Đề tài nghiên cứu enzyme

LỜI MỞ ĐẦU Hầu phản ứng hóa học thể sống cần phải có vai trò xúc tác enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm công dụng khác enzyme Nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có thử nghiệm công nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt enzyme bromelain từ vỏ dứa… Nghiên cứu enzyme có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, số bệnh, đặc biệt bệnh mang tính di truyền, thiếu hay hẳn số enzyme mô, điều kiện không bình thường xuất hoạt tính dư thừa số enzyme đặc hiệu Do xác định hoạt tính số enzyme huyết tương, hồng cầu mô quan trọng việc chẩn đoán bệnh Enzyme trở thành công cụ thực tếquan trọng y học mà công nghệ hóa học, chế biến thực phẩm… Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn nguồn nghiên liệu phong phú (dứa, đu đủ,… ) Trong trình chế biến dứa đóng hộp sử dụng phần dứa, phần lại phụ phẩm Nếu tận dụng nguồn phế phẩm vừa giảm thiểu chất hữu gây ô nhiễm môi trường vừa sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase phân hủy chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu: Dứa ăn nhiệt đới, có nguồn gốc Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), vùng tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại Hiện giới, dứa trồng hầu hết nước trừ Châu Âu Các nơi trồng nhiều là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng nước khoảng 40.000 với sản lượng khoảng 500.000 tấn, 90% khu vực phía Nam Các tỉnh trồng Hình Trái thơm dứa nhiều miền Nam Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam… Trên giới có khoảng 60-70 giống dứa chia thành nhóm, có nhóm trồng phổ biến nhóm Cayenne, nhóm Queen nhóm Spanish - Nhóm Cayenne nhóm dứa trồng phổ biến giới, chiếm khoảng 80% diện tích Ở nước ta trồng số nơi Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng Dứa thuộc nhóm có lớn nhất, mắt phẳng nông Thịt vàng, nhiều nước, thơm dứa Queen - Nhóm Queen gọi dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây Đây nhóm dứa trồng phổ biến nước ta nay, với giống dứa tây, giống dứa Na Hoa phía Bắc, giống Queen Long An, Kiên Giang tỉnh Đồng sông Cửu Long (còn gọi khóm thơm) Dứa thuộc nhóm có tương đối nhỏ, mắt lồi Thịt vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua lâu Nhóm có chất lượng cao nhất, giới thường dùng để ăn tươi - Nhóm Spanish gọi dứa Tây Ban Nha, dứa ta Nhóm trồng Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm lớn dứa Queen, mắt sâu Thịt vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua thơm nhiều nước dứa hoa Dứa nhóm chịu bóng râm, dập nát vận chuyển hàm lượng đường thấp nên không phát triển 1.2 Enzyme: Trong thể sống (các tế bào) luôn xảy trình trao đổi chất Sự trao đổi chất mà ngừng lại sống không tồn Quá trình trao đổi chất tập hợp nhiều phản ứng hóa học phức tạp Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống ENZYME = XÚC TÁC SINH HỌC Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu cơchất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy môi trường nước điều kiện nhiệt độ pH thích hợp Enzyme có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học Chúng chất xúc tác sinh học vai trò quan trọng trình sinh trưởng, phát triển sinh vật mà giữ vai trò quan trọng lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, kỹ thuật phân tích, công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm Hiện người ta khai thác enzyme từ ba nguồn bản: - Nguồn động vật Nguồn thực vật Nguồn vi sinh vật 1.2.1 Phân loại: Ngày ngày nhiều enzyme phát hiện, để thống tên gọi enzyme người ta phân tất enzyme làm loại: - Oxidoreductase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử Transferase: nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị