PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử sách đào tạo sau đại học y dược

Song song vỏi việc đầu tư cơ sơ vật chất cho các cơ sơ đào tạo, Bộ Y tế đã đặc biệt chú trọng tăng cương các phương tiện dạy vè học, trong đó việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng dạ

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC■

HÀ N Ộ I- 2 0 1 0■

CHÍ ĐẠO BIẼN SOẠN:

Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tê

LỜI GIỚI THIỆU■

Đào tạo nguồn nhân lực cán bộ chất lượng cao là một trong những môi quan tâm hàng đầu của ngành Y tế Song song vỏi việc đầu tư cơ sơ vật chất cho các cơ sơ đào tạo, Bộ Y tế đã đặc biệt chú trọng tăng cương các phương tiện dạy

vè học, trong đó việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng dạy đặc biệt ưu tiên.Sách “PCR và một sô kỹ th u ậ t y sinh học phân tử” này được biên soạn nhằm phục vụ chủ yếu cho việc đào tạo sau đại học trong các Trường đại học Y, Dược dựa trên chương trình khung của Trường Đại học Y Hà Nội nhưng cũng là tài liệu đề đào tạo đại học và tham khảo, tự học cho các nghiên cứu viên làm việc trong lĩnh vực y sinh Bên cạnh những kiến thức lý thuyết và nguyên lý cơ bản của các kỹ th u ậ t y sinh học phân tử, cuốn sách còn cung cấp những quy trìn h kỹ th u ậ t cụ thể hướng dẫn cho những người bắt đầu triến khai các kỹ

th u ậ t chuyên sâu này

Cuốn sách này được biên soạn bởi PGS TS Tạ Thành Văn, một nhà khoa học giàu kinh nghiệm trong lĩnh vực Hóa sinh học phân tử và tế bào Sách đã được Hội đồng chuyên môn của Bộ Y tê thẩm định theo Quyêt định sô 928/QĐ - BYT ngày 22 tháng 3 năm 2010 gồm các chuyên gia thuộc các chuyên ngành Hóa sinh, Miễn dịch, Sinh lý bệnh, Vi sinh và Sinh học Cuốn sách được ban hành làm tài liệu sử dụng chính thức phục vụ đào tạo đại học và sau đại học của ngành Y tế Đồng thòi cuốn sách cũng sẽ là tài liệu tham khảo hữu ích cho các cán bộ làm việc trong các phòng thí nghiệm, phòng xét nghiệm y sinh

Bộ Y tế xin chân thành cảm ơn GS TSKH Phan Thị Phi Phi, Chủ tịch Hội đồng thẩm định, GS TS Phùng Đắc Cam và PGS TS Nguyễn Thị Hà, ủy viên phản biện và các ủy viên Hội đồng đã đọc, đóng góp nhiều ý kiến quý báu đê cuôn sách được hoàn thiện

Đây là lần xuất bản đầu tiên, cuốn sách chắc chắn sẽ được chỉnh lý, bổ sung và cập n h ậ t trong những lần xuất bản tiếp sau Chúng tôi mong nhận được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp và các độc giả để sách được hoàn chỉnh hơn cho những lần xuất bản sau

VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y T Ế

3

LỜI MỞ ĐẦU

Các kỹ th u ậ t sinh học phân tử là một công cụ đặc biệt hữu ích cho các nhà khoa học làm việc trong lĩnh vực công nghệ sinh học Kê từ khi việc giải mã bộ gen người được hoàn tất, các kỹ thu ật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học và phát huy hiệu quả to lốn trong chẩn đoán, theo dõi hiệu quả điều trị và phòng bệnh

Cuôn sách “PCR uà một sô kỹ thuật y sinh học phân tử ' này được biên

soạn dành cho các nghiên cứu viên, sinh viên bậc đại học và sau đại học thuộc các chuyên ngành khác nhau trong lĩnh vực y sinh Cuốn sách cung cấp cho các dộc giả không chỉ những kiến thức lý thuyết cơ bản, nguyên lý, triển vọng ứng dụng của PCR và các kỹ th u ậ t y sinh học phân tử khác, mà còn cung cấp những quy trình kỹ th u ậ t cụ thê hướng dẫn cho những người bắt đầu triển khai các kỹ

th u ậ t chuyên sâu này

Nội dung cuốn sách để cập đến những lĩnh vực mà các kỹ th u ậ t sinh học phân tử chuyên biệt đang được áp dụng Các độc giả có thể tìm thấy trong cuốn sách này những kiến thức khoa học chuyên sâu, cơ sỏ lý luận khoa học của việc thiết lập các quy trình kỹ thuật, từ đó mỗi cán bộ khoa học có thê tự điểu chỉnh, thay đổi, cải tiến các quy trình này sao cho phù hợp vối từng mục đích và điều kiện của từng phòng thí nghiệm để phát huy tối đa hiệu quả trong nghiên cứu khoa học cũng như trong hoạt động chuyên môn thường quy của mình Vối tất

cả nội dung được trình bày, cuốn sách sẽ là tài liệu học tập, tham khảo cho các cán bộ khoa học thuộc các chuyên ngành Kỹ th u ậ t Y học, Hóa sinh, Sinh học, Miễn dịch học, Vi sinh của các Trường đại học Y Dược, Trường đại học Tổng hợp

và các Viện nghiên cứu

Với tốc độ phát triển rấ t nhanh của công nghệ sinh học trong những năm gần đây, đặc biệt là các kỹ th u ậ t sinh học phân tử ứng dụng trong y học, trong khuôn khô cuốn sách này, tác giả không hướng tối mục đích mô tả chi tiêt tấ t cả các quy trình kỹ th u ậ t cũng như các ứng dụng khác nhau của PCR nói riêng và của các kỹ th u ậ t sinh học phân tử nói chung Tuy nhiên, có thê nói những kiến thức được trình bày ở đây là những kiến thức nền cơ bản nhất, mà thường những kỹ th u ậ t dù mới th ế nào đi chăng nữa cũng đểu dựa trên những nguyên tắc khoa học này

Tác giả xin bày tỏ sự biết ơn tói các đồng nghiệp đã dành thời gian đọc bản thảo và góp ý chi tiết về nội dung, cũng như cách trình bày, các cán bộ của Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế, Nhà xuất bản Y học đã giúp đỡ tác giả trong quá trìn h hoàn thiện cuốn sách này

Hà Nội, ngày 01 tháng 3 năm 2010

PGS TS TẠ THẢNH VĂN

MỤC LỤC■ ■

Chương I N hững k iến th ứ c cơ bản ch u n g 11

A T hành phần hóa học và cấu trúc acid n u cleic 11

2.1 Cấu trúc của acid deoxyribonucleotid (DNA) 13

2.1.3 Các dạng cấu trúc xoắn khác của acid nucleic 142.1.4 Các lực hóa học và cấu trúc làm bền vững cấu trúc acid 15 nucleic

1.1.1 Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc virus 201.1.2 Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc tế bào 221.2 Gen điều khiển và gen tăng cường cảm ứng 22

2 Môi tương tác giữa gen điều khiển và intron 23

3 Các tín hiệu thoái hóa của mRNA và quá trình polyadenin hóa 24

Chương II Giới th iệu c h u n g về kỷ th u ậ t PCR 28

1 Giối thiệu chung: PCR, một máy photocopy 28

7

2 Lịch sử của kỹ th u ậ t PCR 28

3 Kỹ th u ật PCR liên quan đến quá trình sao chép DNA 29

5 Liệu kỹ th u ậ t PCR có thê thay thê được kỹ th u ật tạo dòng gen? 31

Chương III N gu yên tắc của kỹ th u ật PCR 33

1 Kỹ th u ật PCR được tiến hành như th ế nào? 33

5 Hỗn hợp dung dịch PCR trộn trước (PCR premix) 43

6.3 Khuếch đại gen đích nhò hỗn hợp các mồi 47

7.3 Một số loại Taq DNA polymerase thương mại 497.4 Một sô loại DNA polymerase bền vối nhiệt có hoạt tính sửa chữa 50

9 Vật tư tiêu hao 51

11 Xây dựng hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử 51

12 Một sô vấn đề kỹ th u ậ t cần lưu ý khi đọc và phân tích kết quả PCR 69

Chương VI Tinh sạch và tách d òng sản phẩm PCR 73

1.3 Tinh chê bằng cột và ly tâm (Spin columns) 74

1.5 Tinh chê bằng hỗn hợp silica hoặc glassmilk 75

Chương VII Các phương pháp phân tích bộ gen 80

1 Phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn 81

9

1.1 Nguyên tắc 811.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyến của sợi đơn DNA 83

3 Hệ thống khuếch đại các đột biến bên với nhiệt 86

4 Khuếch đại phân đoạn cấu trúc đa hình thái 87

5 P h ân tích kiểu gen “một ông nghiệm Tm" 88

6 Phương pháp sử dụng enzym giới hạn phân tích chuỗi gen đa hình 90thái

7 Khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình thái 91

8 P h ân tích thê đa hình thái A lu bằng PCR đa mồi 92

9 P h ân tích sự lặp lại của minisatelite 93

C hương VIII Các quy trìn h kỹ th u ậ t sinh học phân tử 97

Quy trình 3.1 Phosphoryl hóa đầu 5 của chuỗi oligonucleotid 99Quy trình 3.2 Tách chiết genomic DNA từ mô thực vật 100

