BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ BÃ MÍA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ BÃ MÍA Bộ mơn : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TỪ THỊ ANH Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ BÃ MÍA Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS PHAN PHƯỚC HIỀN TỪ THỊ ANH ThS NGUYỄN CỬU TUỆ Tháng 07/năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Bố mẹ người sinh ra, nuôi dưỡng nên người bên cạnh động viên, tạo điều kiện cho ăn học đến ngày hôm Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ mơn Công nghệ Sinh học tất quý Thầy Cô trường truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trường PGS.TS Phan Phước Hiền tận tình giúp đỡ, dìu dắt, động viên hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp ThS Nguyễn Cửu Tuệ anh chị Trung tâm Môi trường trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp cho trang thiết bị kinh nghiệm quý báu trình thực đề tài tốt nghiệp Cùng toàn thể thành viên lớp DH08SH hỗ trợ, động viên, giúp đỡ cho trình học tập thời gian thực đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Từ Thị Anh ii TĨM TẮT Đã có nhiều nghiên cứu hoạt động enzyme cellulase từ nấm Trichodema reesei việc tạo dịch đường hóa từ nguyên liệu giàu cellulose như: rơm rạ, thân ngơ, trấu, bã mí để sản xuất bioethanol Với nguồn bã mía phế liệu Việt Nam chứa hàm lượng lignocellulose lớn điều kiện thúc đẩy hướng nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho việc chuyển hóa bã mía thành nguồn bioethanol Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH 1%, 5% 10% đến việc tinh hàm lượng chất xơ có bã mía Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến thủy phân nấm Trichoderma reesei q trình tạo dịch đường hóa gồm pH 4; 4,8; 5,2; tỷ lệ hàm lượng dinh dưỡng với khối lượng chất 2:1; 3:1; 4:1 (v/w) thời gian 3; 5; ngày Khảo sát nồng độ nấm men từ 1%; 5%; 10% thời gian ngày thích hợp cho việc tạo thành ethanol Theo kết thí nghiệm, tiền xử lý đạt hiệu tối ưu 63,79% khả thủy phân đạt hiệu suất cao 12,56 mg/g nồng độ NaOH 1% Quá trình thủy phân nấm Trichoderma reesei đạt 12,56 mg/g nồng độ dinh dưỡng theo tỷ lê 2:1 (v/w), độ pH 4,8 thời gian ngày Ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, ni cấy lắc, bổ sung thêm 5% nấm men nồng độ 108 tế bào/ ml sau ngày thu hàm lượng ethanol cao iii SUMMARY Thesis title “The first step research process of ethanol production from bagasse” The activity of cellulase from fungi Trichoderma reesei in the cellulose rich materials such as straw, cornstalk, rice husk, bagasse to producing bioethanol has been studied In Vietnam, with the sources of bagasse waste containing abundant lignocellulose, has prompted the research to determine the most appropriate conditions for transformation of bagasse into bioethanol Affect of different concentration of NaOH (1%, 5%, 10%) the purification of bagasse fiber was investigated The conditions affecting the hydrolysis of Trichoderma reesei in the creation process including the pH (4; 4.8; 5.2), the ratio between the weight of nutrient content and the substrate (2:1, 3:1, 4:1) (v/w), the results of the above factor was obtained in 3, 5, days Survey yeast concentration of 1%, 5%, 10% in days suitable for ethanol fermentation The results