nhóm (gốc) - từ chất sang chất khác Hydrolase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có tham gia nước) - Lyase: nhóm enzyme xúc tác trình phân cắt nhóm - khỏi hợp chất mà tham gia nước Izomerase: nhóm enzyme xúc tác đồng phân hoá, chuyển dạng đồng - phân sang dạng đồng phân khác Ligase: nhóm enzyme xúc tác tổng hợp chất hữu nhờ lượng ATP chất tương tự 1.2.2 Tổng quan protease: Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-)n phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối axit amin Ngoài ra, nhiều protease có khả thủy phân liên kết este vận chuyển axit amin Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) động vật ( gan, dày…) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Bromelain proteinenzyme có nhiều dứa có chuối, enzyme phát từ kỉ 19 nghiên cứu từ kỷ 20 Ở nước ta nghiên cứu bromelain năm 1968 -1970 1.3 Enzyme Bromelain: Bromelain nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt từ thân trái dứa Ở phận khác bromelain có pH tối ưu khác cấu tạo có khác Bromelain có toàn dứa, nhiều Bromelain nhóm endoprotease có khả phân cắt liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành đoạn nhỏ gọi peptide Thành phần chủ yếu bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein Khi chiết tách tinh phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl bromelain thu enzyme thủy phân protein hiệu in vitro 1.3.1 Cấu tạo hoá học: Bromelain thân protease khác với protease thực vật khác papain, ficin chỗ glycoprotein, phân tử có glycan gồm manose, glucosamine, xylose, fructose Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide bromelain thân có acid amin đầu –NH valine đầu carboxyl glycine; bromelain quả, acid amin đầu –NH2 alanine OH OH OH Fructose OH OH Maltose CH2 OH CH2 OH OH OH Glucofamine OH Maltose CH2 OH Maltose CH2 OH NHCONH3 OH OH Xylose C NHCOCH2 C H OH OH N NHCONH3 Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon bromelain 1.3.2 Cấu trúc không gian: Murachi Busan phân tích cấu trúc bậc bromelain nhận thấy cách xếp amino acid phân tử bromelain sau: - Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp - - Gly – Cys – Lys - Bromelain proteaseHình tâm trúc hoạtcủa động có chứa cysteine hai sợi Cấu Bromelain polypeptide liên kết với cầu nối - S – S - Phân tử có dạng hình cầu có cách xếp phức tạp Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu hoạt tính xúc tác phân tử có tất cầu nối disulfite Ngoài ra, phân tử có ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trì cấu trúc không gian enzyme 1.3.3 Tính chất vật lí: Murachi cộng năm 1964 nghiên cứu tính chất vật lý enzyme bromelain trích từ thân dứa thấy sau: Bảng Những tính chất vật lý bromelain thân Tính chất Ký hiệu Số liệu Hằng số sa lắng S (s) 2.73 Hằng số khuếch tán D (cm2 / s) 7.77 x 10 -7 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743 Độ nhớt bên [ I ] (dl/g) 0.039 Tỷ số ma sát f / fo 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A1%cm 280nm 20.1 32.000 * Trọng lượng phân tử 32.100 ** 35.500 *** * : Tính phương pháp sa lắng - khuếch tán ** *** : Tính từ số sa lắng độ nhớt bên : Tính phương pháp Archibald 1.3.4 Hoạt tính bromelain: 1.3.4.1 Hoạt tính phân giải Bromelain có hoạt tính: peptidase, amidase esterase, hoạt tính esterase bromelain papain đu đủ ficin thuộc họ Sung - Khả phân giải chất tự nhiên bromelain Bảng Hoạt tính phân giải casein bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg) Bromelain Bromelain Bromelain thân Casein xanh 7.4 chín 4.0 3.0 - Đối với chất casein, hoạt tính phân giải bromelain thân cao - xanh chín Khả phân giải chất nhân tạo bromelain Bảng Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg) Bromelain thân BAA Bromelain xanh 3.7 Bromelian chín 9.1 7.2 Qua bảng ta thấy bromelain xanh có hoạt tính phân giải BAA cao bromelain thân chín 1.