Quy trình 3.4 Tách chiết DNA sử dụng proteinase K 103

Quy trình 4.2 Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 107

Quy trình 5.1 Tạo các phân đoạn PCR đầu tù 110Quy trình 5.2 Tủa sản phẩm DNA bằng ethanol 111Quy trinh 5.3 Biến nạp DNA vào hệ vi khuẩn 112

Quy trình 6.2 Thu hồi DNA từ gel đã khô 115Quy trình 6.3 Khuếch đại n h an h cDNA từ đầu tận (5’-RACE) 116Quy trình 6.4 Cô định lát cắt mô vào phiến kính 118

Chương I

NHỮNG KIẾN THỨC c ơ BẢN CHUNG

A THÀNH PHẨN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC ACID NUCLEIC■

Nucleotid là những hợp chất sinh học tham gia vào nhiều các quá trìn h chuyên hóa của tế bào Chúng là phương tiện dự trữ và vận chuyển năng lượng,

là sự đáp ứng hóa học của tê bào đối với các hormon và các chất kích thích ở khoảng gian bào, là th à n h phần cấu trúc của các coenzym hay các chất chuyển hoá trung gian Song điều quan trọng n hất phải kế đến là nucleotid chính là

th à n h phần cấu tạo nên các acid nucleic: acid deoxyribonucleic (DNA) và acid ribonucleic (RNA), cơ sỏ vật chất của thông tin di truyền

1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ACID NƯCLEIC

Cấu trúc hóa học của acid nucleic được Phoebus Levine và Alexander Todd đưa ra trong những năm đầu của những năm 50 của th ế kỷ trước Acid nucleic

là các chuỗi polymer thang (phổ biến) của nucleotid nôi vối nhau bằng cầu nôi phosphat ở vị trí 3’ và 5’ của hai phân tử đường liên tiếp

H ình 1.1 Thành phần và mô hình cấu trúc của dinucleotid

(adenyl-3’ , 5’-cytidyl-3’, '-phosphat (ACp))

11

D e oxynb onucle otid

H ình 1.2 Cấu trúc hóa học của (a) ribonucleotid và (b) deoxyribonucleotid

Các gốc phosphat của chuỗi polynucleotid và các nhóm phosphodieste là các gốc acid, chính vì vậy mà ở pH sinh lý, acid nucleic là những chuồi anion Phân tử DNA là chuỗi xoắn kép, có lượng cân bằng các gốc adenin và thymin (A = T) cũng như guanin và cytosin (G = C) Phân tử RNA thường là chuỗi xoắn

đơn ngoại trừ RNA của một số virus có cấu trúc xoắn kép Trong khi đó DNA của

một sô virus lại có cấu trúc xoắn đơn Tuy nhiên khi các phân tử DNA này xâm nhập vào trong tế bào chủ và nhân lên, nó sẽ hình thành cấu trúc xoắn kép

H ình 1.3 Thành phần, tên gọi các base nitơ, nucleosid và nucleotid

Một sô' DNA và RNA có chứa các dẫn xuất của các base, đặc biệt là trong các vi sinh vật Đó là các dẫn xuất methyl hóa, các dẫn xuất này được tạo ra bởi các enzym đặc hiệu.

RNA dễ dàng bị thuỷ phân trong môi trường kiềm đế tạo ra một hỗn hợp các 2’ và 3’ nucleotid trong khi DNA vì không có nhóm 2’-OH nên bền vững trong môi trường kiềm và do vậy phân tử DNA rấ t bền vững so với RNA

Nucleotid là este phosphat của đưòng pentose, trong đó base nitơ liên kết với c , của đường Trong ribonucleotid, đường pentose là D-ribose còn trong deoxyribonucleotid (hay còn gọi là deoxynucleotid) có trong DNA thì lại là 2’- deoxy-D-ribose Gốc phosphat có thê gắn ở vị trí C3- hoặc C5 của nguyên tử đưòng đề tạo hoặc 3’-nucleotid hoặc 5’-nucleotid Phức hợp trên nếu không có gốíc phosphat thì được gọi là nucleosid

2 CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA ACID NUCLEIC

2.1 Cấu trúc a cid d e o x y r ib o n u c le ic (DNA)

2.1.1 C ấu trú c x o ắ n kép

P h á t minh r a cấu trúc xoắn kép của DNA bởi Jam es Watson và Francis Crick năm 1953 đã khai sinh ra ngành Sinh học phân tử hiện đại Sự ra đời của cấu trúc Watson-Crick đã khắc phục được tấ t cả các khiếm khuyết của các cấu trúc do các nhà khoa học khác đề xuất trước đó và lý giải được tấ t cả các hoạt động chức năng của DNA cũng như cơ chê phân tử của bệnh lý di truyền Ngày nay, người ta n h ậ n thấy rằn g DNA và RNA tồn tạo ở một vài dạng cấu trúc xoắn kép khác n h a u phụ thuộc vào nhiều yếu tô như: độ ẩm, sự có mặt của các cation hay trìn h tự các base

2.1.2 C ấu trú c W a tson -C rick (B-DNA)

Cấu trúc B-DNA được xác định bởi nhiễu xạ tia X với sự có m ặt của Na+ và

ỏ độ ẩm 92% Đây là cấu trúc tự nhiên của DNA bởi lẽ DNA ở đầu tinh trùng

tồn tại ở dạng cấu trúc này (h ìn h 1.4) Cấu trúc B-DNA của Jam es VVatson và

Francis Crick có các đặc điểm sau:

- Bao gồm hai chuỗi polynucleotid xoắn vặn xung quanh một trục theo hai chiều ngược n h au theo quy tắc bàn tay phải vài đường kính vòng xoắn khoảng

20 Ẩ Cấu trúc xoắn vặn của hai chuỗi polynucleotid tạo cho DNA có một cấu trúc bển, hai chuỗi không thế tách rời khỏi n hau nếu như không được mỏ xoắn Trục xoắn là các base còn các chuỗi đương - phosphat thì cuộn xung quanh

- M ặt phảng của các base hầu như vuông góc với trục xoắn ốc Mỗi base của chuỗi này liên kết vối base của chuỗi kia bằng liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung Trong đó guanin và cytosin liên kết vối n hau bằng 3 liên kết hydro (G=C) còn adenin và thymin liên kết vối nhau bằng 2 liên kết (A=T) Do vậy mà

tr ậ t tự các base ở chuỗi thứ n h ấ t bổ sung với trậ t tự các base ở chuỗi thứ 2

13

- Mỗi một chu kỳ xoắn B-DNA lý tưởng gồm có 10 đôi base có độ dốc là 34Ả, góc xoắn vặn của mỗi cặp base là 36° trong đó mỗi base cách nhau 3,4 Ả Richard Dickerson và Horace Drew đã đo lại và cho thấy mỗi chu kỳ xoắn là

10,1 đôi base và góc xoắn vặn của mỗi cặp base là 35,6°

H ình 1.4 Mô hình mô phỏng cấu trúc B-DN A

2.1.3 Các d a n g câu trú c x o ắ n k h á c củ a a c id n u cle ic

- Dạng A-DNA: cấu trúc A-DNA rộng hơn, vòng xoắn theo quy tắc bàn tiy

phải từ phải qua trái dẹt hơn so với cấu trúc B-DNA Một chu kỳ xoắn của A-

DNA có 11 đôi base có độ dốc là 28 Ă và góc xoắn vặn của mỗi cặp base so 'ới

trục là 20° Cấu trúc này được thấy ở dạng bào tử của vi khuẩn Gram dươrg

Đây là cơ chế tự bảo vệ của vi khuẩn vì DNA ở dạng này bền vững với lia cực tím

- Dạng Z-DNA: có cấu trúc xoắn theo quy tắc bàn tay trái Mỗi chu kỳ xoín

có 12 đôi base với độ dốc là 45 Ả Chức năng sinh học của dạng Z-DNA chia

được khẳng định song có giả thuyết cho rằng có sự biến đổi th u ậ n nghịch từ cíu

trúc B-DNA sang Z-DNA trong một số điều kiện n h ấ t định như: tái tổ hợp g3n

trong quá trình thể hiện gen

Nguyên tắc bàn tay trái

Đường rãnh chính Hẹp và sâu Rộng và sâu Phẳng

Đường rãnh phụ Rộng và nông Hẹp và sâu Hẹp và sâu

Gốc đường C3'-endo C 2 ’-endo C 2’-endo đối với

pyrim idin và C 3 ’-endo đối

với purin Liên kết glycosidic Ngược Ngược Ngược đối với pyrimidin

và thuận đối với purin

2.1.4 Các lực h ó a hoc và cấu trúc là m bên vữ ng cấ u trú c a c id n ucleic

- DNA không có cấu trúc phức tạp như các phân tử protein bởi lẽ nó chỉ có một số lượng giới hạn các hình dạng cấu trúc bậc 2 trong khi không có cấu trúc bậc 3 và bậc 4 Điều này có thể được giải thích bằng sự đa dạng về đặc tính hóa ]ý của 20 acid am in trong phân tử protein so với vẻn vẹn chỉ 4 loại base khác nhau trong phân tử DNA Tuy nhiên rấ t nhiều phân tử RNA có cấu trúc bậc 3 Các lực tham gia hình thành cấu trúc phân tử của acid nucleic giông như các lực tham gia bình ổn cấu trúc phân tử protein Tuy nhiên phương thức kết hợp giữa các lực tương tác đã tạo cho acid nucleic có đặc tính hoàn toàn khác so với protein

