Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 trình bày nội dung với kết cấu 4 chương: Tổng quan về đề tài nghiên cứu; Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu; Kết quả nghiên cứu; Kết luận và kiến nghị,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực tập Viện Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt năm học tập trường Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà hành trang q báu để tơi bước vào đời cách vững tự tin Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Kim Dung – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hướng hướng dẫn tơi suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin kính chúc thầy, giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt nhiều thành công sống nghiệp nghiên cứu giảng dạy Tôi xin chân thành cảm ơn! Giáo viên hướng dẫn TS Vũ Kim Dung 123doc : Tài Liệu IT Sinh viên thực Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 MỤC LỤC 123doc : Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 DANH MỤC CÁC BẢNG 123doc : Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 DANH MỤC CÁC HÌNH 123doc : Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân phân tử pectin tạo sản phẩm khác Ban đầu, enzyme phát dịch chiết trái cà rốt, cà chua hay đại mạch Đặc biệt phải kể đến phát nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 đối tượng cà rốt Với vai trò quan trọng, pectinase sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích lớn công nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp nhẹ Trước nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật động vật Ngày nay, người ta nghiên cứu tìm nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng mang lại lợi ích kinh tế Một đặc điểm bật pectinase enzyme dùng không giới hạn thực phẩm khơng ảnh hưởng đến sức khỏe người Bằng ưu điểm dễ nuôi cấy, sinh trưởng phát triển nhanh,cho nhiều enzyme thời gian ngắn, vi sinh vật lựa chọn hàng đầu nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng suất sản xuất lên cao Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp thực chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009) Trên sở đó, mục tiêu đề tài “Nghiên cứu điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ phục vụ nhu cầu sản xuất nước mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme pectinase 1.1.1 Cơ chất pectin Pectin hợp chất cao phân tử mạch thẳng, cấu tạo từ acid galacturonic liên kết α-1,4 glucoside Tùy nguồn pectin khác mà pectin có khối lượng phân tử 80.000 ÷200.000 Da Pectin tan nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri, glycerine nóng Các pectin tự nhiên định vị thành phần tế bào liên kết với cấu trúc polysaccharide protein để tạo thành protopectin khơng tan Chúng ta phân hủy protopectin không tan tế bào thành pectin tan nước cách đun nóng pectin mơi trường acid, pectin tan không đồng dạng vớinhau Trong thực vật, pectin tồn ba dạng: - Pectin hòa tan: ester methylic polygalacturonic acid, tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl polygalacturonic acid ester hóa methanol Pectin ester hóa cao tạo gel đặc dung dịch acid dung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác cấu trúc hóa học khơng đồng dạng Cấu trúc hóa học pectin α-D-galacturonan hay α-Dgalacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ đơn vị D- galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α-1,4) Mặt khác, mức độ oxy hóa phân tử polymer khác nhau, số định nhóm carboxyl bị ester hóa nhóm methoxyl Trong số trường hợp, chẳng hạn pectin củ cải đường có ester hóa nhóm carboxyl nhóm acetyl Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 - Pectin acid: polygalacturonic acid có phần nhỏ nhóm carboxyl ester hóa methanol Pectinate muối pectinic acid Pectic acid polygalacturonic acid hồn tồn giải phóng khỏi đơn vị galacturonic acid Pectate muối pectic acid - Protopectin: tạo độ cứng cho xanh, không tan nước có cấu tạo hóa học phức tạp Trong protopectin có phân tử pectin, phân tử cellulose ion Ca2+, Mg2+ gốc phosphoric acid, acetic acid đường Protopectin bị thủy phân acid giải phóng pectin hòa tan 1.1.2 Hệ Enzyme Pectinase 1.1.2.1 Giới thiệu enzyme pectinase Enzyme pectinase enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin sản phẩm trình acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol,… nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp đứng sau amylase protease Sự phân hủy pectin tự nhiên thường xảy trái chín.Những enzyme có vai trò quan trọng trình bảo quản trái rau Hình 1.1: Cấu trúc phân tử peptin 1.1.2.2 Phân loại Enzyme pectinase phân loại theo chế tác dụng chúng bảng 1.1 - Pectinesterase (PE): xúc tác thủy phân nhóm methyl ester Enzyme thường cơng vào nhóm ester methyl đơn vị galaturonate Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 nằm kề đơn vị khơng bị ester hố, phân cắt nhóm methoxy (COOCH 3) đứng cạnh nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic acid pectic methanol Pectinesterase thu từ nguồn khác có giá trị pH tối ưu khác Pectinesterase thường hoạt hoá ion Ca2+ Mg2+ Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase STT Enzym (tên gọi theo hệ thống) Pectinpectinhydrolase Poly-α-1,4 galacturonid-glycano hydrolase-PG Poly-α-1,4-Dgalacturonidgalacturo n-hydrolase Poly-α-1,4-Dgalacturonidmetilester -glycanohydrolase Poly-α-1,4-Dgalacturonid digalacturonoliase Poly-α-1,4-Dgalacturonid glicanoliase Poly-α-1,4-Dgalacturonid metylester glicanoliase Enzym(tên thường gọi) Phản ứng xúc tác Pectin + H2O = n metanol + pectic acid Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopoly galacturonid galacturonase galacturonid không theo (endo-PG) trật tự Thủy phân liên kết α-1,4-DExopoly galacturonid pectat, galacturonase galacturonic với (exo-PG) đứt mạch acid galacturonic Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopolymetilgalacturonid pectin galacturonase không theo trật tự (Endo-PMG) định Thủy phân liên kết α-1,4-Dgalacturonid pectat với Exo-pectatliase tạo thành α-4,5 (exo-PKTE) aciddegalacturonic không theo trật tự định Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopectatlias galacturonid pectat, galacturonic với tạo e (PETE) thành nối đôi không theo trật tự định Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopectinlias galacturonid pectin với tạo thành nối đôi e (Endo-PTE) không theo trật tự định pectinesterase Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 - Polygalacturonase (PG): có tên gọi khác poly 1,4- galacturoniglucanohydrolase, xúc tác phân cắt mối liên kết α-1,4glycoside Các exo-PG (exo-poly α-1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ đầu không khử, endo-PG (endo- poly α-1,4-D-galacturonide) glycanohydrolase công ngẫu nhiên vào mạch chất Polygalacturonase phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử thường có tính đặc hiệu cao đối - với chất Pectate lyase (PEL): xúc tác phân cắt đơn vị galacturonate khơng khơng bị ester hóa Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4-α-Dgalacturonide)lyase) endo-PEL (endo-poly (1,4-α-D-galacturonic) lyase) tồn Pectate pectin có lượng methoxyl thấp chất thích hợp cho enzyme Nói chung, hai enzyme có khoảng pH tối đa nằm khoảng từ 8,0-11, cần ion Ca2+ để hoạt động Pectate lyase khơng tìm thấy xanh, có vi khuẩn nấm Các enzyme VSV ngoại bào đóng vai trò quan trọng trình gây bệnh thực vật, gây phân hủy mô thành tế bào, làm mềm làm mục mơ thực vật Ngồi có: - Pectin-transeliminase (poly 1,4-α-galaturonid-methylesteglucanolise) enzyme tác dụng lên pectin pectinic acid - Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4-α- galaturonid–glucanoliase) - enzyme tác dụng pectic acid pectinic acid Pectin lyase (PNL): xúc tác phân cắt đơn vị galacturonate bị ester hóa Tất PNL endo-enzyme 1.1.2.3 Ứng dụng enzyme pectinase - Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng chế phẩm pectinase duới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dạng canh trường nấm Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 mốc sấy khô Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10% - Trong sản xuất rượu vang, sản xuất nước nước uống không rượu, sử dụng pectinase cách hiệu Nhờ tác dụng pectinase mà trình ép, làm dịch lọc dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, làm tăng hiệu suất nước sau ép tới 15 – 25% Bởi lẽ có pectinase phân giải chất pectinase mà dịch suốt không bị đục lọc dễ dàng Khơng vậy, enzyme pectinase góp phần chiết rút chất màu, tannin chất hoà tan nữa, làm tăng thêm chất lượng thành phẩm - Trong sản xuất nước rượu vang, người ta thường sử dụng • sáu nhóm enzyme