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain: Giống loại chất sinh học khác, bromelain bị ảnh hưởng yếu tố như: chất, nồng độ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động phản ứng xúc tác bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn phụ thuộc vào yếu tố khác như: chất chất, nồng độ chất, nồng độ enzyme, có mặt chất hoạt hóa…  Ảnh hưởng pH: pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme, pH tối thích bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, chất nồng độ chất, độ tinh enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, dùng tác nhân kết tủa (NH4)2SO4 enzyme có hoạt tính cao pH = 4.8, ổn định pH = 4.6 5.4 Bromelain tinh phần có hoạt tính cao pH = 6.0 pH = 8.0, ổn định pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 ºC Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt pH = – tuỳ thuộc vào chất  Ảnh hưởng chất: loại chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác Nếu chất hemoglobin khả phân giải bromelain mạnh papain gấp lần, chất casein hoạt tính bromelain tương tự papain Đối với chất tổng hợp BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) khả thuỷ giải bromelain yếu papain  Ảnh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: thời gian tác dụng dài nhiệt độ nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, nồng độ chất, dạng tồn enzyme Ví dụ: Ở dịch chiết dứa (pH = 3.5) tăng nhiệt độ lên đến 60ºC bromelain hoạt tính tăng cao bromelain hoạt tính Ở 5ºC, pH = - 10 enzyme giữ hoạt tính tối đa casein 24h Ở 55ºC, pH = 6.1 enzyme 50% hoạt tính vòng 20 phút  Ảnh hưởng ion kim loại: ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme chúng gắn vào trung tâm hoạt động enzyme Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ muối 10 2.1.4 Sơ đồ khối: Vỏ dứa Nghiền Lọc - 5000v/phút - 10 phút Ly tâm Thu dịch -Cồn 96o - tỷ lệ 1:3; 1:4; 1:5 Tủa Ly tâm - 5000v/ phút - 20 phút Xác định hoạt tính định lượng enzyme Tủa mẫu theo tỷ lệ có hàm lương cao Ly tâm Xác định hoạt tính định lượng enzyme Chạy sắc kýlọc gel Enzyme Hình Sơ đồ quy trình 12 2.1.5 Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau thu nhận từ sở đưa đươc phòng thí nghiệm Tại đây, vỏ dứa xay nghiền nát Sau đó, đem lọc thu dịch lọc mang dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Sau ly tâm loại bỏ cặn thu lấy dịch Sau đó, tạo tủa cho phần dịch cồn 96 theo tỷ lệ dịch mẫu: ancol 1:3; 1:4; 1:5 Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác Cho từ từ lượng cồn 96 làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme Khuấy Để tủ lạnh 40 phút nhiệt độ 0C Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút 20 phút Thu tủa Hòa 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH Lấy mẫu xác định hoạt tính phương pháp Anson cải tiến định lượng enzyme phương pháp Biuret Sau có kết định tính định lượng, ta tủa tất dịch theo tỷ lệ cho kết cao thực bước tương tự Chạy sắc ký lọc gel enzyme thô thu enzyme tinh khiết Kiểm tra kết lọc gel phương pháp điện di 2.2 Phương pháp thí nghiệm: 2.2.1 Khảo sát hoạt tính enzyme bromelain (Xác định hoạt tính enzym Bromelain phương pháp Anson cải tiến): 2.2.1.1 Nguyên tắc: Phương pháp dựa thủy phân protein casein enzym Bromelin có dịch nghiên cứu, tiếp làm vô hoạt enzym kết tủa protein chưa bị thủy phân dung dịch acid trichloracetic Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosin để tính lượng sản phẩm enzym xúc tác tạo nên 2.2.1.2 Dụng cụ hóa chất:  Dụng cụ - Ống nghiệm 13 - Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Máy quang phổ Becher 50ml, 250ml, 500ml Bình tia Hóa chất  - Dung dịch Casein 1% Dung dịch TCA 5% Dung dịch NaOH 0,5N Thuốc thử Folin Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn mM/l dung dịch HCl 0,2N 2.2.1.3 Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin : Bảng Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Ống số ống thử không (TK), ống lại ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin (µM) ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK) 2.2.1.4 Phương pháp tiến hành: Lấy ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm ống thử thật, ống thử không Bảng Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật Dung dịch Casein 1% (ml) Dung dịch TCA 5% (ml) Dung dịch enzym mẫu (ml) Lắc giữ 35,5oC 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch 14 Thử không 10 Lấy ống nghiệm khác, cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không Tiếp tục thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Tính ΔOD = OD TT – ODTK, sau dựa vào đồ thị chuẩn suy số µM Tyrosin 2.2.1.5 2.2.1.5 Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzym tối thiểu điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin đường chuẩn Hđ Protease = (UI/g) Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease đơn vị khối lượng (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin v (ml) suy từ đường chuẩn 2.2.2 Định lương enzyme phương pháp Biuret: 2.2.2.1 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu protein Cu 2+ môi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại bước sóng 540nm Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng Cu số lượng liên kết peptide chuỗi polypeptide 15 Hình Phản ứng Biuret 2.2.2.2 Dụng cụ hóa chất:  Dụng cụ - Ống nghiệm - Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml - Máy quang phổ - Becher 50ml, 250ml, 500ml - Bình tia  Hóa chất - Dung dịch albumin chuẩn 1% - Thuốc thử Biuret:  CuSO4  Tartrat Kilium Natrium  Nước cất 16 2.2.2.3 Tiến hành: - Chuẩn bị thuốc thử Biuret: Cân xác CuSO4 : 1,5g Tartrat Kilium Natrium: 6g Nước cất: 500ml Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn định mức đến 1000ml - Lập đồ thị chuẩn: Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất bảng sau: Bảng Lập đường chuẩn Biuret Ống nghiệm Nồng độ protein chuẩn (mg/ml) Dung dịch protein chuẩn (ml) Thuốc thử Biuret (ml) 0 10 1 1 1 4 4 4 Lắc đều, để 20 phút Đo OD bước sóng 540nm - Chuẩn bị mẫu đo Biuret: Bảng Chuẩn bị mẫu đo Biuret Ống nghiệm Dung dịch mẫu Thuốc thử Biuret (ml) 1ml nước cất 1ml mẫu 1ml mẫu Lắc đều, để 20 phút Đo OD bước sóng 540nm 2.2.2.4 Tính kết quả: Lập đồ thị chuẩn ống nghiệm từ 3-7 Trị số mật độ quang ống nghiệm từ 3-7 mật độ quang ống nghiệm từ 2-6 đo trừ cho mật độ quang trung bình ống ( Bước sóng 540 nm) Sau lập đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn 17 Tương tự, độ hấp thu thật protein ống nghiệm trị số mật độ quang ống nghiệm trừ cho ống đối chứng Sau chiếu vào đường chuẩn suy lượng protein có mẫu thí nghiệm 2.2.3 Phương pháp sắc kí lọc gel: 2.2.3.1 Nguyên tắc: Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng phủ đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác cò thể tách riêng hay không tuỳ vào kích thước lỗ rỗng Các phân tử có kích thước lớn lỗ rỗng, chui lọt vào bên lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy pha động khỏi cột phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ kích thước lỗ rỗng, toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối theo dòng chảy khỏi cột chậm trễ Dòng chảy pha động khiến phân tử lớn chui vào lỗ rỗng mạng gel, nhanh chóng xuyên qua cột, khỏi cột, phân tử nhỏ khỏi cột lâu chui vào khỏi lỗ rỗng gel Như vậy, thành