứa.  Ở  mỗi bộ  phận khác nhau thì bromelain có   pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau Bromelain có trong tồn bộ  cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là  nhóm   endoprotease   có   khả  năng   phân  cắt    liên   kết   peptide   nội   phân  tử  protein   để  chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide Thành phần chủ  yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein   Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của bromelain thì thu   được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro 1.3.1 Cấu tạo hố học: Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như  papain,   ficin     chỗ         glycoprotein,     phân   tử   có   glycan   gồm     manose,   2  glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose.  Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –NH2 là  valine và  đầu carboxyl là  glycine; còn  đối với  bromelain quả, acid  amin   đầu –NH 2  là  alanine OH OH OH Fructose OH OH Maltose CH2OH CH2 OH OH OH OH Maltose Glucofamine CH2OH Maltose CH2 OH NHCONH3 OH Xylose C NHCOCH2 C H OH OH OH N NHCONH3 Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain 1.3.2 Cấu trúc khơng gian: Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp  xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: Bromelain       protease     tâm   hoạt   động   có   chứa   cysteine     hai   sợi  polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối ­ S – S ­. Phân tử có dạng hình cầu do có cách   sắp xếp phức tạp Trong phân tử  bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ  yếu trong   hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngồi ra, trong phân tử  còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc khơng gian của enzyme 1.3.3 Tính chất vật lí: Murachi     cộng    năm   1964    nghiên   cứu     tính   chất   vật   lý     enzyme   bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau: Bảng . Những tính chất vật lý của bromelain thân Tính chất Ký hiệu Số liệu Hằng số sa lắng S (s) 2.73 Hằng số khuếch tán D (cm2 / s) 7.77 x 10 ­7 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743 Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039 Tỷ số ma sát f / fo 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A1%cm ở 280nm 20.1 32.000 * Trọng lượng phân tử 32.100 ** 35.500 *** : Tính bằng phương pháp sa lắng ­ khuếch tán *   **  : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong : Tính bằng phương pháp Archibald  ***  1.3.4 Hoạt tính của bromelain: 1.3.4.a.i.1 Hoạt tính phân giải Bromelain   có     hoạt   tính:   peptidase,   amidase     esterase,   hoạt   tính   esterase   ở  bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung ­ Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain Bảng . Hoạt tính phân giải casein của bromelain Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg) Cơ chất thân 7.4 Casein ­ Bromelain  Bromelain  quả xanh Bromelain  quả chín 4.0 3.0 Đối với cơ  chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn  trong quả xanh và quả chín ­ Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain Bảng . Hoạt tính phân giải Benzoyl­L­Arginine amide (BAA) của bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg) Bromelain  thân BAA 3.7 Bromelain  quả xanh Bromelian  quả chín 9.1 7.2 Qua bảng trên ta thấy bromelain quả  xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn  bromelain thân và quả chín 1.3.4.a.i.2 Các   yếu   tố   ảnh   hưởng   đến   hoạt   tính  bromelain:  Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị   ảnh hưởng bởi các yếu  tố  như: cơ  chất, nồng độ  cơ  chất, nồng độ  enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số  nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết Các yếu tố  như  nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản  ứng xúc tác  của bromelain khơng  ổn định mà phụ  thuộc lẫn nhau và phụ  thuộc vào các yếu tố  khác  như: bản chất cơ  chất, nồng độ  cơ  chất, nồng độ  enzyme, sự  có mặt của các chất hoạt  hóa…  Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính   xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain khơng ổn định mà tuỳ thuộc   vào nhiệt độ, thời gian phản  ứng, bản