showed that, pretreatment achieve optimal efficiency is 63.79% hydrolyzed and the ability to reach peak performance is 12.56 mg/g of NaOH concentration of 1% Hydrolysis of the fungus Trichoderma reesei reached 12.56 mg/g for nutrient concentration is 2:1 (v/w), the pH is 4.8 in days In the room temperature, shaking culture, adding 5% yeast at a concentration of 108 cell/ml after 72 hours, get the highest concentration of ethanol Key word: Trichoderma reesei, ethanol, bagasse iv MỤC LỤC Trang TRANG TỰA i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY iv MỤC LỤC .v DANH DÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.2 Mục tiêu đề tài 2.1 Tổng quan nhiên liệu sinh học 2.1.1 Nhiên liệu sinh học 2.1.2 Các dạng nhiên liệu sinh học: 2.1.3 Nguyên liệu để sản xuất NLSH 2.1.4 Những lợi ích sử dụng nhiên liệu sinh học 2.2 Tổng quan ethanol sinh học .5 2.2.1 Giới thiệu chung ethanol 2.2.3 Một số phương pháp sản xuất ethanol sinh học 2.2.3.1 Nguồn nguyên liệu sinh khối 2.2.3.2 Nguồn nguyên liệu từ bã mía 2.2.3.3 Một số cơng nghệ chuyển hóa ethanol 2.2.4 Tình hình sản xuất sử dụng nhiện liệu etanol sinh học 14 2.2.4.1 Tình hình sử dụng giới 14 2.2.4.2 Sử dụng ethanol sinh học 16 2.2.4.3 Xu hướng sản xuất ethanol từ nguyên liệu sinh khối 17 2.2.4.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Việt Nam 17 2.3 Tổng quan vi sinh vật phân giải hợp chất hữu 19 2.3.1.1 Cellulose 19 2.3.1.2 Vi sinh vật phân giải cellulose 20 2.3.2 Hemicellulosese vi sinh vật phân giải hemicellulosese 21 2.3.2.1 Hemicellulose 21 v 2.3.2.2 Vi sinh vật phân giải hemicellulose 21 2.3.3 Vai trò vi sinh vật trình lên men rượu 22 2.3.3.1 Quá trình lên men rượu 22 2.3.3.2 Nấm men dùng lên men rượu ethylic 22 2.3.4 Chưng cất rượu ethylic 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 3.1 Thời gian địa điểm thực tập .24 3.2 Vật liệu nghiên cứu .24 3.2.1 Thu thập mẫu 24 3.2.2 Thiết bị hóa chất sử dụng 25 3.2.2.1 Dụng cụ thiết bị 25 3.2.2.2 Hóa chất sử dụng 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Phân lập lại chủng Trichodema reesei X - cung cấp 25 3.3.2 Phân lập chủng Saccharomyces cerevisiae từ chế phẩm có sẵn 27 3.3.3 Tiền xử lý nguyên liệu 27 3.3.4 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến thủy phân Trichoderma X - 28 3.3.5 Lên men chưng cất ethanol 29 3.3.5.1 Nội dung: 29 3.3.5.2 Phương pháp 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 4.1 Kết phân lập chủng Trichodermai X - Saccharomyces cerevisiae 30 4.2 Ảnh hưởng nồng độ NaOH lên hàm lượng chất xơ hiệu suất thủy phân nấm Trichoderma X - .31 4.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả thủy phân cellulose tạo đường nấm Trichoderma X - .32 5.1 Kết luận .36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 39 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT SK : sinh khối ETBE : Etylterbutyleter NLSH : lượng sinh học B100 : 100% diesel sinh học B5 : 5% diesel sinh học bà 95% dầu B10 : 10% diesel sinh học bà 90% dầu DE : diesel sinh học E5 : 5% ethanol sinh học 95% xăng E10 : 10% ethanol sinh học 90% xăng E15 : 15% ethanol sinh học 85% xăng E20 : 20% ethanol sinh học 80% xăng E85 : 85% ethanol sinh học 15% xăng E0 : 0% ethanol sinh học v 100% xăng EU : European Union - Liên minh châu Âu DME : dimetyl ether ETBE : ethyl tertiary butyl ether PGA : potato glucose agar DNS : dinitrosalicylic TLTK : tài liệu tham khảo STT : số thứ tự DD : dinh dưỡng (v/w) : tỷ lệ dinh dưỡng : chất vii DANH DÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần lignocellulose trong rác thải phế phụ nông nghiệp phổ biến .7 Bảng 2.2 Thành phần hóa học bã mía Bảng 2.3 Một số quy trình tiền xử lý nguồn nguyên liệu từ cellulose .12 Bảng 2.4 Tổng sản lượng ethanol hàng năm số nước 15 Bảng 2.5 So sánh số tiêu ethanol, ETBE, xăng .16 Bảng 2.6 Quan hệ áp suất, nhiệt độ nông độ rượu 23 Bảng 4.1 Ảnh hưởng NaOH đến hàm lượng chất xơ 31 Bảng4.2 Ảnh hưởng NaOH đến khả thủy phân tạo đường nấm Trichoderma X - .31 Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng : chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng : chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH 4.8 33 Bảng 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng : chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH 5,2 33 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ nấm men đến hàm lượng glucose lại 34 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Thành phần hóa học bã mía Hình 2.2 Quá trình thủy phân sản xuất đường từ cellulose trình lên men để sản xuất ethanol sinh học 10 Hình 2.3 Sử dụng enzyme để thủy phân lên men tách riêng 13 Hình 2.4 Sử dụng enzyme để thủy phân lên men đồng thời 14 Hình 3.1 Chế phẩm chứa nấm Trichoderma reesei X - 24 Hình 3.2 Chế phẩm Saccharomyces cerevisiae 24 Hình 3.3 Mẫu bã mía nghiền nhỏ 25 Hình 4.1 Chủng nấm Trichoderma reesei X – 30 Hình 4.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 30 Hình 4.3 Ethanol thu sau chưng cất .35 ix Thông qua tiền xử lý loại bỏ thành phần este, thành phần tạp chất có ngun liệu bã mía, giúp tăng diện tích bề mật tiếp xúc nguyên liệu, giúp làm yếu cấu trúc lignin có nguồn nguyên liệu nhằm thu kết tốt Khi sử dụng tiền xử lý NaOH 1% hiệu suất trình tiền xử lý đạt kết tối ưu 4.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả thủy phân cellulose tạo đường nấm Trichoderma X - Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng:cơ chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH Tỷ lệ dinh dưỡng : chất 2:1 3:1 4:1 Thời gian (ngày) 7 CV Lượng glucose thu (mg/g) 11,73a 9,06b 5,68c 4,46d 2,44ef 2,12f 3,00e 2,34ef 1,95f 6,72% Kết từ bảng 4.3 cho thấy, hàm lượng đường glucose thu có khác mặt thống kê nghiệm thức Ở điều kiện pH sau thời gian ngày, tỷ lệ dinh dưỡng : chất 2:1 (v/w) ml dung dịch Trichoderma 108 bào tử/ml hàm lượng glucose thu với hiệu suất cao 11,7 mg/g tức khoảng 1,17% Sau hàm lượng đường giảm theo thời gian Ở nồng độ dinh dưỡng lại, hàm lượng đường thu không nhiều, hiệu suất thủy phân nồng độ chất dinh 30 ml 40 ml Môi trường ẩm, chủng nấm không phát huy hết khả tiết enzyme chúng Khi chủng nấm tiết hết enzyme nhằm thủy phân cellulose môi trường tạo đường glucose sau chủng nấm quay ức chế ngược lại sử dụng thành phần đường có môi trường, sau lượng đường giảm dạng bào tử nấm Trichoderma xuất nhiều Trong mơi trường có tỷ lệ nồng độ dd : chất 3:1 4:1 xuất dạng bào tử nấm từ đầu điều chứng thành phần dinh dưỡng có mơi trường q ẩm phát triển thành 32 dạng bào tử có sản xuất lượng nhỏ enzyme cellulase để tạo thành lượng nhỏ đường Bảng 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng : chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH 4.8 Tỷ lệ dd : chất 2:1 3:1 4:1 Thời gian (ngày) 5 7 CV Lượng glucose thu (mg/g) 12,56a 9,31b 6,98c 4,04d 2,20e 1,78e 2,68e 2,04e 1,72e 8.56% Từ kết bảng 4.4 cho thấy, hàm lượng đường glucose thu có khác nghiệm thức Ở điều kiện pH 4,8 sau thời gian ngày, tỷ lệ nồng độ dinh dưỡng:cơ chất 2:1 (v/w) ml dung dịch Trichoderma 108 bào tử/ml hàm lượng đường thu với hiệu suất cao 12,56 mg/g tức khoảng 1,256 % Sau hàm lượng đường giảm theo thời gian Ở tỷ lệ dinh dưỡng lại, hàm lượng đường thu không nhiều, hiệu suất thủy phân tỷ lệ dinh dưỡng lại Đây điều kiện tốt cho phản ứng thủy phân nấm Trichoderma reesei X - Bảng 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ dinh dưỡng : chất thời gian đến tạo thành đường Trichoderma X - pH 5,2 Tỷ lệ dinh dưỡng : chất 2:1 3:1 4:1 Thời gian (ngày) Lượng đường thu (mg/g) 8,61a 6,04b 4,38c 7 3,26d 2,67de 2,15ef 2,83de 2,31ef 1,83f 8,64% CV 33 Từ bảng số liệu trên, điều kiện pH 5,2; tỷ lệ dinh dưỡng : chất cho thêm vào 2:1 (v/w) sau ngày thủy phân Trichoderma đạt kết cao 8,61 mg/g với ml dung dịch Trichoderma 108 bào tử/ml Hàm lượng đường glucose sau giảm dần theo thời gian Hàm lượng đường thu không nhiều hiệu suất thủy phân tỷ lệ dinh dưỡng lại, nồng độ ding dưỡng làm môi trường ẩm, chủng nấm không phát huy hết khả tiết enzyme chúng Như vậy, điều kiện tối ưu cho nấm Trichoderma reesei phát triển nồng độ pH 4,8 với tỷ lệ dinh dưỡng : chất bổ sung thêm 2:1 thời gian ngày nấm Trichoderma tạo lượng enzyme cellulase lớn Tuy nhiên, hiệu suất tạo đường tương đối thấp sử dụng trực tiếp nấm để thực thủy phân lượng enzyme tạo thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố tác động đến trình thủy phân nấm Trichoderma reesei X - Kết tương đương với kết nghiên cứu Fatman (2010) tỷ lệ hàm lượng đường tạo thành sau trình thủy phân cellulose Tuy nhiên, sử dụng hàm lượng nấm Trichoderma cho vào với nồng độ khác nên có khác biệt thời gian tạo thành hàm lượng đường lớn điều kiện khác giống với điều kiện tối ưu cho nấm tạo enzyme cellulase 4.4 Lên men tạo ethanol Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ nấm men đến hàm lượng glucose lại Lượng nấm men(%) 10 CV Thời gian (giờ) 24 48 72 96 24 48 72 96 24 48 72 96 Hàm lượng glucose (mg/ml) 0 0 41,02c 88,01a 95,77a 96,04a 17,01d 60,47b 95,54a 96,12a 6,75% 34 Hiệu suất (%) 96,04 96,12 Kết lên men hình 4.6 cho thấy: bổ sung lượng nấm men 1% khơng thấy có lên men xảy ra, ngun nhân có q nấm men mơi trường sử dụng cho lên men nấm men môi trường phải tăng sinh cho đủ số lượng cần thiết Khi bổ sung lượng nấm men 5%, 10% hiệu suất ethanol tạo thành nồng độ 5% đạt 96.04% gần tương đương so với lượng nấm men nồng độ 10% 96.12% Nguyên nhân bổ sung thêm lượng nấm men cao xảy tượng ức chế nên nồng độ ethanol thu giảm Vì với kết ta chọn nồng độ nấm men sử dụng 5% sau ngày thu ethanol với hiệu suất cao tiết kiệm lượng nấm men sử dụng cho môi trường lên men 4.5 Chưng cất ethanol Sau trình lên men, hỗn hợp ethanol thu đem chưng cất nhiều lần để nâng cao nồng độ ethanol Kết thu sau: kg chất qua trình thủy phân lên men với thu đươc 8,37 ml ethanol thơ Hình 4.5 Ethanol thu sau chưng cất Lượng ethanol tạo thành xử lý kg nguyên liệu tương đối thấp hiệu thủy phân cellulose tạo đường nấm