Việt Nam là một quốc gia có nền nông nghiệp phát triển đặc biệt là cây ăn quả. Trong đó, dứa là một loại cây ăn quả được trồng phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long với năng suất đứng thứ 14 trên thế giới với trên 500,000 tấnnăm theo thống kê của FAO 2017. Bên cạnh đó, có khoảng 50% khối lượng quả dứa là phế phẩm bao gồm: chồi, vỏ, mắt và lá, đây là nguồn nguyên liệu dồi dào nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme protease. Do đó, luận văn “Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dúa” đã được đề xuất phương pháp chiết tách, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu. Nghiên cứu đã đúc kết được những kết quả như sau:
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN VÕ MINH TÚ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BROMELAIN TỪ PHẾ PHẨM DỨA Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: 1/ TS Trần Tấn Việt 2/ PGS.TS Lê Thị Kim Phụng Cán chấm nhận xét 1: TS Lê Ngọc Liễu Cán chấm nhận xét 2: TS Phạm Thị Hồng Phượng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 20 tháng 07 năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS Phạm Thành Quân TS Lê Ngọc Liễu TS Phạm Thị Hồng Phượng TS Trần Tấn Việt TS Châu Ngọc Đỗ Quyên Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận vãn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trần Võ Minh Tú MSHV: 1870271 Ngày, tháng, năm sinh: 04/09/1994 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số : 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dứa II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1/ Khảo sát q trình ưích ly enzyme từ phế phẩm dứa 2/ Khảo sát trình tinh enzyme kỹ thuật lọc màng 3/ Khảo sát q trình sấy đơng khơ enzyme Bromelain 4/ Nghiên cứu động học enzyme 5/ Đánh giá chất lượng che phẩm Bromelain so với thị trường III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo QĐ giao đề tài) 11/02/2019 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) 08/12/2019 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: 1/ TS Trần Tấn Việt 2/ PGS TS Lê Thị Kim Phụng Tp HCM, ngày 10 tháng 06 năm 2019 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC LỜI CẢM ƠN Ngành công nghiệp enzyme phát triển ngày mạnh, mở hội thách thức lớn, đặc biệt enzyme từ nguồn phế phẩm Dứa quốc gia nồng nghiệp ngành phát triển Việt Nam Trước trạng đó, vẩn đề nghiên cứu cẩp thiết đặt sau khơng khó khăn, trở ngại với nỗ lực thân hỗ trợ Thầy Cô, gia đình, đồng nghiệp bạn bè, luận án hồn thành Tơi xỉn gửi lời tri ân sấu sẳc đến Thầy, Cô hướng dẫn khoa học TS Trần Tấn Việt PGS TS Lê Thị Kim Phụng - người tận tình hướng dẫn, định hướng hỗ trợ rẩt nhiều từ ngày thực đề tài tận ngày hôm Tơi xin gửi lòng biết ơn đến q Thầy, Cơ khoa Kỹ thuật hóa học phòng thí nghiệm nhiên liệu sinh học biomass — Viện nghiên cứu lượng bền vững - Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chỉ Minh anh chị phòng phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM giúp đỡ suốt thời gian làm thí nghiệm với điều kiện tốt Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vơ hạn đến gia đình ba mẹ - gia đình nguồn động lực giúp tơi kiên trì vượt qua khó khăn, tâm hồn thành luận án Luận án q vơ giá tơi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thầy Cơ - người yêu thương, bên cạnh song nghiệp TPHCM, ngày 10 tháng 06 năm 2019 TRẦN VÕ MINH TÚ ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Việt Nam quốc gia có nơng nghiệp phát triển đặc biệt ăn Trong đó, dứa loại ăn trồng phổ biến đồng sông Cửu Long với suất đứng thứ 14 giới với 500,000 tấn/năm theo thống kê FAO 2017 Bên cạnh đó, có khoảng 50% khối lượng dứa phế phẩm bao gồm: chồi, vỏ, mắt lá, nguồn nguyên liệu dồi nhiều tiềm để thu nhận enzyme protease Do đó, luận văn “Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dúa” đề xuất phương pháp chiết tách, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu Nghiên cứu đúc kết kết sau: 1- Điều kiện tốt để trích ly enzyme từ phế