chất và nồng độ  cơ  chất, độ  tinh  sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết   tủa là (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH  = 4.6 ­ 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất  ở  pH = 6.0 và pH  = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 ºC. Bromelain  có biên độ pH rộng (3 ­10), tốt nhất là  pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất  Ảnh hưởng bởi cơ  chất:  trên những loại cơ  chất khác nhau, bromelain có  hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của   bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ  chất là casein thì hoạt tính  của bromelain tương tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA   (Benzoyl­L­Arginine amide), BAEE (Benzoyl­L­Arginine ethyl ester) thì khả  năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain 10 2.1.a.5 Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm. Tại đây, vỏ  dứa được xay hoặc nghiền nát. Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này   ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ cặn và thu lấy dịch.  Sau đó, tạo tủa cho 1 phần dịch này bằng cồn 960 theo 3 tỷ  lệ  dịch mẫu: ancol là  1:3; 1:4; 1:5. Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ  từ  lượng cồn 96 0 đã được  làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ  5 0C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch   đệm phosphate 0.1 M pH 7. Lấy mẫu đi xác định hoạt tính bằng phương pháp Anson cải   tiến và định lượng enzyme bằng phương pháp Biuret Sau khi có kết quả định tính và định lượng, ta tủa tất cả dịch theo tỷ lệ cho  kết quả cao nhất và thực hiện các bước tương tự như trên.  Chạy sắc ký lọc gel enzyme thơ và thu được enzyme tinh khiết Kiểm tra kết quả lọc gel bằng phương pháp điện di 2.2 Phương pháp thí nghiệm: 2.2.a.1 Khảo   sát   hoạt   tính   enzyme   bromelain  (Xác định hoạt tính enzym Bromelain bằng phương  pháp Anson cải tiến): 2.2.1.a.i.1 Nguyên tắc:  Phương pháp này dựa trên sự  thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có   trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vơ hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị  thủy phân  bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản  ứng  thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ  thị  chuẩn của Tyrosin để  tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên 2.2.1.a.i.2 Dụng cụ và hóa chất:  Dụng cụ 15 ­ Ống nghiệm ­ Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml ­ Máy quang phổ ­ Becher 50ml, 250ml, 500ml ­ Bình tia  Hóa chất ­ Dung dịch Casein 1% ­ Dung dịch TCA 5% ­ Dung dịch NaOH 0,5N ­ Thuốc thử Folin  ­ Dung dịch HCl 0,2N ­ Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2N Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin : 2.2.1.a.i.3 Bảng . Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung  Ống nghiệm dịch   hóa  chất Dung  dịch  Tyrosin  chuẩn  (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng  Tyrosin  tương  ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0 Dung  dịch   HCl  0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung  dịch  NaOH  0,5N (ml) 10 10 10 10 10 3 3 10 Thuốc  thử   Folin  (ml) 16 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số  1 là  ống thử  khơng (TK), các  ống còn lại là  ống thí nghiệm (TN). Vẽ  đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK) 2.2.1.a.i.4 Phương pháp tiến hành: Lấy 6 ống nghiệm sạch, khơ, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử khơng Bảng . Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính 17 Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thử thật Dung   dịch   Casein   1%  (ml) Dung dịch TCA 5% (ml) Dung   dịch   enzym   mẫu  (ml) Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút 10 Dung dịch TCA 5% (ml) Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong Thử không 10 Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của  ống thử thật  và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử khơng Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau   10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn  suy ra được số µM Tyrosin 2.2.1.5 Tính kết quả: 2.2.1.a.i.5 Định nghĩa đơn vị  Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều  kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa  tan trong TCA, phản  ứng với thuốc thử Folin cho ta độ  hấp thu OD   bước sóng 660nm  tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn Hđ Protease  =  (UI/g)  Với:  Hđ Protease : hoạt độ enzym protease trên 1 đơn vị khối lượng (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử khơng (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)    t : thời gian thủy phân (phút)    m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)    L: độ pha lỗng enzym   µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn  18 2.2.a.2 Biuret: Định lương enzyme bằng phương pháp  Ngun tắc: 2.2.2.a.i.1 Dựa vào phản  ứng tạo màu giữa protein và Cu2+ trong mơi trường kiềm tạo phản  ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm. Cường độ  màu tỷ lệ thuận   với lượng Cu và số lượng liên kết peptide trong chuỗi polypeptide Hình . Phản ứng Biuret 2.2.2.a.i.2 Dụng cụ và hóa chất:  Dụng cụ ­ Ống nghiệm ­ Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml ­ Máy quang phổ ­ Becher 50ml, 250ml, 500ml ­ Bình tia  Hóa chất ­ Dung dịch albumin chuẩn 1% ­ Thuốc thử Biuret:   CuSO4  Tartrat Kilium và Natrium  Nước cất 2.2.2.a.i.3 ­ Chuẩn bị thuốc thử Biuret:  19 Tiến hành: Cân chính xác   CuSO4 : 1,5g Tartrat Kilium và Natrium: 6g Nước cất: 500ml Cho vào bình lắc cho tan hồn tồn và định mức đến 1000ml ­ Lập đồ thị chuẩn:  Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 7 và cho vào đó các chất như bảng sau: Bảng . Lập đường chuẩn Biuret Ống nghiệm Nồng   độ   protein   chuẩn  (mg/ml) Dung   dịch   protein   chuẩn  (ml) Thuốc thử Biuret (ml) 0 10 1 1 1 4 4 4 Lắc đều, để 20 phút. Đo OD ở bước sóng 540nm ­ Chuẩn bị mẫu đo Biuret: Bảng . Chuẩn bị mẫu đo Biuret Ống nghiệm Dung dịch mẫu Thuốc thử Biuret (ml) 1ml nước cất 1ml mẫu 1ml mẫu Lắc đều, để 20 phút. Đo OD ở bước sóng 540nm 2.2.2.a.i.4 Tính kết quả:  Lập đồ  thị  chuẩn của các  ống nghiệm từ  3­7 . Trị  số  mật độ  quang của các ống   nghiệm  từ 3­7 bằng mật độ quang của các ống nghiệm từ 2­6 đã đo ở trên trừ cho mật độ  quang trung bình của ống 1 và 2 ( Bước sóng 540 nm). Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến  thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn Tương tự, độ  hấp thu thật sự  của protein trong  ống nghiệm bằng trị  số  mật độ  quang của  ống nghiệm trừ  cho  ống đối chứng. Sau đó chiếu vào đường chuẩn suy ra  lượng protein có trong mẫu thí nghiệm 20 2.2.a.3 Phương pháp sắc kí lọc gel: 2.2.3.a.i.1 Ngun tắc: Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ  đầy dung mơi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân  tử khác nhau cò thể tách riêng được hay khơng là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử  có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, khơng thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo   dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các phân tử  có trọng lượng phân tử  (TLPT) nhỏ  hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ tồn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi   cũng theo dòng chảy đi ra khỏi cột nhưng sẽ  chậm trễ  hơn. Dòng chảy pha động khiến  các phân tử lớn khơng thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xun qua cột, ra  khỏi cột, trong khi phân tử  nhỏ  ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ  rỗng  của gel. Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký   gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử  nhỏ đi ra   khỏi cột sau 2.2.3.a.i.2 Tiến hành Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình  ống trụ  bằng thuỷ  tinh, gồm các bước   sau:  ­ Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện  ở dạng huyền phù trong  dung mơi phù hợp cho vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt   nhưng khi rót vẫn chảy vào cột thành dòng dễ  dàng. Cân bằng cột bằng  cách cho dung mơi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung mơi có thể  tích  bằng 2­3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một   lượng mẫu thử  vào đầu cột. mẫu thử  thường được chọn là dextran blue   2000, có màu xanh dương để  có thể  được quan sát bằng mắt thường sự di  chuyển của mẫu trong cột ­ Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải  được lọc bỏ những hợp chất còn ở  dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hồ tan   vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột.  ­ Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ  sử dụng kỹ thuật  dung mơi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung mơi hay hỗn hợp hai  dung mơi, khi bắt đầu cho tới khi kết thúc q trình giải ly chỉ sứ dụng một  21 loại dung mơi đó). Giải ly có thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi sử dụng   bơm đẩy từ đầu cột. hứng dung mơi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có  một thể tích nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm   dần 2.2.a.4 Phương   pháp   điện   di   SDS­   PAGE  (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide): 2.2.4.a.i.1 Nguyên tắc: Dựa vào sự  di chuyển cảu các phân tử  mang điện tích trong điện trường. Điện di  protein trên gel tiến hành xử  lý gel bằng SDS. Phân tử  protein có điện tích tự  do chứa   những nhóm acid và base. Nếu các phân tử  protein khơng được đạt ở  điểm đẳng điện thì   dưới  ảnh hưởng của điện trường ngồi, chúng di chuyển sang các cực. Các protein khác   nhau có trị  số  điện tích tự  do khác nhau. Vì thế, tốc độ  di chuyển của chúng trong điện   trường   những điều kiện nhất định về  pH, lực ion và nhiệt độ  cũng khác nhau. Do đó,   hỗn hợp các loại protein được tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn  riêng biệt 2.2.4.a.i.2 ­ Tiến hành: Chuẩn bị gel điện di:  Gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có  kết cấu chuyên dụng để tạo khuôn Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước, để  khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các  tấm thủy tinh lại theo hướng dẫn của hãng sản xuất và kẹp khuôn trên giá đỡ Pha gel điện di với thành phần như bảng dưới đây: Bảng . Cách pha gel điện di Mono solution 4X Running gel  buffer (pH8.8) H2O APS 10% TEMED 22 Running gel 2,5ml 1,875ml 3,125ml 25 4X Stacking gel  buffer (pH6.8) Stacking gel 0,325ml 0,625ml 1,525ml 12,5 TEMED có tác dụng làm đơng gel, là thành phần pha vào sau cùng. Sau đó nhẹ  nhàng trộn đều hỗn hợp gel vừa pha và đổ vào khn kính đã lắp sẵn Đổ gel chạy trước tới vạch dưới của khn kính. Thêm isopropanol lên trên lớp gel   chạy vừa đổ, isopropanol có tác dụng làm phẳng và hút bọt khí của lớp gel chạy. Đợi  khoảng 30 phút cho gel đơng Rửa sạch lớp isopropanol đã đổ vào gel bằng nước cất nhiều lần. Để khơ Đổ  gel gom tới mép trên của kính. Nhẹ  nhàng cắm lược vào để  tạo thành giếng   Gel đơng cần khoảng 15 phút Au khi gel gom đơng. Tháo bộ kính khỏi khn kính. Lắp bộ kính có gel vào khung  điện cực, đổ đệm điện di đầy bơ khung điện cực Chuẩn bị mẫu:  ­ Hút mẫu cần điện di 20vào tube 1,5ml có bổ sung 10 2X treatment buffer Đun sơi cách thủy trong 5 phút, để nguội ­ Điện di:  Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi bơ điện di. Bơm từng mẫu vào từng giếng với lương  là 20. Thang chuẩn là Protein Ladder với lượng 13­15 Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện  ổn định, thường là  100­200V trong 30­90 phút Sau khi vạch màu chỉ thị xuống gần đến đáy của gel, tắt điện và lấy gel ra ­ Nhuộm gel và rửa nhuộm:  Sau     lấy   gel   ra,   cho   gel   vào   hộp   chứa   dung   dịch   nhuộm   protein   (Staining   solution) Lắc nhẹ 10­ 30 phút cho Staining solution thấm vào gel Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution). Thay dung dịch rửa màu   mới khoảng 15 phút/ lần cho đến khi miếng gel có màu trog suốt và xuất hiện nhiều vạch  xanh lơ trên gel 23 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thí nghiệm 1: tủa bromelain bằng cồn 96o 3.1 Khối lượng kết tủa thu được sau khi tủa:    Bảng  Khối lượng kết tủa thu được ở 3 tỉ lệ khác nhau Tỉ lệ 1:3 0,5 KHỐI LƯỢNG (G) Tỉ lệ 1:4 0,49 Tỉ lệ 1:5 0,38 Kết quả thí nghiệm xác định hàm lượng Protein có trong mẫu được thể hiện qua bảng sau: Thí nghiệm được set blank bằng nước cất Bảng . Hàm lượng Protein có trong mẫu trước và sau khi tủa bằng cồn 96o ∆OD MẪU BAN  ĐẦU MẪU TỦA 0,284 ± 0,021 tỉ lệ 1:3 tỉ lệ 1:4 tỉ lệ 1:5 C (mg/mL) 6,184 ± 0,455 0,051 ± 0,051 0,041 ± 