- Cấu trúc của các gốc đường -phosphat: cấu trúc của đơn vị nucleotid có 6 góc xoắn của k h ung đường phosphat và một góc xoắn là hướng của base về liên kết glycosidic Bảy góc độ này tạo cho mỗi nucleotid trong chuỗi polynucleotid

độ linh động rấ t cao Tuy nhiên trên thực tế, cấu trúc của chuỗi polynucleotid lại r ấ t bển vững và ổn định

- Cặp base: các cặp base liên kết chặt vối nhau nhằm duy trì cấu trúc xoắn kép của acid nucleic Liên kết hydro không có tác dụng làm bền vững phân tử DNA mặc dù nó có vai trò quyết định cho sự cặp đôi theo nguyên tắc bô sung

15

Trong khi đó, liên kết kỵ nước đóng vai trò quyết định trong việc duy trì cấu trúc ổn định của DNA.

- Cụm các base và tương tác kỵ nước: các n h â n purin và pyrimidm có khuynh hướng hình th àn h các chồng m ặt p hang song song Các m ặt phang này tương tác với n hau bằng các liên kết kỵ nước Đây chính là yếu tô" đảm bảo cho cấu trúc bền vững của DNA Tuy nhiên, cho tối nay các lực liên kết kỵ nước này vẫn chưa được hiểu hết

- Tương tác ion: về m ặt lý th uyết thì sự bền vững của cấu trúc acid nucleic

phải tính đến vai trò của các sự tương tác tĩn h điện của các gốc phosphat mang điện Thực nghiệm cho thấy Tm tỷ lệ th u ậ n với nồng độ cation Mg2+ đóng vai

trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc của nhiều loại RNA như RNA vận chuyên, RNA ribosom

- Cấu trúc siêu xoắn của DNA: tấ t cả các p h ân tử DNA của vi khuẩn và đa

số DNA của virus có cấu trúc hình vòng Cấu trúc DNA vòng cũng x uất hiện ở

trong ty thể mà ty thể thì có ỏ hầu hết các tế bào bậc cao Mỗi đầu của chuỗi DNA đơn liên kết lại vói n hau tạo ra cấu trúc vòng khép kín Một sô’ cấu trúc DNA hình vòng này có hình dạng siêu cuộn, siêu xoắn vặn hay siêu xoắn ốc Cấu trúc này đôi khi được gọi là cấu trúc bậc 3 của DNA Trạng th á i siêu xoắn của phân tử DNA được điều hòa bởi nhóm các enzym có tên là topoisomerase bao gồm hai nhóm khác n hau là topoisomerase I và II

2.1.5 Sự biến tín h th u ậ n n g h ịc h

Khi dung dịch DNA bị đun nóng trên n hiệt độ riêng thì cấu trúc tự nhiên

sẽ bị phá hủy, hai chuỗi bổ sung sẽ tách khỏi n h a u và sẽ tạo ra cấu trúc sỢi đơn

xoắn ngẫu nhiên (Hình 1.5) Quá trìn h biến tín h này sẽ làm thay đổi tính chất

lý học của DNA chẳng hạn như độ nhớt của DNA ở trạ n g thái biến tính sẽ bị giảm đáng kể Khi DNA bị biến tính, độ hấp th ụ m ật độ quang ở vùng bưốc sóng

tử ngoại tăng lên đáng kể (khoảng 40%)

Quá trình biến tính của DNA được biểu diễn bằng đương cong nóng chảy

và điểm uốn của đường cong này được gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm), là nhiệt

độ mà vào tại điểm đó 50% chuỗi DNA đôi được tách th à n h các sợi đơn Giá trị

Tm phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ ion, pH, nồng độ phân tử của base G và

c Ba liên kết hydro giữa G và c bền vững hơn so với hai liên kết hydro giữa A

và T

Nếu làm lạnh n hanh và duy trì n h iệt độ khoảng 25 °c dưới T m trong một

khoảng thời gian n h ất định thì hai sợi đdn DNA bị biến tính sẽ b ắ t cặp trỏ lại

theo nguyên tắc bổ sung để trở về trạ n g thái y nguyên như ban đầu (J u liu s

M armur, 1960) Sự liên kết bổ sung giữa DNA và RNA gọi là sự lai hóa và sự lại

hóa DNA-RNA sẽ kém bền vững hơn so với DNA-DNA

1.2 Câu trú c acid r ib o n u c le ic (RNA)

1.2.1 Cấu trú c RNA

Cũng như DNA, liên kết chính trong RNA là liên kết 3’, 5’ phosphodieste RNA là một chuỗi nucleotid xoắn đơn, cấu trúc bậc 2 do sự xoắn kép của hai đoạn bổ sung nhau trên p h ân tử RNA Ngoài ra RNA cũng có cấu trúc bậc 3 do phân tử RNA tồn tại nhiều liên kết hydro

1.2.2 Các lo ạ i RNA

- RNA vận chuyển (tRNA), chiếm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào tRNA có hai chức năng và do gôc OH ở đầu 3’ của bộ ba CCA-OH không tham gia xoắn kép và bộ ba đối mă đảm nhiệm:

+ Hoạt hóa acid am in để p hân tử này dễ dàng tạo liên kêt peptid và vận chuyên acid amin này đến vị trí tổng hợp protein

+ N hận biết mã trê n p h â n tử mRNA

Mỗi một tRNA có khả n ăn g vận chuyến một acid amin song một số acid amin lại có hai tRNA tRNA có chiều dài khoảng từ 65 đến 110 ribonucleotid và

có cấu trúc chung hình lá chẻ ba với nhiều vùng chức năng khác nhau

- RNA ribosom (rRNA), chiếm khoảng 80% tổng số RNA của tê bào rRNA

có nhiều loại khác n hau về trọng lượng p h â n tử và cấu trúc phức tạp ơ tê bào

không n hân có rRNA 5S với 120 mononucleotid; rRNA 23S có 3200 mononucleotid và rRNA 16S gồm 1540 mononucleotid ơ tê bào có nhân, có các loại rRNA 5S; rRNA 5,8S với 160 mononucleotid; rRNA 18S gồm 1900 mononucleotid và rRNA 28S có 4700 mononucleotid 0 ty thê của tê bào động vật có rRNA 12S và rRNA 16S.

- RNA thông tin (mRNA), chiếm khoảng 5% tổng số RNA của tê bào mRNA là chất trực tiếp mang thông tin di truyền từ nhân đến ribosom ở bào tương, ở tê bào có nhân, mRNA có cấu trúc bắt đầu là phân tử 7-methyl guanosin 5’-triphosphat (gọi là mũ), rồi đến một đoạn nucleotid không mã hóa acid amin sau đó mối đên đoạn nucleotid mã hóa khỏi đầu bằng bộ ba mã hóa AUG Kết thúc đoạn phiên dịch là một trong ba bộ ba mã hóa UAA, UAG, UGA, rồi tiêp đoạn không phiên dịch thứ 2 và cuôi cùng là đuôi poly A với khoảng 20-

200 gốc adenosinmonophosphat.

RNA nhỏ của n hân (small nuclear RNA/snRNA) có kích thước khoảng 60-

300 nucleotid Người ta p hát hiện được hàng chục các loại snRNA khác n hau và

có 5 loại tồn tại nhiều trong nhân tê bào VỚI tên gọi là snRNA U l; U2; U4; Ư5

và snRNA U6 Các snRNA tham gia trong cơ chê cắt bỏ đoạn intron trong quá trình hoàn thiện mRNA bằng cách cắt và nôi các exon cũng như intron

Ribozym (RNA enzym) là các phân tử RNA có hoạt tính enzym được p h át hiện bởi Thomas R Cech (1980) và đạt giải thưởng Nobel năm 1989 Các ribozym có khả năng thủy phân các liên kết đặc hiệu trong phân tử RNA Một

số các ribozym có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tạo ra các thuốc điều trị dựa trên nguyên tắc thủy phân hoặc bất hoạt trực tiếp lên các RNA ngay sau khi mới được tổng hợp Đồng thời công nghệ ribozym cũng tạo ra các bước đột phá trong việc nghiên cứu chức năng của bộ gen cũng như tạo các vật liệu cảm

biên sinh học Một sô' ribozym tồn tại trong tự nhiên như: Peptidvl transferase

23S rRNA, RNase p, nhóm 1 và nhóm II introns, ribozym nhánh GIR1, ribozym hỉnh kẹp tóc leadzyme, ribozym hình đầu búa, ribozym HDV, ribozyrn CPEB3 ở động vật có vú, ribozym v s , ribozym glniS, ribozym CoTC.