Trichoderma reesei X – chưa cao Nồng độ ethanol thu cuối sau chưng cất chưa cao, cần tìm phương pháp nâng cao nồng độ ethanol để ứng dụng cho việc tạo sản phẩm khác ứng dụng sản xuất 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tiền xử lý, thủy phân lên men xác định điều kiện tối ưu việc chuyển hóa bã mía thành ethanol sinh học ban đầu có số kết luận sau: Đối với q trình tiền xử lý, sử dụng NaOH nồng độ 1% hiệu suất trình tiền xử lý đạt tối ưu giúp tạo điều kiện thu lượng đường tốt trình thủy phân Đối với trình thủy phân chất xơ có ngun liệu thu đường thu hiệu tối ưu ở, chất xử lý với NaOH 1%, pH 4,8; bổ sung tỷ lệ dinh dưỡng với chất 2:1 (v/w) tỷ lệ dịch nấm Trichoderma reesei X-4 : chất 1:2 (v/w) (108 bào tử/ml) ngày ni điều kiền phòng hiệu suất thu đường đạt 12,56 mg/g Sau ngày với 5% lượng nấm men (108 tế bào/ml) cho vào môi trường dịch đường điều kiện nuôi cấy lắc nhiệt độ phòng hiệu suất lên men đạt 96,26% 5.2 Đề nghị Thông qua kết việc sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose bã mía, có số đề nghị sau: Hiệu suất q trình thủy phân nấm thấp Cần thực nghiên cứu, phân lập với nhiều chủng khác để tạo hiệu suất thủy phân cao Nghiên cứu nâng cao nồng độ ethanol để ứng dụng vào quy trình sản xuất xăng sinh học Khảo sát, tìm hiểu thêm acid bazo khác để quy trình tiền xử lý đạt hiệu suất cao Nguồn nguyên liệu sau xử lý lại nhiều, cần nghiên cứu ứng dụng nguồn nguyên liệu thừa 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Hằng Nga, 2007, Nghiên cứu khả sản xuất ethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp, luận văn thạc sĩ, môn môi trường, đại học khoa học tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Minh Chơn, Triển vọng ngành mía dường, nhiên liệu sinh học vấn đề kỹ thuật trồng mía, trường đại học Cần Thơ Hồ Sĩ Tráng (2005),Cơ sở hoá học gỗ xennluloza, tập 1, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Hoàng Minh Nam, 2009, Nghiên cứu công nghệ thiết bị liên tục, xử lý rơm rạ nước để lên men ethanol, trường đại học bách khoa thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011, Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic cellulolytic từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt, luận văn thạc sĩ, trường đại học khoa học tự nhiên đại học quốc gia Hà nội Trần Thành Phong, Hồng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, 2007, Thu nhận enzyme cellulose Trichoderma reesei môi trường bán rắn, Viện Sinh học Nhiệt đới – Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, tạp chí phát triển KH&CN, tập 10, số 07-2007, pp 17-23 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Fatma, H Abd el Zher Darwish, 2010, Production of bioethanol via enzymeatic Saccharification of rice straw by cellulose production by Trichoderma reesei under soild state fermentatation, Bational research center Cairo Egypt, pp 72 – 78 Seungdo Kim Bruce E Dale, 2004, Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues, Biomass and Bioenergy 26, pp 361 – 375 Keikhosro Karimi, Giti Emtiazi Mohammad J Taherzadeh, 2006, Ethanol production from dilute-acid pretreated rice straw by simultaneous saccharification and fermentation with Mucor indicus, Rhizopus oryzae, and Saccharomyces cerevisiae, Enzyme and Microbial Technology 40, pp 138–144 37 10 The DOE