Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 trình bày nội dung với kết cấu 4 chương: Tổng quan về đề tài nghiên cứu; Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu; Kết quả nghiên cứu; Kết luận và kiến nghị,... Mời các bạn cùng tham khảo.

LỜI CẢM ƠN Để  hồn thành khóa luận này, tơi xin chân thành cảm  ơn Ban lãnh   đạo Viện Cơng nghệ  sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện  thuận lợi để tơi thực tập tại Viện. Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cơ   giáo trong Viện Cơng nghệ  sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt   kiến thức cho tơi trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức  được tiếp thu trong q trình học khơng chỉ là nền tảng cho q trình nghiên   cứu đề tài tốt nghiệp mà còn là hành trang q báu để tơi bước vào đời một  cách vững chắc và tự tin Tơi xin được bày tỏ  lòng biết  ơn sâu sắc đến TS. Vũ Kim Dung –  giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn  tơi trong suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin kính chúc các thầy,  cơ giáo trong Viện Cơng nghệ  sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp ln dồi dào sức khỏe, đạt  được nhiều thành cơng trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu  và giảng dạy Tơi xin chân thành cảm ơn!   Giáo viên hướng dẫn     TS. Vũ Kim Dung         Sinh viên thực hiện          Phạm Nhật Thành MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme   pectinase   bao   gồm   nhiều   loại   enzyme   khácnhaunhư  polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tử  pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện   trong các dịch chiết trái cây như  cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt  phải kể  đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm  1840 trên đối tượng cà rốt Với vai trò quan trọng, pectinase được sử  dụng rộng rãi, đem lại lợi   ích khá lớn trong cơng nghiệp chế  biến thực phẩm và cơng nghiệp nhẹ.  Trước đây nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày  nay, người ta đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú,   đa dạng và mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là  các enzyme này được dùng khơng giới hạn trong thực phẩm vì khơng  ảnh  hưởng đến sức khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ ni cấy, sinh trưởng  và phát triển nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh v ật   là lựa chọn hàng đầu của các nhà sản suất cơng nghiệp với mong muốn  giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase   quy mơ cơng nghiệp được thực hiện chủ yếu từ  Aspergillus niger(Yogesh,  2009) Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích  hợp sinh tổng hợp pectinase từ  Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên  cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố mơi trường lên men nhằm tăng hiệu  suất q trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ  đó phục vụ  nhu  cầu sản xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành cơng nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase 1.1.1. Cơ chất pectin Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid   galacturonic bằng liên kết  ­1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà  pectin có khối lượng phân tử 80.000  200.000 Da Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri,  glycerine nóng Các pectin tự  nhiên định vị  trong thành phần của  tế  bào có thể  liên  kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để  tạo thành các protopectin  khơng tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin khơng tan trong tế  bào  thành các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong mơi trường  acid, vì vậy các pectin tan này khơng đồng dạng vớinhau Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: ­ Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự  nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester  hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ  tạo gel đặc trong dung  dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ  65%. Enzyme pectinase tác  động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử  khác nhau và cấu trúc  hóa học khơng đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ  bản của pectin là   ­D­ galacturonan hay  ­D­galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị  D­galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu   ­1,4). Mặt khác, mức độ  oxy hóa trong các phân tử  polymer này cũng khác nhau, trong đó một số  nhất định các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một  số  trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự  ester hóa giữa   các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl ­ Pectin   acid:  là  polygalacturonic acid  có  một  phần  nhỏ  các  nhóm   carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid.  Pectic acid là polygalacturonic acid đã hồn tồn giải phóng khỏi một đơn vị  galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid ­ Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, khơng tan trong nước và có  cấu tạo hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân  tử  cellulose và các ion Ca2+, Mg2+  các gốc phosphoric acid, acetic acid và  đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòa  tan 1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase 1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự  phân hủy của các polymer  pectin     sản   phẩm       trình       acid   galacturonic,   galactose,  arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được  ứng dụng rộng rãi trong  cơng nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự  nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai   trò hết sức quan trọng trong q trình bảo quản trái cây và rau quả Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin 1.1.2.2. Phân loại Enzyme pectinase có thể  phân loại theo cơ  chế  tác dụng của chúng  như bảng 1.1 ­ Pectinesterase (PE): xúc tác sự  thủy phân của các nhóm methyl  ester   Enzyme   thường     cơng   vào     nhóm   ester   methyl     đơn   vị  galaturonate nằm kề đơn vị khơng bị ester hố, phân cắt các nhóm methoxy   (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc  acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có  giá trị  pH tối  ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hố bởi các   ion Ca2+ và Mg2+ Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase STT Enzym (tên  gọi theo hệ thống) Enzym(t ên thường  gọi) Pectin + H2O = n metanol +  pectic acid Thủy phân liên kết  ­1,4­ Endopoly  D­galacturonid trong  galacturonase  galacturonid không theo  (endo­PG) một trật tự nào Thủy phân liên kết  ­1,4­ Exopoly  D­galacturonid trong pectat,  galacturonase  trong galacturonic với sự  (exo­PG) đứt mạch của acid  galacturonic Thủy phân liên kết  ­1,4­ Endopolymetil­ D­galacturonid trong pectin  galacturonase  không theo một trật tự nhất  (Endo­PMG) định Thủy phân liên kết  ­1,4­ D­galacturonid trong pectat  Exo­pectatliase  với sự tạo thành  ­4,5  (exo­PKTE) aciddegalacturonic không  theo một trật tự nhất định Endopectatlias Thủy phân liên kết  ­1,4­ e (PETE) D­galacturonid trong pectat,  Pectin­pectinhydrolase pectinesterase Poly­ ­1,4  galacturonid­glycano  hydrolase­PG Poly­ ­1,4­D­ galacturonidgalacturo n­hydrolase Poly­ ­1,4­D­ galacturonidmetilester ­glycanohydrolase Poly­ ­1,4­D­ galacturonid  digalacturonoliase Poly­ ­1,4­D­ galacturonid  Phản ứng xúc tác glicanoliase Poly­ ­1,4­D­ galacturonid  metylester  glicanoliase ­ Endopectinlias e (Endo­PTE) trong galacturonic với sự  tạo thành nối đôi không  theo một trật tự nhất định Thủy phân liên kết  ­1,4­ D­galacturonid trong pectin  với sự tạo thành nối đôi  không theo một trật tự nhất  định Polygalacturonase   (PG):  còn   có   tên   gọi   khác     poly   1,4­  galacturoniglucanohydrolase,   xúc   tác     phân   cắt     mối   liên   kết   ­1,4­ glycoside. Các exo­PG (exo­poly   ­1,4­D­galacturonide) galacturonohydrolase,  phân cắt từ  đầu không khử, và endo­PG (endo­ poly   ­1,4­D­galacturonide)  glycanohydrolase     công   ngẫu   nhiên   vào     mạch     chất.  Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có  tính đặc hiệu cao đối với cơ chất ­ Pectate lyase (PEL):  xúc tác sự phân cắt các đơn vị  galacturonate  khơng   khơng   bị   ester   hóa   Cả   hai   enzyme   exo­PEL   (exo­poly   (1,4­ ­D­ galacturonide)lyase)   và  endo­PEL  (endo­poly  (1,4­ ­D­galacturonic)   lyase)  đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ  chất thích  hợp cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH  tối đa nằm trong khoảng từ 8,0­11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate  lyase khơng được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có   vi khuẩn và nấm.  Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong q   trình gây bệnh   thực vật, gây ra sự  phân hủy mơ của thành tế  bào, làm  mềm và làm mục mơ thực vật Ngồi ra còn có: ­ Pectin­transeliminase (poly 1,4­ ­galaturonid­methylesteglucanolise)  là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid 2.3.5.5. Kết tủa enzyme bằng ethanol Dịch enzyme sau khi ly tâm được sổ  sung ethanol lạnh (0oC) theo tỷ  lệ  1:3, để dịch  ổn định 2 tiếng  ở 0o – 4oC, sau đó ly tâm 10.000 vòng/ phút  trong 5 phút   4oC. Hòa tan kết tủa trong đệm pH 4,5 và xác định hoạt độ  Pectinase 2.3.5.6. Định lượng đường khử bằng DNS Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller G.L (1959) ­  Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ  sở  phản  ứng tạo màu giữa   đường khử  với thuốc thử  acid dinitro salisilic. Cường  độ  màu của phản  ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết   được mật độ quang của dịch đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn  monogalacturonan suy ra hàm lượng đường khử của dịch nghiên cứu         ­   Cách   tiến   hành:   Lập   đường   chuẩn:   pha     mẫu   đường   monogalacturonan có nồng độ  xác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1  ml thuốc thử  DNS trong thời gian 10 phút. Kết quả  được đem đo mật độ  quang ở bước sóng 575nm. Từ đó lập ra được đồ thị biểu diễn mối quan hệ  giữa hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD    Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonan được biểu diễn trong   đồ thị dưới đây: Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan Từ đồ thị trên, có thể tính được nồng độ đường khử trong mẫu từ giá  trị mật độ quang theo phương trình sau: x =  (mg/ml) Trongđó:   x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD) 2.3.5.7. Xác định hoạt độ Pectinase Hoạt   độ   Pectinase     xác   định   với     chất   pectin   Phản   ứng   enzyme được thực hiện với 180 µl dung dịch pectin 1% (w/v) và 20 µl dung  dịch enzyme (được pha lỗng tới nồng độ thích hợp), ở 50 oC trong 10 phút.  Dừng phản  ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sơi trong 10 phút. Tiếp   đến, li tâm hỗn dịch phản  ứng   10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho loại   cặn nếu có). Đo độ  hấp thụ    bước sóng 575 nm. Dựa vào đồ  thị  đường  chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme.  Một đơn vị  hoạt độ  Pectinase là lượng enzyme cần thiết để  xúc tác  chuyển hóa pectin tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút  ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme    Hoạt độ pectinase được xác định bằng cơng thức:                   H =   (U/ml)       Trong đó:    X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml)     f: hệ số pha lỗng     1000: hệ số quy đổi     600: khối lượng phân tử pectin t: thời gian thủy phân (10 phút) 2.3.5.8.  Khảo sát đặc tính của Pectinase Nhiệt độ  tối  ưu của enzyme được tiến hành theo phương pháp xác  định hoạt độ Pectinase ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 – 70oC.  Để  khảo sát độ  bền nhiệt, enzyme được  ủ  trong dung dịch đệm citrate   photphat 0,1M pH 4,5  ở cac nhiêt đô khac nhau (trong khoang t ́ ̣ ̣ ́ ̉ ừ 30 ­ 70 oC).  Sau nhưng khoang th ̃ ̉ ơi gian 1 – 7 gi ̀ ờ, lây mâu xac đinh hoat đô  ́ ̃ ́ ̣ ̣ ̣ Pectinase  con lai.  ̀ ̣ Anh h ̉ ưởng cua pH đên hoat tinh enzyme đ ̉ ́ ̣ ́ ược xac đinh  ́ ̣ ở nhiêt đô tôi ̣ ̣ ́  ưu cua enzyme v ̉ ơi c ́  chât đ ́ ược pha trong dung dich đêm citrate photphat ̣ ̣   0,1M co cac gia tri pH khac nhau năm trong khoang t ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̉ ừ pH 3,0 đên 7,0. Đê ́ ̉  khao sat đô bên pH, enzyme đ ̉ ́ ̣ ̀ ược pha loang va u  ̃ ̀ ̉ ở 40 oC vơi dung dich đêm ́ ̣ ̣   trên co cac gia tri pH khac nhau, sau nh ́ ́ ́ ̣ ́ ưng khoang th ̃ ̉ ơi gian 1 – 6 gi ̀ ờ, lây ́  mâu xac đinh hoat đô ̃ ́ ̣ ̣ ̣  Pectinase  con lai (v ̀ ̣ ơi c ́  chât đ ́ ược pha trong dung  dich đêm pH 4,5).  ̣ ̣ Anh h ̉ ưởng cua ion đên hoat tinh enzyme đ ̉ ́ ̣ ́ ược nghiên cưu băng cach u ́ ̀ ́ ̉  2+ dung dich enzyme v ̣ ơi cac ion kim loai Ca ́ ́ ̣ , Fe2+, Mn2+  (nông đô cuôi 10 ̀ ̣ ́   mM) trong đêm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5)  ̣ ở 50 oC trong 10 phut, sau đo ́ ́  xac đinh hoat đô  ́ ̣ ̣ ̣ Pectinase con lai va so sanh v ̀ ̣ ̀ ́ ơi mâu không bô sung ion kim ́ ̃ ̉   loai (đ ̣ ối chưng) ́ 2.3.5.9.  Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp.Các kết quả nghiên cứu  là trung bình của 3 lần lặp lại CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2 A.niger  CF2 sau 72 giờ  hoạt hóa trong mơi trường Czapeck có hình  thái hệ sợi và bào tử như hình 3.1. Bào tử hình tròn, màu nâu đậm, mật độ  hệ sợi trung bình D=2­3cm có màu trắng đục, dạng hình tròn Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày ni cấy trong tủ ấm ở 30oC 3.2    Khảo   sát     yếu   tố   ảnh   hưởng   đến   khả     sinh   tổng   hợp  pectinase 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin Pectin  đóng   vai   trò       chất   cảm   ứng   cho     trình   tổng   hợp   pectinase. Với phương pháp lên men rắn, lượng pectin sử dụng được khảo  sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày ni, hoạt độ  pectinase  cao  nhất đạt 2,231 U/g ở hàm lượng pectin 12% (w/w)  (hình 3.2).  Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase Kết quả nghiên cứu cũng tương ứng với cơng bố của nhóm sinh viên  thuộc Khoa Tài ngun Mơi trường, Trường Đại học Thủ  Dầu Một [1]   Theo  báo cáo nghiên cứu,  hoạt độ  enzyme thu được cao nhất trong mơi  trường rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD Có thể thấy, ống Efpendort chứa hỗn hợp dung dịch gồm enzyme thu  được tại hàm lượng pectin 12% có màu đậm nhất rồi đến ống 16% và ống  8% có màu sáng nhất.  3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm mơi trường Độ ẩm mơi trường ban đầu có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng   và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hưởng tới sự sinh  tổng hợp các enzyme thủy phân cơ  chất. Độ   ẩm mơi trường sẽ  thay đổi   liên tục trong q trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ   ẩm cho mơi  trường rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ khơng đủ lượng nước cho nấm sinh  trưởng, ngược lại độ   ẩm q cao cũng  ảnh hưởng tiêu cực đến sự  sinh  trưởng do độ  thống khí giảm.  Kết quả  hình 3.4 cho thấy   độ   ẩm 60%   chủng A.niger CF2 cho khả năng sinh tổng hợp pectinase cao nhất đạt 3,422  U/g. Giá trị  hàm  ẩm 60% cũng được xác định cho chủng  A.niger  CF2 khi  ni trên mơi trường rắn Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2 Báo cáo của Nazneen Akhter cùng cộng sự  cũng cho thấy hoạt độ  enzyme pectinase thu được cao nhất với giá trị hàm ẩm 60% [3] 3.2.3. Ảnh hưởng của  nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi  sinh vật có thể  sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme mục tiêu trong một  phạm vi nhất định. Mặc dù,  A. niger  là chủng nấm mốc hoạt động trong  vùng nhiệt độ  ưa ấm khoảng 20 – 40oC nhưng qua nghiên cứu tài liệu cho  thấy nhiệt độ sinh tổng hợp pectinase của các chủng A. niger rất khác nhau.  