Ngày nay các nh à khoa học đã tông hợp được nhiều loại ribozym khác

n hau có hoạt tính sinh học tương tự như các ribozym có nguồn gốc từ tự nhiên

B CẤU TRÚC GEN VÀ CÁC YẾU T ố ĐIỂU HÒA HOẠT ĐỘNG CỦA GEN ở TẾ BÀO CÓ NHẢN

Trước khi tiến hành chuyển gen vào trong tê bào hoặc động vật, chúng ta cần phải cân nhắc đến nhiều vếu tố tác động hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp đên quá trìn h biểu hiện gen như: cấu trúc CỈS-DNA, gen điều khiển (promoter), gen tàng cường (enhancer), các tín hiệu cắt nối gen (splice signals), tín hiệu polyadenin hóa (polyadenilation signals) và các tín hiệu quyêt định đòi sống bán hủy của RNA thông tin (mRNA) Tất cả các vếu tố trên liên quan chặt chẽ đên tính đặc hiệu tê bào của các gen sẽ được biểu hiện Hơn nữa, các yếu tố này còn có sự tương tác VỚI nhau và VỚI các yếu tô' khác đế tạo nên các yếu tô tái tô

hợp của một sinh vật mỏi Chính vì vậy, chúng ta phải chặt chẽ tuân thủ nguyên tắc khi thiết kê cấu trúc gen.

1 GEN ĐIỂU KHIÊN VÀ GEN TĂNG CƯỜNG (Prom oter and Enhancer)

Bàng kỹ th u ậ t cắt và phân đoạn gen sử dụng công nghệ DNA tái tố hợp, người ta đã phân tích cấu trúc phân tử của gen điều khiên ở tê bào có nhân

(eukaryotic promoter) và qua đó phát hiện ra yếu tô hoạt động dạng cis (cis■

actmg elements) Yếu tô này điều hòa quá trình biêu hiện gen và có tính đặc hiệu tê bào Các yêu tô này được gọi là yếu tô" tăng cường Các yếu tô" tăng cường tham gia vào việc hình th àn h khung cấu trúc cho sự tương tác DNA/protein đê tạo nên các cấu trúc của chromatin có độ trậ t tự cao hơn nhằm mục đích điều hòa quá trình sao chép gen đích từ các gen điểu khiển của RNA polymerase (RNA polymerase promoter) Việc xác định các yếu tô tăng cương cho phép phân

lập và xác định đặc tính của các yếu tố hoạt động dạng trans (trans-actmg

factor) Các yếu tô này có khả năng gắn hoặc thông qua mối tương tác nào đó đê tác động đến hoạt động của gen điều khiển hoặc gen tăng cường Khi đánh giá vai trò của các protein tham gia điều hòa sao chép và cơ chê tác động của chúng, các nhà khoa học đã khang định rằng cả gen điều khiển và gen tăng cường đểu đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện gen

Nghiên cứu đầu tiên về gen điều khiển của herpes simplex thymidine kinase (HSVtk) năm 1982 và của (3- globin người (1981) cho thấy cấu trúc đồng

bộ của các yếu tô" tham gia phức hợp điều khiển của RNA polymerase II Thành phần quan trọng n h ất của cấu trúc điêu khiển này là vị trí mũ của mRNA (mRNA cap site), vị trí được coi là khởi điểm của trình tự mRNA Ngoài ra còn

có khung mã TATA (TATA box), vị trí này thường ở vị trí khoảng -25 tính từ mũ mRNA VỊ trí khung mã TATA chính là nơi khởi đầu quá trìn h dịch mã Trình

tự nucleotid ở phía trước so vối khung mã TATA thường khác nhau giữa các gen điều khiển Ví dụ đối vói gen điều khiển của HSVtk và (3- globin người thì cấu

trúc trình tự CCAAT thường thấy ở các vị trí khác nhau nằm trong

khoảng -70 đến -80 tính từ khung mã TATA Trong khi cũng tại các vị trí này của các gen nội chuẩn (house keeping gene) thì lại có các đoạn nucleotid lặp lại giàu GC Các phân đoạn lặp lại này là cấu trúc bắt buộc của trình tự của gen điêu khiển ỏ tê bào có nh ân để đảm bảo cho quá trình phiên mã hoạt động

Trong một sô trường hợp ngoại lệ, khi thiết kê phức hợp biểu hiện gen chúng ta phải lựa chọn giữa các yếu tô" tăng cường hoặc các yếu tố tái tô hợp

Khi nghiên cứu bộ gen của SV40 và retrovirus ở chuột (M urine retroviruses)

người ta phát hiện ra rằng các phức hợp gen tăng cường của chúng rấ t đặc biệt, bao gồm nhiều yếu tô biểu hiện gen Vai trò của các yếu tô" này hiện nay chưa được biết đầy đủ song chúng ta có thế đưa ra một sô" nét đặc trưng n h ất của phức hợp gen tăng cường:

Là phức hợp lốn, thường có các đoạn trìn h tự lặp lại và có thể có các chứcnăng riêng biệt

19

Có khả năng thể hiện chức năng mặc dù nằm ở những vùng gen xa cách tới vài ngàn đôi base.

Hoạt động theo hướng n h ất định

Có thế hoạt động theo phương thức độc lập tại chỗ (tại vùng gen mã hóa) hoặc ở xa (phía dưối của vùng này) Tuy nhiên, phức hợp gen tăng cường

này chỉ có khả năng hoạt động khi ở dạng cấu trúc cis Nếu có một vài

gen điều khiển nằm cạnh nhau thì gen tăng cường sẽ tác động trực tiếp lên gen điều khiển ở gần nhất

Có tính đặc hiệu tổ chức hoặc phụ thuộc vào giai đoạn biệt hóa của tê bào

Phức hợp gen tăng cường được xác định là liên kết với cả virus và các gen của tê bào

1.1 Một sô phức hợp gen tă n g cường

1.1.1 Phức hợp gen tă n g cư ờ n g có nguồn gốc viru s rviral enhancer)

- Gen tă n g cư ờ n g sv 40: nằm gần ở vị trí khởi đầu của sao chép Gen

này bao gồm 3 đơn vị chức năng A, B và c Mỗi đơn vị này phối hợp vối các đơn

vị khác hoặc với nhau để thúc đẩy quá trình sao chép Vị trí của gen tăng cường SV40 ảnh hưởng nhiều đến quá trình biểu hiện gen trong cùng một loại plasmid Đồng thời có các yếu tô" liên kết vói gen tăng cường đóng vai trò hoặc là hoạt hóa hoặc là ức chê đôi vối quá trình phiên mã của gen đích mà nó tham gia điều hòa

- Gen tă n g cư ờ n g c ủ a P olyom a: nằm ở vị trí khởi đầu của sao chép

giông như gen tăng cường SV40 Tuy nhiên có một điểm khác biệt là hoạt động của gen này cần có sự tham gia của các yếu tố điều hòa Gen điều hòa polyoma

bình thường ở trạng thái bất hoạt ở dòng tê bào F9 EC chưa biệt hóa và chỉ

chuyển sang dạng hoạt động khi tê bào đã được biệt hóa Tuy nhiên, dạng đột

biến của virus Polyoma lại có thể nhân lên ở cả tê bào chưa biệt hóa lẫn tê bào

đã biệt hóa Sự thay đổi trình tự nucleotid ở thể virus đột biến này là những đột

biên n hân đoạn hav các đột biến khác xảy ra ở vùng khởi đầu sao chép hoặc tại vùng gen tăng cường Những đột biến này đã làm tăng cường mạnh mẽ quá trình sao chép của bộ gen virus Người ta đã xác định được các vị trí đột biên

này ở gen tàng cường của Polyoma Chính vì vậy, người ta cho rằng các đột biến

điểm đã tạo điều kiện cho các tác nhân trong tế bào hoặc ngoại bào khác thúc đẩy quá trình sao chép gen và biệt hóa tế bào

- Gen tă n g cư ờ n g c ủ a retro v iru s: các retrovirus cũng mang các gen tăng cường trong đó phải kể đến các gen tăng cường của virus M urine leukemia

và sarcoma Các gen tăng cường của retrovirus có tính đặc hiệu tê bào Ví dụ các gen tăng cường của virus Mononey murine leukemia (MoNuLV) và của virus

Monoley m urine sarcoma (MoMuSV) có tính đặc hiệu tê bào khác với gen tăng

cường của virus Friend m urine leukemia mặc dù cả 3 gen tăng cường này đều có

hoạt tính tương đương nhau ơ tê bào hồng cầu non Hai gen tăng cường MoMuSV và MoMuLV có hoạt tính cao hơn gen tăng cường Friend MuLV tối 20-40 lần ở tế bào lympho T Kết quả nghiên cứu thực nghiệm chuyển gen retrovirưs vào tê bào đã đưa ra những bằng chứng khoa học về tính đặc hiệu tô chức của gen tăng cường và gen điều khiển.