phần khác hỗn hợp mẫu ngang qua cột sắc ký gel, khỏi cột theo trình tự TLPT lớn khỏi cột trước, phân tử nhỏ khỏi cột sau 2.2.3.2 Tiến hành Sắc ký gel phải thực cột hình ống trụ thuỷ tinh, gồm bước sau: - Nhồi gel vào cột: hạt gel trương nở diện dạng huyền phù dung môi phù hợp cho vào cột Huyền phù chỉnh cho thật sệt rót chảy vào cột thành dòng dễ dàng Cân cột cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi tích 2-3 lần thể tích cột Kiểm tra chặt chẽ cột cách cho lượng mẫu thử vào đầu cột mẫu thử thường chọn dextran blue 2000, có màu xanh dương để quan sát mắt thường di chuyển mẫu - cột Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải lọc bỏ hợp chất dạng rắn, cặn Dung dịch mẫu hoà tan vào dung - dịch đệm, đặt lên đầu cột giống sắc ký cột Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly đơn giản, sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa sử dụng loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, bắt đầu kết thúc trình giải ly sứ dụng loại 18 dung môi đó) Giải ly trọng lực tốt sử dụng bơm đẩy từ đầu cột hứng dung môi giải ly lọ nhỏ, lọ có thể tích định Các chất tan khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần 2.2.4 Phương pháp điện di SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide): 2.2.4.1 Nguyên tắc: Dựa vào di chuyển cảu phân tử mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngoài, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do đó, hỗn hợp loại protein tách thành số vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt 2.2.4.2 Tiến hành: - Chuẩn bị gel điện di: Gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để tạo khuôn Rửa thủy tinh nước, để khô lau lại ethanol Ráp thủy tinh lại theo hướng dẫn hãng sản xuất kẹp khuôn giá đỡ Pha gel điện di với thành phần bảng đây: Bảng Cách pha gel điện di Mono solution 4X Running gel buffer (pH8.8) H2O APS 10% TEMED Running gel 2,5ml 1,875ml Stacking gel 0,325ml 4X Stacking gel buffer (pH6.8) 3,125ml µl 25 µl 0,625ml 1,525ml µl 12,5 µl 19 TEMED có tác dụng làm đông gel, thành phần pha vào sau Sau nhẹ nhàng trộn hỗn hợp gel vừa pha đổ vào khuôn kính lắp sẵn Đổ gel chạy trước tới vạch khuôn kính Thêm isopropanol lên lớp gel chạy vừa đổ, isopropanol có tác dụng làm phẳng hút bọt khí lớp gel chạy Đợi khoảng 30 phút cho gel đông Rửa lớp isopropanol đổ vào gel nước cất nhiều lần Để khô Đổ gel gom tới mép kính Nhẹ nhàng cắm lược vào để tạo thành giếng Gel đông cần khoảng 15 phút Au gel gom đông Tháo kính khỏi khuôn kính Lắp kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy bô khung điện cực - Chuẩn bị mẫu: Hút mẫu cần điện di 20 µl vào tube 1,5ml có bổ sung 10 µl 2X treatment buffer Đun sôi cách thủy phút, để nguội - Điện di: Nhẹ nhàng lấy lược khỏi bô điện di Bơm mẫu vào giếng với lương 20 µl Thang chuẩn Protein Ladder với lượng 13-15 µl Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, thường 100200V 30-90 phút Sau vạch màu thị xuống gần đến đáy gel, tắt điện lấy gel - Nhuộm gel rửa nhuộm: Sau lấy gel ra, cho gel vào hộp chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution) Lắc nhẹ 10- 30 phút cho Staining solution thấm vào gel Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution) Thay dung dịch rửa màu khoảng 15 phút/ lần miếng gel có màu trog suốt xuất nhiều vạch xanh lơ gel 20 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thí nghiệm 1: tủa bromelain cồn 96o 3.1 Khối lượng kết tủa thu sau tủa: Bảng Khối lượng kết tủa thu tỉ lệ khác TỈ LỆ 1:3 TỈ LỆ 1:4 TỈ LỆ 1:5 0,5 0,49 0,38 KHỐI LƯỢNG (G) Kết thí nghiệm xác định hàm lượng Protein có mẫu thể qua bảng sau: Thí nghiệm set blank nước cất Bảng 10 Hàm lượng Protein có mẫu trước sau tủa cồn 96o MẪU BAN ĐẦU