Bai ZH và cộng sự ni cấy chủng A. niger ở 30oC cho sinh tổng hợp  pectinase[2], trong khi đó Akhter N. và cộng sự lại chọn 40 oC cho ni cấy  A. niger IM­6 [3], Leda R Castilho và cộng sự ni cấy A. niger ở 35oC [4] Nghiên cứu  ảnh hưởng của nhiệt độ  đến q trình sinh tổng hợp   enzyme của chủng  A. niger  CF2 được thực hiện trong khoảng 24 ­ 37 oC.  Kết quả  được thể  hiện   hình 3.5 cho thấy   nhiệt độ  30oC A. niger CF2  phát triển mạnh nhất và cũng sinh tổng hợp pectinase cao nhất (5,4 U/g)   Do đó lựa chọn nhiệt độ ni cấy 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian lên men có  ảnh hưởng lớn trong sản xuất enzyme. Thời  gian lên men để  đạt hoạt độ  pectinase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản  xuất càng thấp. Kết quả hình 3.6 cho thấy chủng A. niger CF2 có khả năng  sinh tổng hợp pectinase cao nhất 5,572 U/g sau 72 giờ. Kết quả của Mukesh  kumar D J. và cộng sự ni cấy chủng A. niger từ chủng Bacillus sp. MFW7   cũng cho hoạt độ  pectinase cao nhất sau 72 giờ  [8]. Do vậy lựa chọn thời  gian ni cấy 72 giờ để thu nhận enzyme A. niger CF2 [10][12] Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng   hợp pectinase của A.niger CF2 Từ kết quả khảo sát cho thấy 3 thơng số hàm lượng pectin, hàm ẩm và  nhiệt độ  ảnh hưởng đáng kể  đến hoạt độ  peptinase. Với hàm lượng pectin  12%, độ ẩm 60% và nhiệt độ 30oC hoạt độ pectinase thu được cao nhất sau 72  giờ lên men.  3 ngày 5 ngày 7 ngày Hình 3.7: Mơi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày Ta có thể  thấy sau 3 ngày, hệ  sợi nấm phát triển và ăn lan khá dày  đặc trên bề  mặt cơ  chất tuy nhiên so với ngày thứ  5, ngày thứ  7; hệ  sợi   nấm an lan rộng hơn, dày hơn, đâm sâu vào cơ  chất hơn nhưng hoạt độ  enzyme ở ngày thứ 3 lại cao nhất. Điều đó chứng minh qua những hình ảnh   sau khi có sự  chênh lệch độ  đậm nhạt   hỗn hợp dung dịch (enzyme thu  được + pectin 1%): 3 ngày – màu dung dịch đậm hơn 5 ngày – màu dung dịch nhạt hơn Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5   ngày 3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và  độ bền enzyme pH ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme vì pH ảnh hưởng đến  mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát  ảnh hưởng của pH đến hoạt tính pectinase của   A. niger  CF2 qua đó xác  định được pH tối ưu của enzyme  pH tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 Để xác định pH tối ưu, pectinase của chủng A. niger CF2 được phản  ứng với cơ chấtđược pha trong dung dich đêm citrate photphat 0,1M co cac ̣ ̣ ́ ́  gia tri pH khac nhau năm trong khoang t ́ ̣ ́ ̀ ̉ ừ pH 3,0 đên 7,0 trong th ́ ời gian 10  phút. Mối quan hệ giữa pH và hoạt độ tương đối của enzyme thu được thể  hiện ở hình 14 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger   CF2 Kết quả  hình 3.9 cho thấy enzyme pectinase từ  chủng  A.niger CF2  hoạt động trung vùng pH từ 4 – 5 và hoạt độ enzyme thu được cao nhất pử  pH = 5.  Ở  pH này, hoạt tính của pectinase là tối đa và sự  thay đổi pH cao  hơn hoặc thấp hơn đều làm hạ  thấp đáng kể  độ  hoạt động của enzyme   Một số  tác giả  khi nghiên cứu đặc tính của pectinase từ  A. niger cũng tìm  được dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm trong khoảng từ 3,5 ­  5,5 và pH tối ưu là 4,5 – 5,5[04, 05,06,11] Xác định độ bền pH: ­ Khảo sát độ  bền pH hoạt tính pectinase bằng cách  ủ  enzyme  ở  40oC trong dung dịch đệm pH từ  3 – 7, sau những khoảng thời gian khác  nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ  pectinase còn lại (với cơ  chất được pha  trong dung dịch đệm pH = 4,5). Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.10 Hình 3.10:Ảnh hưởng của pH đến độ bền củapectinase từ A. nigerCF2 Kết quả cho thấy pectinase từ chủng A.niger CF2 bền trong vùng pH  4 – 5. Sau 6 giờ  ủ  ở 40 oC trong đệm pH 4 ­ 5 hoạt độ enzyme vẫn còn giữ  hơn 60% so với ban đầu [12]  Ở pH 6, 7 hoạt độ enzyme khơng ổn định và   giảm đáng kể sau 6 giờ 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme  Nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 Mỗi enzyme đều có một giá trị nhiệt độ tối ưu mà ở đó hoạt tính của   nó được thể hiện mạnh nhất cũng như có vùng nhiệt độ mà ở đó hoạt tính  enzyme ít bị  ảnh hưởng nhất gọi là vùng bền nhiệt của enzyme. Với mục   đích xác định được nhiệt độ  tối  ưu của pectinase từ  A. niger  CF2, dịch  enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70oC.  Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger   CF2 Kết     khảo   sát   ảnh   hưởng     nhiệt   độ   đến   hoạt   tính   của  pectinase từ chủng A. niger CF2 thấy khi tăng nhiệt độ từ 30oC – 40oC, hoạt  độ  enzyme tăng và đạt cực đại tại 40oC. Khi nhiệt độ  lớn hơn 40oC, hoạt  độ  enzyme giảm rất nhanh. Như  vậy, nhiệt độ  tối  ưu của pectinase từ  A.  niger CF2 là 40oC, cao hơn so với nhiệt độ  tối  ưu (35 oC) của peptinase từ  Bacillus sp. MFW7[8], bằng nhiệt độ  của pectinase từ  A. niger  sử  dụng  nguồn cacbon từ vỏ cam[9].   Độ bền nhiệt: Dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ  30 – 70 oC ở pH 4,5  trong khoảng thời gian 5h, cứ 1h tiến hành xác định hoạt độ  enzyme  và biểu diễn kết quả trên hình  Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase  từ chủng A.niger CF2 Kết quả  khảo sát  cho thấy pectinase từ  cả  chủng  A.niger  CF2 là  enzyme khơng bền nhiệt. Khi nhiệt độ  tăng hoạt độ  của pectinase giảm  dần và enzyme chỉ bền ở 30 ­ 50ºC. Khi nhiệt độ lớn hơn 50oC hoạt độ của  enzyme giảm rất nhanh và sau 5 giờ thì hoạt độ enzyme còn rất thấp.  3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại  đến hoạt tính enzyme Enzyme được  ủ trong đệm có bổ  sung ion kim loại nồng độ  10mM   Xác định hoạt độ và biểu diễn kết quả trên hình 3.13: Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme Từ  kết quả  hình 3.13  cho thấy, các ion Ca2+, Mn2+, Fe2+  khơng  ảnh  hưởng nhiều đến hoạt độ  của pectinase từ  A. niger CF2 nhưng lại có tác  dụng ức chế hoạt độ của enzyme.  Báo  cáo   của  A.  Rasheedha  Banu  và  cộng  sự  cho  rằng  Mg2+,  Ca2+  khơng làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt động pectinase, làm ức chế  sự  hoạt  động của pectinase từ chủng Penicillium chrysogenum [7] Kết quả thu được từ các thí nghiệm xác định mức độ ảnh hưởng của   nhiệt độ, pH đến hoạt độ  của enzyme pectinase ta có thể  đưa ra kết luận    điều kiện mơi trường cơ  bản tối  ưu nhất cho hoạt động của enzyme   Enzyme peptinase hoạt động tốt nhất trong mơi trường cơ chất có  pH bằng   5, ở nhiệt độ là 30oC, thời gian lên men là 72 giờ và mơi trường lên men có   hàm lượng pectin 12% enzyme này khá là bền nhiệt vì qua thời gian 2 giờ,   hoạt độ enzyme đo được vẫn ở mức cao CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.  Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, báo cáo đã rút được một số kết quả sau: ­ Tìm được điều kiện lên men rắn thích hợp để  A  niger  CF2  sinh  tổng hợp pectinase (5,57 U/g tại 30oC, pectin 12%, 72 giờ) ­ Đã xác định được đặc tính xúc tác của pectinase: bền ở  pH 4­5, 30­  50ºC và pH tối ưu 5, nhiệt độ tối ưu 40oC 4.2. Kiến nghị ­ Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng khác đến hiệu suất  lên men tạo enzyme pectinase của A. niger CF2 ­ Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme pectinase ­ Nghiên cứu ứng dụng enzyme pectinase của chủng  A.niger CF2 vào  q trình sản xuất nước quả, rượu vang và bóc vỏ  cam, qt,  để  có thể  phục vụ cho ngành cơng nghiệp thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Anh Dũng, Mai Thị  Ngọc Lan Thanh,   Trần Thị  Ngọc Như  –Nghiên cứu thu nhận pectinase từ  A.niger nuôi cấy   trên mơi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nang cao hiệu quả bóc vỏ tiêu ­  Trường  ĐH Thủ Dầu Một Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad  K.A. (2011)  Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid   state media. International Journal of Biosciences 1(1), pp. 33 ­ 42 A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V.  