- Gen tă n g cư ờ n g của v ir u s P a p illo m a : virus Papiỉỉoma của người và

bò có các phức hợp gen tăng cường và đều có tính đặc hiệu tố chức Các tê bào nhiễm virus này sẽ duy trì DNA của virus ở trong nhân ỏ dạng plasmid Ba yếu

tố hợp th à n h phức hợp gen tăng cường điểu hòa hoạt tính sao chép của virus

Papilloma (BPV) nằm từ ví trí 59 của đầu 3’ đến đầu đoạn polyadenin ở đầu

vùng gen sao chép của virus Đầu 5’ của gen tăng cường nằm cạnh gen điều

khiển của virus và có thê trở th àn h dạng hoạt hóa trans bởi protein E2 Virus

Papillom a người (HPV) type 18 có ba vùng phức hợp gen tăng cường trong đó

hai phức hợp (IE2, IE6) là phức hợp tăng cương cảm ứng (inducible enhacer) và một phức hợp tăng cường cô định (constitutive enhancer) Các gen tăng cường này hoạt động độc lập với nhau và phụ thuộc vào các giai đoạn khác n hau trong chu kỳ sông của virus

- Gen tă n g cư ờ n g c ủ a v ir u s viêm g a n B (Hepatitis B)\ nằm ở vị trí 3’

của gen mã hóa kháng nguyên bê mặt của virus viêm gan B Các nghiên cứu đã khắng định rằng gen tăng cường của HBV có khả năng làm tăng mức độ biểu hiện của các gen được điều hòa bởi gen tăng cương hoặc gen điều khiển SV40 Song điều này chỉ đúng khi gen tăng cương của HBV nằm ở trong vùng sao chép Hiện nay vẫn còn nhiều tra n h luận về cơ chê quyêt định tính đặc hiệu tê bào của gen tăng cường này

- Gen tă n g cường củ a v iru s g â y suy g iả m m iễn d ịc h ở người (Human

immunodeficiency ưirus): virus này có hệ thông điều hòa hết sức phức tạp liên

quan đến protein hoạt hóa trans (írans-activating protein viết tắ t là tat) và yêu

tố hoạt hóa cis đồng loại (cís-acting element viết tắ t là tar) Mặc dù yếu tố đồng loại tar không thuộc phức hợp gen tăng cường, song nó có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình biểu hiện gen Tat cùng với tar có khả năng làm tăng

mRNA của virus và quá trìn h sinh tổng hợp protein lên khoảng 100 lần, trong

đó tăng quá trình sao chép RNA khoảng 20 lần và tăng quá trình phiên mã lên

5 lần Thêm vào đó HIV còn có gen tăng cường xác thực (authentic enhancer) nằm ở phía trước vùng gắn của S P l ở giữa U3 của LTR (vị trí -137 đến -17) Gen tàng cường này không đặc hiệu và có thể thay thê bằng gen tăng cường RSV hoặc SV40

- G en tă n g cư ờ n g c ủ a C y to m e g a lo v iru s người (HCMV'): bộ gen của

virus này có kích thưốc 135 kb và mang gen tăng cường có hoạt tính thúc đẩy quá trình sao chép rấ t mạnh Gen tăng cường của HCMV nằm ỏ phía trước vùng bắt đầu sao chép (trong khoảng -525 đến -118) có hoạt tính mạnh hơn SV40 khoảng vài lần và ít tài liệu đề cập đến tính đặc hiệu tế bào và tính đặc hiệu tố chức của gen này

21

1.1.2 Phứ c hợp geti tă n g cường có nguồn gốc t ế bào (Cellular enhancerj

Các nghiên cứu quá trình biểu hiện gen của tế bào đã p h á t hiện ra một số lượng lốn các gen tăng cường có nguồn gốc tế bào, và số lượng các gen này được

phát hiện ngày càng tăng Các gen tăng cưòng này được chia th à n h hai nhóm: i)

nhóm các gen tăng cường liên quan đến các gen của hệ thống miễn dịch như gen

mã hóa chuồi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể, các gen hòa hợp tố chức, các gen của thụ thể tê bào T, các gen mã hóa interferon p và gen mã hóa th ụ thể

của interleukin -2; và ii) nhóm các gen tăng cương liên quan đến các gen còn lại của cơ thê như P-actin người, creatinin kinase ngưòi, prealbumin, elastase I,

methallothionein, collagenase, a-fetoprotein, Ỵ-globin và P-globin, c-fos, c-ras, insulin và các phân tử kết dính t ế bào (NCAM)

1.2 Gen điều k h iển và gen tă n g cường cảm ứng (Inducible promoter and

enhancer)

Đại đa sô các gen đều không được biểu hiện liên tục mà chúng chỉ được hoạt hóa cảm ứng hoặc ức chê trong những thời điểm hoặc giai đoạn nào đó trong cuộc đời của cá thể Nhờ những hiểu biết vê cơ chế quá trinh ức chê và

hoạt hóa gen, chúng ta có thế kiểm soát in vitro quá trình này thông qua việc

thêm hoặc loại đi những tác n hân điều hòa ở môi trường nuôi cấy tê bào Có hai yếu tô điều hòa được ứng dụng rộng rãi trong các thực nghiệm chuyển gen ở tê

bào có nhân là: i) các yếu tố điều hòa biểu hiện metallothionein và ii) các yếu tô

điêu hòa đáp ứng glucocorticoid

1.3 Cơ c h ế h o ạ t đ ộng của gen tă n g cường

Một câu hỏi đặt ra: gen tàng cường hoạt động theo cơ chê phân tử nào? Chúng ta biết rằng gen tăng cường có khả năng ảnh hưởng r ấ t m ạnh đến quá trình sao chép kể cả khi nó được đặt ở xa vị trí của gen điều khiển Nhiều bằng chứng khoa học đã cho thấy rằn g cùng một gen tăng cường song ỏ trạng thái

phức hợp (multimer) thì gen này có hoạt tính cao hơn rấ t nhiều so với ở dạng

cấu trúc đơn (monomer) Thêm vào đó, ngày nay người ta đã phân lập được nhiều loại protein gắn với gen tăng cường một cách đặc hiệu và thông qua đó thúc đẩy hoạt tính của các gen này

Bảng 1.2 Các gen điều khiển và gen tăng cường cảm ứng

Strom elysin Phorbol ester Angel và cs., 1987

Gen m urine MX Interíeron,

Virus bệnh Nevvcastle

Hug và cs., 1988

M HC lớp 1 gen H-2Kb Interteron Blanar và cs., 1989

SV40 large T antigen

VVilliams và cs., 1989

Proliterin Phorbol Ester-TPA M ordacg và Linzer, 1989

Yếu tố hoại tử khối u (TN F) PM A Hensel và cs., 1989

Gen Thyroid stim ulating

horm on a

Thyroid hormon Chatterjee và cs., 1989

Có hai cách lý giải cơ chê hoạt động của gen tăng cường: i) Tác dụng xa

của gen tăng cưòng được giải thích là do gen này tác động lên mối tương tác gen-protein, thông qua đó ảnh hưởng đến phức hợp sao chép (gồm RNA polymerase, các protein đặc hiệu của gen điều khiển ỏ vi trí của gen này) Mối tương tác này liên cỊ&an đến cấu trúc thòng lọng của DNA (loop structure) Các nghiên cứu cho rằ n g do khoảng cách giữa các phức hợp sao chép tối vị trí cấu trúc thòng lọng của DNA quá gần nên tại vị trí uổn lượn của DNA phải có vị trí gắn của các protein đặc hiệu và lẽ dĩ nhiên cấu trúc của các phức hợp DNA-

protein này phải thích hợp với cấu trúc xoắn kép tại vị trí đó; ii) Có một phân tử

tru n g gian đóng vai trò tạo phức hợp DNA-protein để hình th àn h một phức hợp lớn mà không cần các cấu trúc thòng lọng uốn lượn của DNA Một sô" phân tử tru n g gian đã được p h át hiện trong quá trình nghiên cứu sao chép thực nghiệm

in ưitro.