phẩm dứa: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/2 (w/v) với dung mơi trích ly dung dịch đệm photphat 1/15 M, pH 7,0, nhiệt độ 4°c, thời gian 10 phút với hỗ trợ siêu âm 2- Sử dụng phương pháp lọc màng tinh enzyme qua ba giai đoạn lọc: dịch thô lọc qua màng MF lpm 0,2pm, siêu lọc UF -100 kDa với hiệu suất 92,13% NF -10 kDa để thu enzyme tinh với độ tinh 1,37 lần 3- Sử dụng kỹ thuật sấy đông khô để tạo chế phẩm Bromelain: sữa tách béo chọn làm chất trợ sấy với nồng độ 10% tỷ lệ chất trợ sất/dịch tinh (v:v) 1/4 Chế phẩm sau sấy đánh giá số tính chất: enzyme tinh cho thấy ổn định pH 7,0, protease giữ lại 80% hoạt độ giờ; enzym giữ độ ổn định 90% 30°C sau ủ sau hai giảm 71%; số động học Km Vmax để thủy phân chất gelatin protease tinh 11,98 (mg/ml) 111,11 (GDU/g/phút) 4- Chế phẩm mang kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn y tế số công bố chất lượng từ nhà sản xuất enzyme lớn giới: sản phẩm đạt yêu cầu cảm quan, vi sinh Trong đó, hàm lượng vitamin c hàm lượng Bromelain 746,2 pg/g 229,2 mg/g iii ABSTRACT Vietnam is a country with developed agriculture, especially fruit trees Pineapple is among one of the most popular fruit trees that is grown in the Mekong Delta with its productivity peaked 14th in the world with over 500,000 tons/year according to FAO in 2017 Besides, about 50% the mass of pineapples are waste including: crowns, peels, eyes and leaves, which are a rich source of potential materials to acquhe protease enzymes Therefore, the thesis "The process of producing Bromelain from pineapple waste" has proposed method of extracting, purifying, creating enzyme products with high nutrition value from pinepple waste The research has summarized the following results: 1/ Optimal conditions for extracting enzymes from pineapple waste products: raw ratio material/solvent: 1/2 (w/v) with solvent extraction is phosphate buffer solutio 1/15 M, pH 7.0, 4°c temperature in 10 minutes with the support of ultrasonic 2/ Using membrane filtration method can purify enzyme through three stages of filtration: raw extract is filtered through MF membrane 1pm and 0.2 pm, UF membrane filter ~100 kDa with efficiency of 92.13% and NF ~10 kDa to collect purified enzyme with purity of 1.37 folds 3/ Use the freeze-drying technique to create Bromelain powder: skim milk is selected as a cryoprotectant at a concentration of 10% and the ratio of liquid/cryoprotectant (v:v) is 1/4 After-drying preparations were assessed some properties: purified enzyme showed stability at pH 7.0, protease was retained 80% of activity in hours; over 90% enzymes retained stability at 30°C after one hour of incubation then two hours reduced to 71%; Km and Vmax kinetic constants to hydrolyze gelatin substrate with purified protease are 11.98 (mg/ml) and 111.11 (GDU/g/min) respectively 4/ The product is taken out for quality inspection according to the standards of the Ministry of Health and some quality claims from major enzyme manufacturers in the world: products meet the requirements of sensory and microbiological The amount of vitamin c and Bromelain content are 746.2 pg/g and 229.2 mg/g respectively iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Trần Võ Minh Tú V MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi CHƯƠNG MỞ ĐẦU xii 1.1 Đặt vấn đề xii 1.2 Đối tượng nghiên cứu xii 1.3 Nội dung nghiên cứu xiii CHƯƠNG TÔNG QUAN 2.1 Giới thiệu dứa 2.1.1 Khái quát chung 2.1.2 Giá trị dinh dưỡng dứa 2.1.3 Tình hình sản xuất giới Việt Nam 2.1.4 Phế phẩm dứa 2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng từ phế phẩm dứa giới Việt Nam 2.2 Enzyme 2.2.1 Khái quát enzyme 2.2.2 Enzyme bromelain 2.2.3 Công dụng enzyme Bromelain 2.2.4 Các chất bảo vệ enzyme 12 2.3 Các nghiên cứu enzyme Bromelain 13 2.3.1 Chiết tách enzyme 13 2.3.2 Các phương pháp tinh Bromelain 14 vi 2.3.3 Các phương pháp sấy enzyme Bromelain 19 2.3.4 Nghiên cứu động học enzyme 22 CHƯƠNG NỘI DUNG THựC HIỆN 26 3.