0,023 0,094 ± 0,001 1,112 ± 0,112 0,886 ± 0,511 2,050 ± 0,025 Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme có trong mẫu được thể hiện qua bảng sau: Thí nghiệm được set blank bằng nước cất Bảng . Hoạt tính enzyme có trong mẫu trước và sau khi tủa Mẫu ban  đầu Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 Tỉ lệ 1:5 ∆ODTT ∆ODTK ∆OD(TT­TK) µM 0,878 ± 0,088 0,453 ± 0,097 0,425 ± 0,017 0,304 ± 0,014 0,0486 0,041 ± 0,007 0,018 ± 0,001 0,171 ±  0,038 0,031 ± 0,040 0,028 ± 0,001 0,036 ± 0,001 0,011 ± 0,033 ­0,01 ± 0,001 0,136 ± 0,039 ­0,04 ± 0,028 ­0,057 ± 0,006 0,064 ± 0,032 ­ ­ 1,386 Tính tốn hoạt tính enzyme: Hoạt tính mẫu ban đầu =   = 0,0486 UI/g Trong đó: = 0,0304 V = 16 mL L = 200  t = 20 phút 25 HOẠT  TÍNH  (UI/g) m = 200 g v = 5 mL Hoạt tính mẫu tủa tỉ lệ 1:5 =   = 1,386 UI/g Trong đó: = 0,064 V = 16 mL L = 10 t = 20 phút m = 0,1 g v = 5 mL Bàn luận: Sau  khi  tủa    ba nồng  độ  khác  nhau,  trích  0,1  g kết  tủa  hồ  vào 10  mL  đệm   phosphate và xác định hàm lượng Protein và hoạt tính enzyme có trong tủa được thể hiện ở  bảng 2 và bảng 3.  Kết quả thử hoạt tính ở tỉ lệ 1:3 và tỉ lệ 1:4 ra kết quả âm, chứng tỏ enzyme đã bị  mất hoạt tính. Ngun nhân có thể là do bảo quản ở nhiệt độ khơng thích hợp nên enzyme   bị  mất hoạt tính. Để  có thể  so sánh đưa ra tỉ  lệ  tủa tối  ưu, nhóm tính tốn hàm lượng   protein có trong tủa như sau: Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 Tỉ lệ 1:5 Khối lượng tủa  Hàm lượng Protein (g) có trong 0,1 g tủa  (mg/ml) 0,5 1,112 0,49 0,886 0,38 2,050 Hàm lượng Protein có trong tổng khối lượng tủa  (mg/ml) 5,556 4,341 7,791  Từ  bảng kết quả  trên, tỉ  lệ  1:5 cho hàm lượng Protein cao nhất mặc dù có khối   lượng kết tủa thấp nhất, cho nên tỉ lệ 1:5 là tỉ lệ tủa tối ưu 3.2 Thí nghiệm 2: tinh sạch protein bằng phương  pháp lọc gel Kết quả xác định hàm lượng Protein sau khi lọc gel được thể hiện qua bảng sau: ỐNG 26 ∆OD 0,017 0,104 0,19 0,167 c(mg/mL) 0,362 2,261 4,139 3,637 0,374 0,002 ­0,013 ­0,037 8,157 0,034 ­0,293 ­0,817 Kết luận: Sau khi lọc gel, hàm lượng Protein chứa ở ống số 5 là cao nhất (8,157 mg/mL) 27 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Chọn tác nhân tủa là ancol etylic 960 ở các tỷ lệ tối ưu là 1:3; 1:4; 1:5.  Ở  tỷ  lệ  1:3, 1:4 thì khối lượng tủa là cao nhất, nhưng   tỷ  lệ  1:5 thì hàm lượng   protein (2,050 ± 0,025 mg/mL) và hoạt tính enzyme (1,386 UI/g) là cao nhất Khi tinh sạch enzyme thơ bằng phương pháp lọc gel, ở phân đoạn thứ 5, thu được  hàm lượng enzyme là lớn nhất (8,157mg/mL) 28 CHƯƠNG 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị  Trân Châu, Phan Tiến Hòa, Nguyễn ThịBảo, 1987. Thành phần và  một sốhoạt tính của chếphẩm Bromelain chồi ngọn Dứa tây ( Ananas comosusL –   Group Quee).Tập chí sinh học, trang 3 – 9 [2] Nguyễn Đức Lượng, 2004. Cơng nghệ  enzyme, nhà xuất bản ĐH Quốc Gia   TPHCM [3] Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Dương Thị  Diễm Trang, tận dụng   phế phẩm khóm cầu Đúc (Hậu Giang) cho q trình trích ly enzyme bromelain, tạp   chí khoa học trường đại học Cần Thơ [4] Lê Thanh Mai, 1997. Nghiên cứu về  Bromelain và con đường  ứng dụng của   chúng, luận văn phó tiến sĩ sinh học. Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên [5] Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình  Huy, Hóa Sinh học, nhà xuất bản giáo dục,   Hà Nội 29 ... protein enzyme có nhiều trong quả  dứa và có một ít trong quả  chuối, enzyme này được   phát hiện từ  giữa thế  kỉ  19 nhưng mới được nghiên cứu từ  giữa thế  kỷ  20.  Ở  nước ta   nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 ­1970... còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc khơng gian của enzyme 1.3.3 Tính chất vật lí: Murachi     cộng    năm   1964    nghiên   cứu     tính   chất   vật   lý     enzyme   bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:... Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:  ­ Nguồn động vật.  ­ Nguồn thực vật.  ­ Nguồn vi sinh vật 1.2.1 Phân loại: Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để  thống nhất tên gọi   enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:

Ngày đăng: 12/01/2020, 00:49

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w