Hai mô h ình trê n đã lý giải cơ chế của sự tương tác giữa gen điều khiển và gen tăng cường Tuy nhiên, các mô hình trên không lý giải được cơ chế của sự tương tác xa giữa các gen điều khiển và gen điều hòa Một sô" các nhà khoa học

đã giải thích rằn g sở dĩ có sự tương tác xa giữa gen điều khiển và gen điểu hòa

là nhờ sự hình th à n h cấu trúc thòng lọng Với cấu trúc này, hai gen nằm xa

n h au (ở cấu trúc bậc 1) song lại có thể gần nhau (ở cấu trúc bậc 3) Sự tương tác này cho phép hình th à n h một phức hợp bền vững hơn, dễ điều hòa hơn đôi với những phức hợp lớn đa phân tử, có nhiều gen điều hòa và gen điều khiển tương tác với nhau

2 MỐI TƯƠNG TÁC GIỮA GEN ĐIÊU KHIEN v à INTRON

Đây là một trong số những hiện tượng khó giải thích về các yếu tô' ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của các cistron tái tổ hợp Tuy nhiên, những

23

bằng chứng thực nghiệm đã chỉ ra rằng điều kiện cần thiết đối vói intron có chức năng trong cistron tái tổ hợp là nó phải phụ thuộc gen điều khiển Điều này có nghĩa là khi chuyển gen thì một số gen điều khiển hoạt động hiệu quả hơn khi nó được kèm theo gen chứa intron.

Trong thí nghiệm chuyển gen của các cistron tái tố hợp, cần thiết phải có

m tron khi quá trình sao chép được điều khiển bởi gen điều khiển/gen tăng cưòng immunoglobulin |i tái tố hợp Mặc dù không cần một intron chuyên biệt nào song hầu như sự hiện diện của intron là một trong những điều kiện bắt buộc đê quá trình sao chép có thể xảy ra Quá trình biểu hiện gen (3-globin được điểu khiển bởi gen điều khiển SV40 thì cũng cần phải có tín hiệu từ những đoạn gen đặc hiệu Tuy nhiên, những thông tin hỗ trợ từ những đoạn gen này không thê làm quá trình biêu hiện gen [3-globin được ổn định khi nó được đặt ở vị trí cuối (downstream) của vùng polyadenin Thêm vào đó, đoạn gen được lấy từ gen

mã hóa thymidin kinase của herpes simplex virus lại có khả năn g thúc đẩy quá trình biểu hiện của gen P-globin m ạnh lên tối 100 lần (không phụ thuộc ìntron) khi sử dụng gen điều khiển SV40 ở phía trước (early promoter)

Các nhánh của intron dường như đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ tích tụ của mRNA ở các cistron ngoại lai được đưa vào trong chuột chuyển gen Brinster và cs (1988) đã kiểm tra hoạt động của các thể lai giữa gen tăng cường/gen điều khiên/gen cấu trúc bằng cách gắn metallothionin I chuột

n hắt hoặc gen tăng cường/gen điều khiển của elastase I chuột công với gen mã hóa hormon tăng trưởng của chuột công Thế lai giữa metallothionein I của

chuột n hắt với hormon tăng trương được xác định ở gan bào th ai trong khi thể

lai elastase I của chuột cống/hormon tăng trưởng được xác định ở tụy Phương thức hoạt động của gen mã hóa metallothionein chuột n hắt đột biến vối chuỗi oligonucleotid tổng hợp làm tăng cường sự khác biệt của mRNA tạo ra bởi các gen đồng vị ngoại sinh và nội sinh Gen mã hóa P-globin ngưòi đưa vào chuột chuyên gen được kiểm tra song song Trong mỗi trường hợp, khoảng 10-100 lần mRNA được tạo ra từ phức hợp có chứa intron Hơn thê nữa, cả cấu trúc metallothinein chuột n h ắ t có hoặc không có intron đều có hoạt tính tương đương nhau khi được đưa vào các tê bào nuôi cấy Điêu này cho thấv intron có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình sao chép của các gen được chuyến Tuy nhiên cơ chế phân tử của sự tương tác giữa gen điều khiển/intron vẫn chưa được làm sáng tỏ

3 CÁC TÍN HIỆU THOÁI HÓA CỦA mRNA VÀ QUÁ TRÌNH POLYADENIN HÓA

Tính bền vững của mRNA ở tê bào rấ t khác nhau (từ 15 p h ú t đến hàng giờ) Một điều rõ ràng là tỷ lệ phân hủy của mRNA là chỉ sô quan trọng đê đánh giá sự điều hòa quá trìn h biểu hiện gen Các yêu tô kiểm soát tín h bền vững của mRNA chính là cấu trúc tự nhiên của Ĩ1Ó Sự phân hủy có tín h chất chọn lọc dường như là hậu quả của quá trình tương tác giữa endonuclease hoặc các yếu

tố khác với cấu trúc đặc hiệu nội phân tử của phân tử mRNA

Quá trìn h điều hòa một cách tinh tê sự thoái hóa mRNA được minh họa bởi sự gắn kết giữa phân hủy mRNA của histon H3 vối sự tái bản của DNA trong chu kỳ tê bào và bởi tốc độ quay vòng mRNA của tran sterin receptor cùng với sự có m ặt của sắt c ả hai sự kiện trên đêu góp phần tạo nên cấu trúc thòng lọng ở đầu 3’ của mRNA mã hóa protein.

Một số loại RNA có đời sông ngắn mang các đoạn gen giàu trình tự AU

(AU-rich sequences) ở đầu không mã hóa 3’ Những đoạn gen này có vai trò quan trọng về mức độ bền vững trong chuyển hóa của các loại RNA này Tuy nhiên, các vùng gen tương tự cũng được tìm thấy ỏ đầu không mã hóa 3’ của (3- globin nhưng phân tử này lại có độ bền vững cao Điều đó chứng tỏ rằng phải có những những vị trí chọn lọc đặc hiệu cho các đoạn gen giàu AU mà nó mang lại hoạt tính kém bển vững cho phân tử mRNA Những đoạn trình tự này được phát hiện nhiều ỏ các gen mã hóa lymphokin cũng như ỏ các gen gây ung thư (oncogene) như c-fos và c-myc Trong trường hợp vối c-fos, sự thoái hóa mRNA

có thê là do tập hợp của nhiều yếu tô' kém bền vững Việc loại bỏ vùng trình tự gen giàu AU cũng chưa đủ để duy trì tình trạn g bền vững của mRNA Riêng vùng gen mã hóa c-fos cũng có thế ở trình trạng kém bên vững mặc dù nằm trong một p hân tử bền vững Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng có hai vùng gen có hoạt tính kém bền vững hoạt động theo hai cơ chê khác nhau Trên thực

tế, các chất ức chế quá trình sao chép can thiệp vào quá trình thoái hóa của một RNA mang vùng gen c-fos giàu AU nhưng lại không can thiệp vào sự thoái hóa của cấu trúc chỉ mang vùng gen c-fos

Vai trò của đuôi poly-A trong việc duy trì tính bền vững của mRNA chưa

rõ ràng Kết quả nghiên cứu thực nghiệm cắt ngắn dần đuôi poly-A sau đó theo dõi tính bền vững của các phân tử mRNA này đều gợi ý rằng đuôi poly-A có tác dụng bảo vệ các phân tử mRNA trá n h khỏi sự thoái hóa nhanh Người ta phát hiện ra rằng phân tử mRNA có > 32 gốc polyadenin thì có độ bền vững tương đương với các mRNA có 150 gốc Tuy nhiên với những mRNA chỉ có 16 polyadenin thì tính bền vững giảm đi 10 lần so với những phân tử có 32-150 polyadenin Trong khi đó, không có một bằng chứng khoa học nào chứng tỏ đuôi poly-A có tác dụng ức chê quá trình biểu hiện gen Chính vì vậy, cistron tái tô hợp cần phải mang đuôi poly-A để thúc đẩy quá trình biểu hiện gen

Nhiều dấu hiệu đã cho thấy cơ chê phân tử của đặc tính bển vững hoặc kém bền vững của phân tử mRNA chính là sự tương tác giữa đoạn gen ở đầu 3’ không mã hóa giàu AU vối đuôi poly-A Phức hợp này được gọi là nhóm các protein gắn vối đuôi poly-A (poly-A binding proteins)

4 KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SAO CHÉP

Có một nhóm các yếu tô' ở dạng cis- và trans- ảnh hưởng đến hiệu quả của

quá trình phiên mã của mRNA ở tế bào có nhân (eukaryotic) Điều này đã cho phép tạo ra các cistron tái tổ hợp Nghiên cứu của Jang và cs (1988) đã chỉ ra

ràng đoạn gen từ virus Encephalomyocarditis có khả năng thúc đẩy quá trình

phiên mã của cả hai chuỗi gen mã hóa của bi-cistronic mRNA Đoạn gen này có

25

chức năng như là một vùng tiếp n h ận của ribosom Khi đoạn gen này nằm ở phía dưới (downstream) vùng gen mã hóa của một gen, nhưng lại nằm ở phía trên (upstream) vùng gen mã hóa của một gen khác nằm trên cùng một p hân tử mRNA, thì cả hai vùng gen mã hóa trên sẽ đều được phiên mã Việc thêm đoạn gen này vào phân tử DNA tái tổ hợp ở vị trí thích hợp sẽ cho phép quá trình phiên mã diẹn ra hiệu quả hơn đối với cả hai gen trên p hân tử bi-cistronic mRNA, thậm* chí có thể đối với ba gen ở dạng tri-cistronic mRNA.