sau: Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước đục Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme làm tăng hiệu suất trích ly để thu luợng • sản phẩm lớn Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước trong, không chứa pectin Mục đích sử dụng nhóm làm tăng hiệu suất trích ly thuỷ phân hồn tồn chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt làm triệt tiêu • ngun nhân làm đục nước Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả đồng hoá nước • thịt quả, làm tăng khả trích ly nước Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm • tăng hiệu suất trích ly bán sản phẩm Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản trình oxy hoá làm cản trở phát triển vi sinh vật hiếu khí phát triển nước quả, rượu • vang Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường sản suất siro thành phẩm 10 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase ST Hàm lượng Độ ẩm Nhiệt độ Thời gian lên T pectin (%) 12 16 Hàm lượng (%) (oC) men (giờ) 60 30 72 30 72 10 11 12 pectin thích hợp Hàm lượng pectin thích hợp Hàm lượng pectin thích hợp 50 60 70 hợp 24 30 37 Độ ẩm thích Nhiệt hợp thích hợp Độ ẩm thích 72 độ 72 120 168 Hình 2.1: Mơi trường lên men trước bổ sung dịch khống 2.3.5.4 Thu dịch enzyme thơ Dịch enzyme chiết tách đệm phosphate pH 4,5 (tỷ lệ chiết đệm: môi trường nuôi 7:1) máy lắc 200 vòng/ phút giờ, lọc qua vải sau lọc giấy lọc Whatman No1 Dịch sau lọc ly tâm 10.000 vòng/ phút 20 phút 4oC thu dịch (enzyme thô) 2.3.5.5 Kết tủa enzyme ethanol 32 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Dịch enzyme sau ly tâm sổ sung ethanol lạnh (0 oC) theo tỷ lệ 1:3, để dịch ổn định tiếng o – 4oC, sau ly tâm 10.000 vòng/ phút phút 4oC Hòa tan kết tủa đệm pH 4,5 xác định hoạt độ Pectinase 2.3.5.6 Định lượng đường khử DNS Đường khử xác định theo phương pháp Miller G.L (1959) - Nguyên tắc: phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitro salisilic Cường độ màu phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định Biết mật độ quang dịch đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan suy hàm lượng đường khử dịch nghiên cứu - Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: pha mẫu đường monogalacturonan có nồng độ xác định cho 200 µl dịch phản ứng với ml thuốc thử DNS thời gian 10 phút Kết đem đo mật độ quang bước sóng 575nm Từ lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD Kết xây dựng đường chuẩn monogalacturonan biểu diễn đồ thị đây: Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan Từ đồ thị trên, tính nồng độ đường khử mẫu từ giá trị mật độ quang theo phương trình sau: 33 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 x = (mg/ml) Trongđó: x: hàm lượng đường có mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD) 2.3.5.7 Xác định hoạt độ Pectinase Hoạt độ Pectinase xác định với chất pectin Phản ứng enzyme thực với 180 µl dung dịch pectin 1% (w/v) 20 µl dung dịch enzyme (được pha lỗng tới nồng độ thích hợp), 50 oC 10 phút Dừng phản ứng ml dung dịch DNS đun sôi 10 phút Tiếp đến, li tâm hỗn dịch phản ứng 10.000 vòng/phút phút (cho loại cặn có) Đo độ hấp thụ bước sóng 575 nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme Một đơn vị hoạt độ Pectinase lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa pectin tạo thành µmol acid galacturonic thời gian phút điều kiện hoạt động thích hợp enzyme Hoạt độ pectinase xác định cơng thức: H = (U/ml) Trong đó: X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml) f: hệ số pha loãng 1000: hệ số quy đổi 600: khối lượng phân tử pectin t: thời gian thủy phân (10 phút) 2.3.5.8 Khảo sát đặc tính Pectinase Nhiệt độ tối ưu enzyme tiến hành theo phương pháp xác định hoạt độ Pectinase nhiệt độ khác khoảng từ 30 – 70 oC Để khảo sát độ bền nhiệt, enzyme ủ dung dịch đệm citrate photphat 0,1M pH 4,5 nhiệt độ khác (trong khoảng từ 30 - 70 oC) Sau khoảng thời gian – giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase lại 34 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme xác định nhiệt độ tối ưu enzyme với chất pha dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có giá trị pH khác nằm khoảng từ pH 3,0 đến 7,0 Để khảo sát độ bền pH, enzyme pha loãng ủ 40 oC với dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau, sau khoảng thời gian – giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase lại (với chất pha dung dịch đệm pH 4,5) Ảnh hưởng ion đến hoạt tính enzyme nghiên cứu cách ủ dung dịch enzyme với ion kim loại Ca 2+, Fe2+, Mn2+ (nồng độ cuối 10 mM) đệm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5) 50 oC 10 phút, sau xác định hoạt độ Pectinase lại so sánh với mẫu không bổ sung ion kim loại (đối chứng) 2.3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm thực với lần lặp.Các kết nghiên cứu trung bình lần lặp lại 35 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2 A.niger CF2 sau 72 hoạt hóa mơi trường Czapeck có hình thái hệ sợi bào tử hình 3.1 Bào tử hình tròn, màu nâu đậm, mật độ hệ sợi trung bình D=2-3cm có màu trắng đục, dạng hình tròn Hình 3.1: A niger sau ngày nuôi cấy tủ ấm 30oC 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp pectinase 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng pectin Pectin đóng vai trò chất cảm ứng cho trình tổng hợp pectinase Với phương pháp lên men rắn, lượng pectin sử dụng khảo sát khoảng – 16% (w/w) Sau ngày nuôi, hoạt độ pectinase cao đạt 2,231 U/g hàm lượng pectin 12% (w/w) (hình 3.2) Hình 3.2: Ảnh hưởng pectin đến hoạt độ pectinase Kết nghiên cứu tương ứng với cơng bố nhóm sinh viên thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, Trường Đại học Thủ Dầu Một [1] Theo báo cáo nghiên cứu, hoạt độ enzyme thu cao môi trường rắn có bổ sung 12% chất pectin 36 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu + pectin 1%) trước đo OD Có thể thấy, ống Efpendort chứa hỗn hợp dung dịch gồm enzyme thu hàm lượng pectin 12% có màu đậm đến ống 16% ống 8% có màu sáng 3.2.2 Ảnh hưởng độ ẩm mơi trường Độ ẩm mơi trường ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật lên men rắn, ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme thủy phân chất Độ ẩm môi trường thay đổi liên tục trình lên men, việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trường quan trọng Độ ẩm thấp không đủ lượng nước cho nấm sinh trưởng, ngược lại độ ẩm cao ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng độ thống khí giảm Kết hình 3.4 cho thấy độ ẩm 60% chủng A.niger CF2 cho khả sinh tổng hợp pectinase cao đạt 3,422 U/g Giá trị hàm ẩm 60% xác định cho chủng A.niger CF2 ni mơi trường rắn Hình 3.4: Ảnh hưởng độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2 Báo cáo Nazneen Akhter cộng cho thấy hoạt độ enzyme pectinase thu cao với giá trị hàm ẩm 60% [3] 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 37 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến phát triển vi sinh vật, vi sinh vật sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme mục tiêu phạm vi định Mặc dù, A niger chủng nấm mốc hoạt động vùng nhiệt độ ưa ấm khoảng 20 – 40oC qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp pectinase chủng A niger khác Bai ZH cộng nuôi cấy chủng A niger 30oC cho sinh tổng hợp pectinase[2], Akhter N cộng lại chọn 40 oC cho nuôi cấy A niger IM-6 [3], Leda R Castilho cộng nuôi cấy A niger 35oC [4] Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme chủng A niger CF2 thực khoảng 24 - 37 oC Kết thể hình 3.5 cho thấy nhiệt độ 30 oC A niger CF2 phát triển mạnh sinh tổng hợp pectinase cao (5,4 U/g) Do lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 30oC cho nghiên cứu Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian lên men Thời gian lên men có ảnh hưởng lớn sản xuất enzyme Thời gian lên men để đạt hoạt độ pectinase cao ngắn chi phí sản xuất thấp Kết hình 3.6 cho thấy chủng A niger CF2 có khả sinh tổng hợp pectinase cao 5,572 U/g sau 72 Kết Mukesh kumar D J cộng nuôi cấy chủng A niger từ chủng Bacillus sp MFW7 cho hoạt độ pectinase cao sau 72 [8] Do lựa chọn thời gian nuôi cấy 72 để thu nhận enzyme A niger CF2 [10][12] Hình 3.6: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp pectinase A.niger CF2 Từ kết khảo sát cho thấy thông số hàm lượng pectin, hàm ẩm nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ peptinase Với hàm lượng pectin 12%, 38 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 độ ẩm 60% nhiệt độ 30oC hoạt độ pectinase thu cao sau 72 lên men ngày Hình 3.7: Mơi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 ngày Ta thấy sau ngày, hệ sợi nấm phát triển ăn lan dày đặc bề mặt chất nhiên so với ngày thứ 5, ngày thứ 7; hệ sợi nấm an lan rộng hơn, dày hơn, đâm sâu vào chất hoạt độ enzyme ngày thứ lại cao Điều chứng minh qua hình ảnh sau có chênh lệch độ đậm nhạt hỗn hợp dung dịch (enzyme thu + pectin 1%): ngày – màu dung dịch đậm ngày – màu dung dịch nhạt Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu + pectin 1%) sau 3, ngày 3.3 Đặc tính peptinase từ chủng A niger CF2 3.3.