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 26 3.1.1 Nguyên liệu 26 3.1.2 Hóa chất 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu 28 3.2.1 Quy trình chung 28 3.2.2 Trích ly enzyme phế phụ phẩm dứa 30 3.2.3 Tinh enzyme bàng kỹ thuật lọc màng 30 3.2.4 Sấy đông khô enzyme 33 3.2.5 Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến enzyme protease 34 3.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm 35 3.3 Các phương pháp phân tích 35 3.3.1 Hàm lượng protein tổng 35 3.3.2 Hoạt độ enzyme 37 3.3.3 Độ ẩm 38 3.3.4 Hàm lượng Bromelain (HPLC-RID) 39 3.3.5 VitamineC 39 3.3.6 Vi sinh vật 40 3.4 Cơng thức tính tốn 42 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 4.1 Khảo sát q trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô 43 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến q trình trích ly .43 vii 4.1.2 Ảnh hưởng pH đến q trình trích ly .44 4.1.3 Ảnh hưởng tỷ lệ rắn lỏng đến q trình trích ly .45 4.1.4 Ảnh hưởng thời gian chiết đến q trình trích ly .46 4.2 Khảo sát trình tinh enzyme phương pháp lọc màng 47 4.3 Khảo sát q trình sấy đơng khơ 54 4.3.1 Khảo sát loại chất trợ sấy .54 4.3.2 Khảo sát nồng độ chất trợ sấy 56 4.3.3 Khảo sát tỷ lệ chất trợ sấy chiết xuất enzyme 57 4.4 Nghiên cứu động học enzyme 58 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến độ bền enzyme 58 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền protease tinh 59 4.4.3 Động học phản ứng enzyme phương pháp LineweaverBurk .59 4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm .61 CHƯƠNG 5KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 5.1 Kết luận 63 5.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 73 39 Klebsiella[80] Phương pháp[81]: Coliform vi khuẩn, nhiệt độ quy định (nghĩa 30°C 37°c thỏa thuận) hình thành khuẩn lạc đặc trưng môi trường thạch đường mật đỏ trung tính tím, xét nghiệm xác nhận gây lên men đường sữa với việc sản xuất khí điều kiện thử nghiệm quy định tiêu chuẩn quốc tế Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc ủ 24h 30°C, ống thu cho thấy có màu đục và/hoặc sinh khí cấy tiếp vào ống đựng môi trường khẳng định ủ 30°C 2411 Kiểm tra ống thu được, cho thấy đục khẳng định có mặt coliform Đối với nồng độ pha loãng, đếm tổng số ống quan sát thấy có sinh khí Tính số có xác suất lớn từ số ống dương tính với nồng độ pha loãng 3.3.6.2 Escherichia coli E.coli tự nhiên phần hệ thực vật bình thường ruột người động vật khác[82] Trên thực tế, hầu hết E.coli coi vô hại người[83] Tuy nhiên, số chủng gây bệnh nhiễm trùng vùng ruột gây bệnh nặng[84, 85] Phương pháp[86] Cấy lượng xác định mẫu thử môi trường tăng sinh chọn lọc ủ 37°c ± l°c 2211 ± 211 Kiểm tra ống sinh axit lên men lactose Các ống có sinh axit cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật- glucoronid (TBX) ủ 44°c ± l°c 22h ± 2h Kiểm tra có mặt khuẩn lạc màu xanh lam xanh da trời, có dương tính với xuất E.coli Tính số có xác suất lớn từ số ống dương tính với nồng độ pha loãng 3.3 ổ Tổng số nấm men - nấm mốc[87] Nấm men: vi sinh vật hiếu khí mesophilic 25°c sử dụng môi trường thạch nấm điều kiện mô tả phần ISO 21527, phát triển khuẩn lạc tròn sáng bóng bề mặt mơi trường, thường có đường viền lồi nhiều bề mặt Nấm mốc: vi sinh vật hiếu khí hiếu khí mesophilic, bề mặt môi trường thạch nấm điều kiện mô tả phần ISO 21527, thường phát triển 40 mầm khuẩn lạc lan rộng phẳng thường có cấu trúc màu Mẩu thử rót vào đĩa petri trộn với mơi trường nuôi cấy thạch tan chảy Chuẩn bị đĩa khác điều kiện, dử dụng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử Các đĩa ủ điều kiện hiếu khí 30°C 72h.Tính số lượng vi sinh vật gam hay lml mẫu thử theo số lượng khuẩn lạc thu đĩa có chứa 300 khuẩn lạc 3.3.6A Tổng vi sinh vật hiếu khí[88] Nguyên tắc : Chuẩn bị đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc Tùy thuộc vào lượng khuẩn lạc, sử dụng lượng xác định mẫu dung dịch pha loãng mẫu ủ đĩa cấy điều kiện hiếu khí 25°c ± °C ngày Các đĩa thạch để ánh sáng khuếch tán