Một yếu tô" khác là trans- có khả năng tác động m ạnh đến quá trình phiên

mã của mRNA được gọi là gen VA của adenovirus Khi đồng thời chuyển yếu tô" này cùng với các gen khác vào tê bào cos, quá trìn h phiên mã của các gen này

sẽ được tăng cường, song không phải đôi với tấ t cả các mRNA

Cơ chế giả định về vai trò gen VA của adenovirus trong quá trình phiên

mã liên quan đến một protein kinase có tên gọi là yếu tô ức chê hoạt hóa dsRNA (dsRNA-activated inhibitor) viết tắ t là DAI Sau khi nhiễm virus, hai p hân tử

mRNA của VA RNA polymerase III được biểu hiện ở mức độ r ấ t cao và điều này

cần thiết cho việc phiên mã mRNA một cách hiệu quả của adenovirus được nhiễm tiếp ở những lần sau đó VA RNA có khả năng gắn với DAI kinase và ức

chế sự hoạt hóa của dsRNA in vitro Có giả th iết cho rằn g sự xuất hiện của

dsRNA được tạo ra từ sự sao chép bất đối của bộ gen adenovirus, có tác dụng hoạt hóa DAI kinase đế phosphoryl hóa tiểu đơn vị của yếu tô bắt đầu sô" 2 hoạt hóa ở tế bào có nhân (active eukaryotic initiation factor 2) viết tắ t là eIF2 Kết quả cuối cùng là ức chế sự khởi đầu quá trìn h phiên mã VA RNA ức chế DAI kinase và do vậy ngăn cản sự ức chế quá trìn h khởi đầu sao chép Chính vì vậy,

VA RNA điều hòa mức độ của eIF2 hoạt hóa Trong các ứng dụng đặc biệt là đối với các thí nghiệm về tái bản nhanh ở tê bào c o s , việc bổ sung gen VA trong

hỗn hợp chuyển gen ở dạng cis- hay trans- là một công cụ hữu hiệu để làm tăng

quá trình biểu hiện các gen được chuyên đối với đa sô gen, song không phải tất các các gen điều khiển

5 CÁC HIỆN TƯỢNG LIÊN QUAN

Việc lần đầu tiên p hát hiện ra gen tăng cường đã thúc đẩy các n h à khoa học tìm hiểu sâu hơn nguồn gốc quá trìn h tái bản ở tê bào có n h â n như các yếu

tô" cis- nhằm mục đích tăng cường hiệu quả biến đổi của các gen chỉ điểm

(m arker gen) Trên thực tế, có nhiều nghiên cứu đã chứng m inh sự kết nối giữa chức năng của các gen tăng cường với quá trìn h tái bản DNA Nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra rằng chức năng của gen tăn g cường có tính đặc hiệu tê bào

Một số yếu tố khác cũng có thê ả n h hưởng đến chức năng của cistron tái tổ hợp khi được đưa vào trong tê bào và động vật Ví dụ: các kiểu methyl hóa DNA

có thể ảnh hương đến quá trìn h điều hòa p h át triển chức năng gen tăng cường

khi bộ gen của retrovirus hòa nhập vào dòng t ế bào gốc của chuột n hắt Ụ ahner

và Jaenisch, 1985) hoặc điều hòa p h át triển của gen immunoglobulin ở tế bào

nuôi cấy (Kelley và cs., 1988) Thêm vào đó, vị trí hòa n hập của cistron tái tô

hợp vào bộ gen của tê bào chủ có thể làm thay đổi đáng kể khả năng biểu hiện

của các cistron đó Hiện tượng này được gọi là sự tác động vị trí (position effect) Các bằng chứng khoa học cho thấy, sự tác động vị trí có thê được hạn chê nhò ứng dụng các kỹ th u ậ t làm tăn g cường sự hòa hợp của các phân tử tái tô hợp vào chính xác vị trí đích mong muôn trong bộ gen Việc ứng dụng kỹ th u ật này cho phép duy trì được quá trìn h điều hòa sinh học với độ tin cậy cao của các cistron tái tố hợp sau khi hòa hợp.

27

Chương II

GIÓI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PCR■ ■

1 GIỚI THIỆU CHUNG: PCR, MỘT MÁY PHOTOCOPY

PCR sử dụng một số th à n h phần cơ bản mà chúng ta sử dụng hàng ngày

trong phòng thí nghiệm đê th u được một sô" lượng lớn các bản sao chép của một đoạn DNA trong ông nghiệm PCR được coi như một “máy photocopy” Mặc dù trông có vẻ đơn giản, song PCR là một quá trình phức tạp với sự có mặt của rấ t nhiều các chất tham gia p hản ứng Một S(D chất tham gia phản ứng có nồng độ

rấ t thấp ở thời điểm ban đầu như chất khuôn (template), nhưng sau đó tăng lên

nhanh chóng trong suốt quá trìn h xảy ra phản ứng Trong khi đó, nồng độ một sô" chất tham gia phản ứng khác thay đổi không đáng kế trong suốt quá trình diễn ra phản ứng như dNTPs, mồi

Chỉ một thòi gian ngắn sau phát minh của Kary Mullis, kỹ th u ật PCR đã nhanh chóng được hoàn thiện để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học p hân tử Ảnh hưởng của kỹ th u ậ t PCR trong nghiên cứu y sinh học vô cùng lớn Nó được COI như động lực thúc đẩy sự p hát triên nghiên cứu về các gen chuyên biệt cũng như toàn bộ bộ gen của cá thể Ngày nay, với kỹ th u ậ t PCR chúng ta hầu như có thê phân lập và khuếch đại bất kỳ gen nào trong cơ thể sinh vật Đây chính là điểm mấu chốt trong các dự án giải

mã bộ gen của các sinh vật Một khi đã phân lập được từng gen riêng biệt, chúng ta có thê tạo dòng gen hay gây các đột biến và làm thay đổi các gen này Đồng thời chúng ta cũng có thể p hát triển các kỹ th u ậ t chẩn đoán các dạng đột biến gen để xác định các thế đột biến Hiện nay, nhiều kit hóa chất phục vụ cho

kỹ th u ậ t chẩn đoán PCR đã được thương mại hóa

2 LỊCH SỬ CỦA KỶ THUẬT PCR

Năm 1971, Khorana và cộng sự đã mô tả phương pháp tiếp cận đê khuêch đại một vùng trong chuỗi đôi DNA sử dụng hai cặp mồi được thiết kê đê đầu 3’

của chúng hướng về n hau (Kleppe và c s , 1971) Tuy nhiên khái niệm sử dụng

hướng tiếp cận như vậy đê khuếch đại đoạn gen đã không thành công trong suốt khoảng 12 năm tiếp sau đó M ùa xuân năm 1983, Kary Mullis, người phát minh

ra kỹ th u ậ t PCR đã p hát hiện ra các nguyên tắc cơ bản giúp ông có thê phát triển và triển khai kỹ th u ậ t này tại Cetus Corporation, nơi ông làm việc Kỹ

th u ậ t này đã được thương mại hóa và cuối cùng thì được bán bản quyển vào năm 1991 với giá 300 triệu đô la Mỹ

Tiềm năng to lớn của kỹ th u ật PCR đã được phát hiện, và chỉ trong một thời gian ngắn, kỹ thuật này đã được đầu tư đê phát triển và ứng dụng rất nhanh, đem lại nhiều lợi nhuận cho các công ty có bản quyến vê công nghệ.

N hững mốc thời gian chính trong quá trình p hát triển kỹ thuật PCR:

- 1953 Watson và Crick công bô công trìn h mô tả cấu trúc xoắn kép của phân tử

DNA làm cơ sở khoa học cho sự sao chép và đạt giải thưởng Nobel 1962 (Watsort

J.D, Cnck F H c 1953).

- 1958 A rthur Kornberg phân lập, nghiên cứu enzym DNA polymerase I từ E coli (Pol I) và cơ chế sinh tống hợp DNA, giải thưởng Nobel 1959 (Lehman I R and Maurice J Bessm an và cs., 1958).

- 1969: Brock và Freeze mô tả vi k huẩn Therm us aquaticus chịu nhiệt (Brock,

T /) , Freeze, H., 1969).

- 1970: Klenovv and Henningsen đã tạo ra đoạn Klenovv bằng enzym thủy phân

hoạt tính exonuclease đầu 5 của E.coli pol I (Klenou), H., và Henningsen, 1970).