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính độ bền enzyme pH ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất độ bền enzyme Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính pectinase A niger CF2 qua xác định pH tối ưu enzyme 39 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2  pH tối ưu pectinase từ A niger CF2 Để xác định pH tối ưu, pectinase chủng A niger CF2 phản ứng với chấtđược pha dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có giá trị pH khác nằm khoảng từ pH 3,0 đến 7,0 thời gian 10 phút Mối quan hệ pH hoạt độ tương đối enzyme thu thể hình 14 Hình 3.9: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2 Kết hình 3.9 cho thấy enzyme pectinase từ chủng A.niger CF2 hoạt động trung vùng pH từ – hoạt độ enzyme thu cao pử pH = Ở pH này, hoạt tính pectinase tối đa thay đổi pH cao thấp làm hạ thấp đáng kể độ hoạt động enzyme Một số tác giả nghiên cứu đặc tính pectinase từ A niger tìm dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm khoảng từ 3,5 - 5,5 pH tối ưu 4,5 – 5,5[04, 05,06,11]  Xác định độ bền pH: - Khảo sát độ bền pH hoạt tính pectinase cách ủ enzyme 40 oC dung dịch đệm pH từ – 7, sau khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase lại (với chất pha dung dịch đệm pH = 4,5) Kết thu thể hình 3.10 Hình 3.10:Ảnh hưởng pH đến độ bền củapectinase từ A nigerCF2 Kết cho thấy pectinase từ chủng A.niger CF2 bền vùng pH – Sau ủ 40oC đệm pH - hoạt độ enzyme giữ 60% so với ban đầu [12] Ở pH 6, hoạt độ enzyme không ổn định giảm đáng kể sau 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền enzyme  Nhiệt độ tối ưu pectinase từ A niger CF2 40 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Mỗi enzyme có giá trị nhiệt độ tối ưu mà hoạt tính thể mạnh có vùng nhiệt độ mà hoạt tính enzyme bị ảnh hưởng gọi vùng bền nhiệt enzyme Với mục đích xác định nhiệt độ tối ưu pectinase từ A niger CF2, dịch enzyme giữ ổn nhiệt nhiệt độ 30 – 70oC Hình 3.11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A niger CF2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính pectinase từ chủng A niger CF2 thấy tăng nhiệt độ từ 30oC – 40oC, hoạt độ enzyme tăng đạt cực đại 40oC Khi nhiệt độ lớn 40 oC, hoạt độ enzyme giảm nhanh Như vậy, nhiệt độ tối ưu pectinase từ A niger CF2 40oC, cao so với nhiệt độ tối ưu (35oC) peptinase từ Bacillus sp MFW7[8], nhiệt độ pectinase từ A niger sử dụng nguồn cacbon từ vỏ cam[9]  Độ bền nhiệt: Dịch enzyme giữ ổn nhiệt nhiệt độ 30 – 70 oC pH 4,5 khoảng thời gian 5h, 1h tiến hành xác định hoạt độ enzyme biểu diễn kết hình Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger CF2 Kết khảo sát cho thấy pectinase từ chủng A.niger CF2 enzyme không bền nhiệt Khi nhiệt độ tăng hoạt độ pectinase giảm dần enzyme bền 30 - 50ºC Khi nhiệt độ lớn 50 oC hoạt độ enzyme giảm nhanh sau hoạt độ enzyme thấp 3.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme 41 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Enzyme ủ đệm có bổ sung ion kim loại nồng độ 10mM Xác định hoạt độ biểu diễn kết hình 3.13: 100Ảnh hưởng tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme Hình 3.13: Từ kết hình 3.13 cho thấy, ion Ca2+, Mn2+, Fe2+ không ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ pectinase từ A niger CF2 lại có tác dụng ức chế hoạt độ enzyme Báo cáo A Rasheedha Banu cộng cho Mg 2+, Ca2+ không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt động pectinase, làm ức chế hoạt động pectinase từ chủng Penicillium chrysogenum [7] Kết thu từ thí nghiệm xác định mức độ ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme pectinase ta đưa kết luận điều kiện môi trường tối ưu cho hoạt động enzyme Enzyme peptinase hoạt động tốt môi trường chất có pH 5, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 72 môi trường lên men có hàm lượng pectin 12% enzyme bền nhiệt qua thời gian giờ, hoạt độ enzyme đo mức cao 42 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, báo