từ đến ngày cần Sau đếm khuẩn lạc/chồi, khẳng định việc nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ kính phóng đại kính hiển vi số lượng nấm men nấm mốc gam mililit mẫu tính từ số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu đĩa chọn mức pha loãng tạo khuẩn lạc đếm Nấm men nấm mốc đếm riêng 3.4 Cơng thức tính tốn • Hoạt độ riêng enzyme (GDU/g): (T—B) X14 X NxlOOO Hoạt độ riêng = ——— Nong độ protein Trong đó, T B thể tích NaOH dùng để chuẩn độ cho mẫu thử mẫu trắng, 14 khối lượng mol Nitơ, N nồng độ đương lượng dung dịch NaOH chuẩn (ở N = 0,1 N), Nồng độ protein (mg/ml) • Hiệu suất thu hồi tính sau : CRdVR TỂ =7^.100% F,i VF L Trong đó, CR,Ì CF,Ì nồng độ (g/1) cấu tử i dòng khảo sát nguyên liệu ban đầu, VR VF thể tích (1) dòng khảo sát nguyên liệu ban đầu • Độ tinh tính sau : cb Độ tinh = -2- 100% Cp 41 Trong : Cb , Cp hoạt độ riêng dòng ngun liệu thơ dòng khảo sát (GDU/g protein) • Hoạt độ tương đối: cv Hoạt độ tương đối = -7- 100% Trong : Cp, Cd hoạt độ riêng điều kiện khảo sát diều kiện chuẩn (GDU/g) 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê phần mềm Excel Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại lần kết trung bình cộng lần thí nghiệm CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Khảo sát q trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình trích ly Do tính chất nhạy cảm với nhiệt độ enzyme nên cần tiến hành thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly Kết khảo sát thể biểu đồ 4.1 Theo kết hình 4.1 cho thấy tăng nhiệt độ trích ly, hàm lượng protein tăng hoạt độ riêng protease dịch chiết giảm Nhiệt độ (°C) 42 Hình 4.1: Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease Khi nhiệt độ chiết tăng, trình hòa tan khuếch tán protein ngun liệu vào dịch trích ly tăng Theo kết thí nghiệm, hàm lượng protein tan dịch trích tang từ 744,35 pg/ml 4°c đến 1088,26 pg/ml 50°C Tuy nhiên, hoạt độ enzyme giảm nhiệt độ cao làm biến đổi cấu trúc phân tử enzyme giảm hoạt độ xúc tác enzyme Hơn nữa, enzyme bị biến tính điều kiện trích ly thời gian dài, nhiệt độ cao Vì thu nhận enzyme protease cần trích ly nhiệt độ 4°c để đạt hiệu trích ly enzyme cao với hoạt độ riêng protease 564,25GDU/g protein Ket tương tự số nghiên cứu trước Bianca c Martins (80,85 u/mg) Débora A Camposa quy trình tạo dịch chiết enzyme 4°c nhằm mục đích thu dịch trích ly enzyme có hoạt độ riêng cao nhất[89, 90] Từ kết thí nghiệm chúng tơi chọn nhiệt độ trích ly thích hợp 4°c cho nghiên cứu 4.1.2 Ảnh hưởng pH đến q trình trích ly Bromelain có nhiều độ pH (3-10) pH tối ưu 5-8 phụ thuộc vào chất Bromelain thân tinh khiết phần có hoạt độ riêng cao pH6,0 8,0[ 12] Kết khảo sát thể qua biểu đồ 4.2, xu hướng chung hàm lượng protein tổng hoạt độ riêng enzyme tang pH tăng từ đến đạt cao pH 7,0 với hàm lượng protein tổng hoạt độ riêng 1047,83 pg/ml 668,05 GDU/g protein Sau pH tăng dần từ đến protein tổng hoạt độ giảm mạnh Ferreha cộng ông Abdulrahman cho thấy pH 7,0 cho hoạt độ riêng cao nhất[92] Cùng xu hướng này, nghiên cứu All J R AL-Sa'ady hoạt độ riêng cao cho bromelain (131,25U/mg) thu sử dụng đệm natri phosphate pH 7,0[93] Bên cạch đó, sửa dụng đệm sodium citrate, Indumathy.s cho thấy với pH tối ưu 4,2 đạt hoạt độ cao 43 1060.00 1040.00 1020.00 —, I 1000.00 W ọp 980.00 g «■10kDa Khảo sát yếu tố: Áp suất (kg/cm* 5): 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 ... : 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dứa II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1/ Khảo sát q trình ưích ly enzyme từ phế phẩm dứa 2/ Khảo sát trình tinh enzyme kỹ thuật... Bromelain từ phế phẩm dứa làm đề tài nghiên cứu, nhằm xây dựng quy trình chiết, tinh đặc Bromelain hiệu 1.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án enzyme Bromelain có phế phẩm Dứa Trong... đó, luận văn Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dúa” đề xuất phương pháp chiết tách, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu Nghiên cứu đúc kết kết