- 1983: Kary Mullis (Tập đoàn Cetus) phát hiện ra PCR.

- 1985: Bài báo đầu tiên mô tả kỹ th u ậ t PCR sử dụng phân đoạn Klenow của

DNA polymerase I (Saiki và cs., 1985).

- 1986: Tập đoàn Cetus và Perkin Elmer thiết lập công ty liên doanh (Perkin

Elmer Cetus) để nghiên cứu chế tạo thiết bị và sản xuất hóa chất cho thị trường công nghệ y sinh học

- 1988: Bài báo đầu tiên mô tả việc sử dụng Taq DNA polymerase trong phản

3 KỶ THUẬT PCR LIÊN QUAN ĐỂN q u á t r ì n h s a o c h é p DNA

PCR sao chép DNA trong ống nghiệm sử dụng các yếu tô cơ bản của quá trình sao chép diễn ra trong tự nhiên, ở tê bào sông, quá trình sinh tổng hợp protein diễn ra liên tục và quá trình sao chép củng diễn ra song song và đồng thời Nói một cách đơn giản là trong quá trình sao chép, các sợi DNA tách nhau

ra và mỗi sợi của phân tử DNA bô" mẹ lại làm khuôn để tổng hợp lên các sợi DNA con theo nguyên tắc bổ sung Quá trình sao chép hoàn toàn dựa trên nguyên tắc của Watson và Crick: A bố sung với T; G bổ sung vối c Chính vì vậy

mà trình tự các nucleotid trong phân tử DNA bô' mẹ quyết định trình tự nucleotid của phân tử DNA con Quá trình sao chép luôn đảm bảo tính bảo tồn cao, rấ t ít sai sót và luôn tu ân thủ chặt chẽ các nguyên tắc

29

PCR chỉ sử dụng những th à n h phần cơ bản của toàn bộ hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên đê sao chép một phân đoạn ngắn DNA trong ông nghiệm Trong hệ đệm, một vùng của chuỗi DNA khuôn được sao chép bơi enzym DNA polymerase sử dụng các nucleotid, đơn vị cấu thành của chuỗi DNA mới được tạo thành Các c ặp nucleotid mồi gắn đ ặc hiệu VỚI m ộ t đoạn c ủ a chuỗi DNA khuôn theo nguvên tắc bố sung Sự gắn này sẽ quyết định bởi vùng gen trên phân tử DNA sẽ được sao chép Hai chuỗi xoắn kép trong phân tử DNA khuôn được tách rời nhau bởi nhiệt độ Nhiệt độ cao phá vỡ các liên kết hydro giữa các đôi base Quá trình này gọi là quá trình biên tính Các cặp mồi sau đó liên kết bổ sung VỚI chuỗi DNA khuôn và enzym DNA polymerase bắt đầu quá trình gắn các đơn vị deoxvnucleotid vào vị trí 3’-OH của mồi đê tạo th à n h các

phân tử kẹp đôi mới (hình 2.1).

ở quá trình biến tính tiếp theo các phân tử kẹp đôi mới này một lần nữa lại bị biến tính và tách ra th àn h các sọi đơn (kê cả các khuôn ban đầu và khuôn mới tạo thành) Các mồi lại gắn vào khuôn theo nguyên tắc bô sung và quá trình kéo dài lại tiếp tục xảy ra Như vậy từ một sợi DNA xoắn kép ban đầu, 2 sợi DNA khuôn mới đã được tạo ra thêm cho chu kỳ sau, với chiều dài được

quyết định bởi vị trí bám của mồi s ả n phẩm của phản ứng sẽ tăng theo cấp sô

nhân sau mỗi chu kỳ Điều này có nghĩa là, nếu như phản ứng có hiệu suất 100%, tức là tấ t cả các DNA khuôn đều tham gia phản ứng, thì chỉ sau 20 chu

kỳ sẽ có 106 sợi DNA mới được tạo ra Tuy nhiên, thông thường hiệu suất của phản ứng không đạt được 100% và chúng ta phải tiến hành 25-40 chu kỳ tùy theo nồng độ khởi điểm của DNA khuôn Với một lượng rấ t nhỏ chất khuôn ban đầu, chúng ta có thể sao chép được một lượng lốn DNA (có thể tối microgam hoặc nhiều hơn) Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiến h ành PCR, việc nhiễm một lượng nhỏ- DNA ngoại lai cùng, có thể đưa đến sự th ấ t bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được một lượng nhỏ sản phẩm DNA mong muổn

Nguyên tắc của PCR dựa trên sự thay đối nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác

n hau của quá trình phản ứng: giai đoạn biến tính, gioi đoạn gắn mồi ưà giai

Hình 2.1 Quá trinh kéo dài mồi bởi DNA polym erase

4 PCR ĐƯỢC ĐIỂU KHIỂN BỞI NHIỆT ĐỘ

đoạn kéo dài ở nhiệt độ cao, thường là 94-95"C, hai sợi xoắn kép DNA khuôn

tách nhau ra Sau đó, nhiệt độ được hạ xuống đê cho phép cặp mồi gán vào DNA khuôn theo nguyên tắc bô sung Nhiệt độ gắn mồi này thay đôi tùy theo đặc diêm của từng cặp mồi Giai đoạn tiêp theo là giai đoạn kéo dài Đê tăng hiệu suất của quá trình tổng hợp DNA, nhiệt độ cần phải được điều chỉnh về nhiệt độ tôi ưu của DNA polymerase Đề khuếch đại th àn h công đoạn gen đích, chu kỳ nhiệt của phản ứng phải được lặp đi lặp lại nhiều lần (thường là 25-40 chu kỳ, phụ thuộc vào mục đích ứng dụng) Quá trình này được thực hiện nhờ thiêt bị tạo chu kỳ nhiệt theo chương trình Thiết bị này cho phép thay đôi nhiệt độ rấ t nhanh và giữ các ông PCR ở nhiệt độ và trong khoảng thời gian đã được lập trìn h trước Thiết bị tự động này là một tiến bộ khoa học lớn, cho phép kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi Trưốc khi thiết bị này ra đòi, PCR được tiên hành bằng cách sử dụng 3 bể nước được duy trì ở 3 nhiệt độ khác nhau và ống PCR dựng dung dịch phản ứng được chuyên bàng tay từ bế này sang bể khác

Một tiến bộ nữa cần phải được nhắc đên là việc thay thê Klenovv

polymerase với DNA polymerase bền với nhiệt ví dụ như Taq DNA polymerase

Enzym này không bị bất hoạt ơ nhiệt độ cao trong quá trình diễn ra phản ứng Việc tăng nhiệt độ ơ giai đoạn kéo dài cho phép làm tăng tính đặc hiệu của phản

ứng ơ nhiệt độ thấp hơn, như ở 37°c, chính là nhiệt độ tối ưu cho Klenow, các

mồi lại có khả năng gắn không đặc hiệu với các vùng khác trên phân tử DNA khuôn Điều này làm giảm tính đặc hiệu của phản ứng Ngày nay đă có nhiều tiến bộ vượt bậc trong việc cải tiến nhằm đơn giản hóa quy trìn h PCR đê cho phép kỹ th u ậ t này được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm và phòng xét nghiệm y sinh học phân tử như là một kỹ th u ậ t thường quy

5 LIỆU KỶ THUẬT PCR CÓ THE THAY THẾ ĐƯỢC KỶ THUẬT TẠO DÒNG GEN?

Trong một sô' trường hợp, kỹ th u ậ t PCR có thể thay th ế kỹ th u ậ t tạo dòng gen Song trong một sô trường hợp khác thì lại không thể được, ơ kỹ th u ậ t tạo dòng gen, một đoạn DNA được nối với vector tạo dòng (cloriing vector) và vector

này có khả năng sao chép trong tế bào chủ như vi khuẩn E coli Khi vi khuan

n h â n lên, các đoạn DNA mới được tạo thành nhờ quá trình sao chép Quá trình

p h ân chia của tê bào sẽ tạo ra một số lượng lớn các tê bào có vector tạo dòng

m ang đoạn DNA Khi có lượng lốn tê bào, chúng ta có thế tinh chê phân tử DNA đích phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Quá trìn h tạo dòng gen này thường chỉ mất khoảng 3 ngày

Trong khi đó kỹ th u ật PCR khuếch đại đoạn gen đích và do vậy chúng ta

có thể có đủ sô" lượng cần thiết để cho các thí nghiệm tiêp theo Tuy nhiên trong trường hợp này, quá trìn h sao chép xảy ra trong ống nghiệm và thường chỉ mất khoảng 3-4 h Trong nhiều trường hợp, ví dụ như khi chẩn đoán ung thư hay các bệnh lý di truyền kê cả chẩn đoán sàng lọc trước sinh, kỹ th u ậ t PCR là một

kỹ th u ậ t cho phép chẩn đoán đơn giản nhất, nhanh n h ất bởi sản phẩm PCR có

31