cáo rút số kết sau: - Tìm điều kiện lên men rắn thích hợp để A niger CF2 sinh tổng hợp pectinase (5,57 U/g 30oC, pectin 12%, 72 giờ) - Đã xác định đặc tính xúc tác pectinase: bền pH 4-5, 30- 50ºC pH tối ưu 5, nhiệt độ tối ưu 40oC 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng khác đến hiệu suất lên men tạo enzyme pectinase A niger CF2 - Nghiên cứu phương pháp tinh enzyme pectinase - Nghiên cứu ứng dụng enzyme pectinase chủng A.niger CF2 vào trình sản xuất nước quả, rượu vang bóc vỏ cam, quýt, để phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm 43 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Anh Dũng, Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Trần Thị Ngọc Như –Nghiên cứu thu nhận pectinase từ A.niger nuôi cấy môi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nang cao hiệu bóc vỏ tiêu - Trường ĐH Thủ Dầu Một Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad K.A (2011) Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media International Journal of Biosciences 1(1), pp 33 - 42 A Rasheedha Banu, M Kalpana Devi, G R Gnanaprabhal, B V Pradeep and M Palaniswamy - Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum - Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India m.palaniswamy@gmail.com Bai ZH, Zhang HX, Qi HY, Peng XW, Li BJ-Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance- Department of Environmental Bio-Technology, The Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, P.O Box 2871, Beijing 100085 Hannan A., Bajwa R., Latif Z (2009) Status of Aspergillus niger strains for pectinases production potential Pakistan Journal of Phytopathology 21(1), pp 77 - 82 Ishtiaq Ahmeda, , , Muhammad Anjum Ziaa, Muhammad Azhar Hussaina, Zain Akramb, Muhammad Tahir Naveedc, Azin Nowrouzid – Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its purification and characterization Leda R Castilhoa, , Ricardo A Medronhob, Tito L.M Alvesa - Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 Maciel M.H.C., Herculano P.N., Porto T.S., Teixeira M.F.S., Moreira K.A., Souza-Motta C.M (2011) Production and partial characterization of pectinases from palm by Aspergillus niger URM4645 African Journal of Biotechnology 10(13), pp 2469 2475 Maldonado M.C., Saad A.M.S (1998) Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state systems Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, pp 34- 38 10 Martos M.A., Vazquez F.M., Benassi F.O., Hours R.A (2009) Production of pectinase by A niger: Influence of fermentation conditions Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3), pp 567 - 572 11 Mukesh kumar D J1,*, Saranya G M2 , Suresh K2 , Andal Priyadharshini D2 , Rajakumar R2 and Kalaichelvan PT1 -Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp MFW7 using Cassava Waste- Centre for Advanced Studies in Botany, University of Madras, Guindy Campus, Chennai, TN, India 2A.V.V.M Sri Pushpam College (Autonomous), Poondi, Thanjavur District, TN, India 12 Nazneen Akhter1, M Alam Morshed1,3*, Azim Uddin3 , Feroza Begum2 , Tipu Sultan1 , Abul Kalam Azad1 1- Production of Pectinase by Aspergillus niger Cultured in Solid State MediaDepartment of Biotechnology and Genetic Engineering, Faculty of Applied Science and Technology 13 Obechukwu C Chukwunonso A Ezike Nsude Sabinus Oscar Ferdinand C O Eze Chilaka -Production of Pectinases from Aspergillus niger using submerged Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 fermentation with orange peels as carbon source- Department of Biochemistry, University of Nigeria Nsukka) 14 Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S (2005) Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels Brazilian Journal of Microbiology 36, pp 63 - 69 15 S Mrudula and R Anitharaj -Pectianse Production in Solid State Fermentation by Aspergillus niger Using Orange Peel as Substrate ... vi sinhvật Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 15 Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus. . .Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 MỤC LỤC 123doc : Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp. .. hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 DANH MỤC CÁC BẢNG 123doc : Tài Liệu IT Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 DANH MỤC CÁC HÌNH