tỉ lệ 1:3 MẪU tỉ lệ 1:4 TỦA tỉ lệ 1:5 ∆OD 0,284 ± 0,021 0,051 ± 0,051 0,041 ± 0,023 0,094 ± 0,001 C (MG/ML) 6,184 ± 0,455 1,112 ± 0,112 0,886 ± 0,511 2,050 ± 0,025 Kết thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme có mẫu thể qua bảng sau: Thí nghiệm set blank nước cất Bảng 11 Hoạt tính enzyme có mẫu trước sau tủa Mẫu ban đầu Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 Tỉ lệ 1:5 ∆ODTT ∆ODTK ∆OD(TT-TK) µM HOẠT TÍNH (UI/g) 0,878 ± 0,088 0,453 ± 0,097 0,425 ± 0,017 0,304 ± 0,014 0,0486 0,041 ± 0,007 0,018 ± 0,001 0,171 ± 0,038 0,031 ± 0,040 0,028 ± 0,001 0,036 ± 0,001 0,011 ± 0,033 -0,01 ± 0,001 0,136 ± 0,039 -0,04 ± 0,028 -0,057 ± 0,006 0,064 ± 0,032 1,386 Tính toán hoạt tính enzyme: Hoạt tính mẫu ban đầu = = 0,0486 UI/g 22 Trong đó: = 0,0304 V = 16 mL L = 200 t = 20 phút m = 200 g v = mL Hoạt tính mẫu tủa tỉ lệ 1:5 = = 1,386 UI/g Trong đó: = 0,064 V = 16 mL L = 10 t = 20 phút m = 0,1 g v = mL Bàn luận: Sau tủa ba nồng độ khác nhau, trích 0,1 g kết tủa hoà vào 10 mL đệm phosphate xác định hàm lượng Protein hoạt tính enzyme có tủa thể bảng bảng Kết thử hoạt tính tỉ lệ 1:3 tỉ lệ 1:4 kết âm, chứng tỏ enzyme bị hoạt tính Nguyên nhân bảo quản nhiệt độ không thích hợp nên enzyme bị hoạt tính Để so sánh đưa tỉ lệ tủa tối ưu, nhóm tính toán hàm lượng protein có tủa sau: Khối lượng tủa (g) Hàm lượng Protein 23 Hàm lượng Protein có tổng khối lượng tủa Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 Tỉ lệ 1:5 có 0,1 g tủa (mg/ml) 1,112 0,886 2,050 0,5 0,49 0,38 (mg/ml) 5,556 4,341 7,791 Từ bảng kết trên, tỉ lệ 1:5 cho hàm lượng Protein cao có khối lượng kết tủa thấp nhất, tỉ lệ 1:5 tỉ lệ tủa tối ưu 3.2 Thí nghiệm 2: tinh protein phương pháp lọc gel Kết xác định hàm lượng Protein sau lọc gel thể qua bảng sau: ỐNG ∆OD C(MG/ML) 0,017 0,362 0,104 2,261 0,19 4,139 0,167 3,637 0,374 8,157 0,002 0,034 -0,013 -0,293 -0,037 -0,817 Kết luận: Sau lọc gel, hàm lượng Protein chứa ống số cao (8,157 mg/mL) 24 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Chọn tác nhân tủa ancol etylic 960 tỷ lệ tối ưu 1:3; 1:4; 1:5 Ở tỷ lệ 1:3, 1:4 khối lượng tủa cao nhất, tỷ lệ 1:5 hàm lượng protein (2,050 ± 0,025 mg/mL) hoạt tính enzyme (1,386 UI/g) cao Khi tinh enzyme thô phương pháp lọc gel, phân đoạn thứ 5, thu hàm lượng enzyme lớn (8,157mg/mL) 25 CHƯƠNG 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tiến Hòa, Nguyễn ThịBảo, 1987 Thành phần sốhoạt tính chếphẩm Bromelain chồi Dứa tây ( Ananas comosusL – Group Quee).Tập chí sinh học, trang – [2] Nguyễn Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzyme, nhà xuất ĐH Quốc Gia TPHCM [3] Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Dương Thị Diễm Trang, tận dụng phế phẩm khóm cầu Đúc (Hậu Giang) cho trình trích ly enzyme bromelain, tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ [4] Lê Thanh Mai, 1997 Nghiên cứu Bromelain đường ứng dụng chúng, luận văn phó tiến sĩ sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên [5] Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huy, Hóa Sinh học, nhà xuất giáo dục, Hà Nội 26 ... phân triệt để đa dạng Bromelain proteinenzyme có nhiều dứa có chuối, enzyme phát từ kỉ 19 nghiên cứu từ kỷ 20 Ở nước ta nghiên cứu bromelain năm 1968 -1970 1.3 Enzyme Bromelain: Bromelain nhóm protease... ta khai thác enzyme từ ba nguồn bản: - Nguồn động vật Nguồn thực vật Nguồn vi sinh vật 1.2.1 Phân loại: Ngày ngày nhiều enzyme phát hiện, để thống tên gọi enzyme người ta phân tất enzyme làm loại:... tử có ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trì cấu trúc không gian enzyme 1.3.3 Tính chất vật lí: Murachi cộng năm 1964 nghiên cứu tính chất vật lý enzyme bromelain trích từ thân dứa thấy sau: Bảng Những