Bioethanol Pilot Plant, Produced for the U.S Department of Energy (DOE) by the National Renewable Energy Laboratory, a DOE national laboratory 11 Cuifen Yang, Yutaka Genchi, Masayuki Sagisaka, 2010, Lifecycle Greenhouse Gas Emissions of Bioethanol Production From Rice Straw of Abandoned Land, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Japan 12 Dennis Schuetzle, PhD, 2006, Thermochemical Conversion of Rice Straw to Ethanol, TSS Consultants Rancho Cordova, California 13 Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003) “Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production” African Journal of Biotechnology, 2, pp 602 – 619 TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 14 http://nhandan.viet4phuong.com chương trình phát triển nhiên liệu sinh học Việt Nam, Báo nhân dân điện tử ngày 8/4/2010 (ngày truy cập 6/2012) 15 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/san-xuat-ethanol-tu-cellulose.143819.html (ngày truy cập 6/2012) 16 http://www.pvoil.com.vn/zone/119-tong-quan-ve-nhien-lieu-sinh-hoc.aspx) (ngày truy cập 6/2012) 17 http://tietkiemnangluong.com.vn/home/khoa-hoc-cong-nghe/nhung-loi-ich-cuanhien-lieu-sinh-hoc-4-7644.html) (ngày truy cập 6/2012) 18 http://www.scribd.com/doc/63151774/17/B%E1%BA%A3ng-1-3-Thanhph%E1%BA%A7n-hoa-h%E1%BB%8Dc-c%E1%BB%A7a-ba-mia-14#page=16 (ngày truy cập 6/2012) 38 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp đếm nấm men nấm Trichoderma buồng đếm hồng cầu Để đánh giá canh trường nấm men nấm Trichoderma, cần đến số tế bào bào tử 1ml Trong ml dịch số lượng tế bào bào tử cần đạt 107 – 109 tế bào bào tử, sử dụng buồng đếm hồng cầu a Tiến hành  Đặt lame lên khu vực buồng đếm  Lắc dịch huyền phù dùng pipet để pha loãng đến nồng độ cần thiết  Dùng micropipet nhỏ gioit dịch pha loãng vào khe mép buồng đếm, tránh tạo bot khí  Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi  Chỉnh quan sát vật kính 40X, tìm o dmedes khu vực buồng đếm  Đếm số lượng lớn b Cách tính Số lượng tế bào ml mẫu dược tính cơng thức N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n Trong N: Số lượng tế bào ml mẫu a: Số tế bào ô lớn b: Số ô vuông nhỏ ô lớn 400: Tổng số ô vng nhơ trung tâm 0,1 Thể tích dịch tế bào chứa ô trung tâm 103: Chuyển đơn vị n Độ pha loãng mẫu Phụ lục Chuẩn bị môi trường  Môi trường Mandel (Mandels et al, 1976) Thành phần nguyên tố đa lượng Thành phần hóa chất Khối lượng (g/l) Urea 0.3 Peptone 0.75 yeast extract 0.25 (NH4)2SO4 1.4 KH2PO4 2.0 CaCl2 0.3 MgSO4.7H2O 0.3 Các nguyên tố vi lượng Thành phần FeSO4.7H2O Khối lượng (mg/l) MnSO4 4H2O 1.6 ZnSO4.7H2O 1.4 CoCl2.6H2O 20.0 Thành phần môi trường hấp khử trùng, thành phần đa lượng, kết tủa vi lượng hấp riêng Có thể pha thành dung dịch stock để dễ dàng sử dụng Công dụng: tạo môi trường dinh dưỡng cho Trichoderma phát triển  Môi trường PGA (potato glucose agar) Thành phần: 200 gram khoai tây + 20 gram đường + 20 gram agar + Nước cất vừa đủ 1000 ml điều chỉnh pH tới ± 0.2 Công dụng: phân lập giữ giống chủng nấm Trichodema reesei X-4 Hấp khử trùng vòng 20 phút sau để thạch đĩa petria chuẩn bị cấy nấm  Mơi trường Agar - nước: (chỉ có thành phần nước agar) Công dụng: bước đầu tinh chủng nấm Trichodema reesei X-4  Môi trường Hasen (g/l) Thành phần Khối lượng (g/l) D-Glucose 50 MnSO4 7H2O KH2PO4 