Pradeep and M. Palaniswamy ­ Production and characterization of pectinase   enzyme   from   Penicillium   chrysogenum   ­  Department   of   Microbiology,  Karpagam   University,   Coimbatore   ­   641   021,   Tamil   Nadu,   India  m.palaniswamy@gmail.com Bai ZH, Zhang HX, Qi HY, Peng XW, Li BJ­Pectinase production   by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting   plant disease resistance­ Department of Environmental Bio­Technology, The  Research   Center   for   Eco­Environmental   Sciences,   Chinese   Academy   of  Sciences, P.O. Box 2871, Beijing 100085 Hannan A., Bajwa R., Latif Z. (2009)  Status of Aspergillus niger   strains   for   pectinases   production   potential   Pakistan   Journal   of  Phytopathology 21(1), pp. 77 ­ 82 Ishtiaq   Ahmeda, , , Muhammad   Anjum   Ziaa, Muhammad   Azhar  Hussaina, Zain   Akramb, Muhammad   Tahir   Naveedc, Azin   Nowrouzid  –  Bioprocessing   of   citrus   waste   peel   for   induced   pectinase   production   by Aspergillus niger; its purification and characterization Leda   R   Castilhoa, , Ricardo   A   Medronhob, Tito   L.M   Alvesa  ­  Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation   of agroindustrial residues with Aspergillus niger Maciel   M.H.C.,   Herculano   P.N.,   Porto   T.S.,   Teixeira   M.F.S.,  Moreira   K.A.,   Souza­Motta   C.M   (2011)  Production   and   partial   characterization   of   pectinases   from   palm   by   Aspergillus   niger   URM4645   African   Journal   of   Biotechnology   10(13),   pp   2469   ­  2475 Maldonado M.C., Saad A.M.S. (1998). Production of pectinesterase   and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid   state systems. Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology,  pp. 34­ 38 10.  Martos   M.A.,   Vazquez   F.M.,   Benassi   F.O.,   Hours   R.A   (2009).  Production   of   pectinase   by   A   niger:   Influence   of   fermentation   conditions. Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3), pp.  567 ­ 572 11.  Mukesh   kumar   D   J1,*,   Saranya   G   M2   ,   Suresh   K2   ,   Andal  Priyadharshini   D2   ,   Rajakumar   R2   and   Kalaichelvan   PT1   1  ­Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp. MFW7   using   Cassava   Waste­   Centre   for   Advanced   Studies   in   Botany,  University   of   Madras,   Guindy   Campus,   Chennai,   TN,   India  2A.V.V.M. Sri Pushpam College (Autonomous), Poondi, Thanjavur  District, TN, India 12 Nazneen Akhter1, M. Alam Morshed1,3*, Azim Uddin3 , Feroza  Begum2   ,   Tipu   Sultan1   ,   Abul   Kalam   Azad1   1­  Production   of  Pectinase   by   Aspergillus   niger   Cultured   in   Solid   State   Media­  Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Faculty of  Applied Science and Technology 13.  Obechukwu   C   Ezike   Sabinus   Oscar   O   Eze   Chukwunonso   A.  Nsude   Ferdinand  C   Chilaka   ­Production   of   Pectinases   from   Aspergillus niger using submerged fermentation with orange peels   as   carbon   source­    Department   of   Biochemistry,   University   of  Nigeria Nsukka) 14   Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S. (2005)  Pectinase   and   polygalacturonase   production   by   a   thermophilic   Aspergillus   fumigatus   isolated   from   decomposting   orange   peels   Brazilian  Journal of Microbiology 36, pp. 63 ­ 69 15.  S. Mrudula and R. Anitharaj ­Pectianse Production in Solid State   Fermentation by Aspergillus niger Using Orange Peel as Substrate ... giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase   quy mơ cơng nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger( Yogesh,  2009) Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ. .. hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2 góp phần nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố mơi trường lên men nhằm tăng hiệu  suất q trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ  đó phục vụ... Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme 1.1.3. Tổng quan về Aspergillus niger 1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu A   niger     chủ   đề     nghiên   cứu     ứng   dụng     cơng  nghiệp trong nhiều thập kỷ qua. Năm 1919, A. niger được sử dụng để sinh