Peptone 10 Agar 18 - 20 Nước cất vừa đủ 1l Sử dụng môi trường lỏng không cần thêm agar Công dụng: môi trường đặc dùng để phân lập giữ giống nấm men Saccharomyces cereviase Môi trường lỏng để tăng sinh cho chủng nấm men Phụ lục Thuốc thử DNS: a Cách pha thuốc thử DNS 0,1% (500ml)  Cân 8/p (gram) NaOH định mức 100ml tạo dung dịch A (NaOH 2M; p: độ tinh khiết)  Cân 0,5 gram DNS hòa tan dung dịch A (đun cách thủy, khuấy tan hết) dung dịch B  Cho 150 gram Natri Kali tatrate vào dung dịch B chuẩn lên 300ml tráng cốc chứa chứa muối kép sau định mức lên 500 ml b Lập đường chuẩn Ống nghiệm 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ Dd glucose chuẩn 0,1% (ml) 0,8 1,2 1,4 1,6 Nước cất (ml) 3,2 2,8 2,6 2,4 Cglucose ( g / ml) 200 250 300 350 400 Dãy ống nghiệm Hút từ ống 1’,2’,3’,4’,5’ (ml) - 1 1 Nước cất (ml) - - - - Thuốc thử DNS (ml) 3 3 M1 M2 - 1 3 Đun cách thủy ống nghiệm phút Làm nguội ống nghiệm đến nhiệt độ phòng, sau đem đo OD OD540nm  Xây dựng đường chuẩn glucose y = f(x) với trục tung (y) mật độ quang, trục hoành (x) hàm lượng glucose (mg) phương pháp bình phương cực tiểu  Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ X (mg/ml) glucose dung dịch mẫu  Hàm lượng glucose ngun liệu tính theo cơng thức: G X V 100 1000.m fmẫu (%) Với: m : lượng mẫu đem thí nghiệm (g) V : thể tích định mức dung dịch thí nghiệm (100ml) X : nồng độ đường khử dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml) fmẫu : hệ số pha lỗng mẫu (nếu có) Phụ lục Phương trình đường chuẩn đo nồng độ đường Phương trình đường chuẩn glucose 1% Abs 1.2 y = 1.112x - 0.0167 R² = 0.9977 0.8 0.6 Abs 0.4 Linear (Abs) 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 mg/ml -0.2 Phương trình đường chuẩn đo glucose: y = 1,112x - 0,0167 với R2 = 0,9977 Từ ta tính nồng độ đường có dung dịch mẫu đo Phụ lục Cách sử dụng khúc xạ kế a Hiệu chuẩn Nhỏ – giọt nước cất lên bề mặt lăng kính thực quan sát thông thường Nếu vạch phan cách vùng trắng xanh không nằm vị trí 0.000 dùng tuavit xoay vít hiệu chuẩn lại vạch chuẩn b Thao tác đo  Nhỏ – giọt dung dịch cần đo lên lăng kính  Đậy chắn lên  Quan sát dung dịch cần phải phủ lên lăng kính  Quan sát đọc thang đo Chỉnh tiêu cự để quan sát rõ  Lau giấy thấm mềm Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng NaOH đến trình tiền xử lý khả tạo đường  Bảng anova thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hàm lượng chất xơ ANALYSIS OF VARIANCE TABLE of chất Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Bewteen 4.54 4.538 100.55 0.0000 Within 0.14 0.045 -Total 1693.25  Bảng trắc nghiệm phân hạng ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hàm lượng chất xơ Original Order Ranked Order Mean = 63.79 A Mean = 63.79 A Mean = 44.30 B Mean = 44.30 B Mean = 30.41 C Mean = 30.41 C  Bảng anova thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hàm lượng glucose ANALYSIS OF VARIANCE TABLE OF GLUCOSE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob between 0.00 0.000 0.44 0.0000 within 0.00 0.001 -Total 0.29  Bảng trắc nghiệm phân hạng ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hàm lượng glucose Original Order Ranked Order Mean = 1.220 A Mean = 1.220 A Mean = 1.040 B Mean = 1.040 B Mean = 0.8000 C Mean = 0.8000 C Phụ lục Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân Bảng anova khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH ANALYSIS OF VARIANCE TABLE OF pH Degrees of Sum of Mean F Freedom Squares Square Value Prob Between 0.217 0.054 53.1375 0.0000 Within 16 0.016 0.001 Total 20 2.935  Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH Original Order Ranked Order Mean = 1.170 A Mean = 1.170 A Mean = 0.9100 B Mean = 0.9100 B Mean = 0.5900 C Mean = 0.5900 C Mean = 0.4500 D Mean = 0.4500 D Mean = 0.2400 EF Mean = 0.3000 E Mean = 0.2100 F Mean = 0.2400 EF Mean = 0.3000 E Mean = 0.2300 EF Mean = 0.2300 EF Mean = 0.2100 F Mean = 0.2000 F Mean = 0.2000 F  Bảng anova khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH 4,8 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE OF pH 4.8 Degrees of Sum of Mean F Freedom Squares Square Value Prob Between 0.174 0.044 25.6923 0.0000 Within 16 0.027 0.002 Total 20 3.730  Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH 4,8 Original Order Mean = 1.260 A Mean = 0.9300 B Mean = 0.7000 C Mean = 0.4000 D Mean = 0.2200 E Mean = 0.1800 E Mean = 0.2700 E Mean = 0.2000 E Mean = 0.1700 E Ranked Order Mean = 1.260 A Mean = 0.9300 B Mean = 0.7000 C Mean = 0.4000 D Mean = 0.2700 E Mean = 0.2200 E Mean = 0.2000 E Mean = 0.1800 E Mean = 0.1700 E  Bảng anova khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH 5.2 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE OF pH 5.2 Degrees of Sum of Mean F Freedom Squares Square Value Prob Between 0.103 0.026 24.1035 Within 16 0.017 0.001 Total 20 1.214 0.0000  Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân pH 5.2 Original Order Ranked Order Mean = 0.8600 A Mean = 0.8600 A Mean = 0.6000 B Mean = 0.6000 B Mean = 0.4400 C Mean = 0.4400 C Mean = 0.3300 D Mean = 0.3300 D Mean = 0.2700 DE Mean = 0.2800 DE Mean = 0.2200 EF Mean = 0.2700 DE Mean = 0.2800 DE Mean = 0.2300 EF Mean = 0.2300 EF Mean = 0.2200 EF Mean = 0.1800 F Mean = 0.1800 F Phụ lục Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men  Bảng anova khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men ANALYSIS OF VARIANCE TABLE OF ETHANOL Degrees of Sum of Mean F Freedom Squares Square Value Prob - -Between 6960.157 1160.026 105.2372 0.0000 Within 22 242.505 11.023 Total 28 63662.355  Bảng trắc nghiệm phân hạng khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 E Mean 12 = 96.12 A Mean = 0.0000 E Mean = 96.04 A Mean = 0.0000 E Mean = 95.77 A Mean = 0.0000 E Mean 11 = 95.54 A Mean = 41.02 C Mean = 88.01 A Mean = 88.01 A Mean 10 = 60.70 B Mean = 95.77 A Mean = 41.02 C Mean = 96.04 A Mean = 17.01 D Mean = 17.01 D Mean = 0.0000 E Mean 10 = 60.70 B Mean = 0.0000 E Mean 11 = 95.54 A Mean = 0.0000 E Mean 12 = 96.12 A Mean = 0.0000 E ... thời gian thực đề tài tốt nghiệp ThS Nguyễn Cửu Tu anh chị Trung tâm Môi trường trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp cho trang thi t bị kinh nghiệm quý báu trình thực đề tài... 10/2007 Hà Nội thu hút ý hàng trăm nhà khoa học kinh doanh chung quanh vấn đề xăng sinh học Qua hội thảo này, số chuyên gia nhà kinh doanh đề cập đến việc sử dụng lúa gạo, mía đường, dầu lai... mg/g for nutrient concentration is 2:1 (v/w), the pH is 4.8 in days In the room temperature, shaking culture, adding 5% yeast at a concentration of 108 cell/ml after 72 hours, get the highest