Phần mở đầu Bệnh tiêu chảy bệnh gây thiệt hại lớn chăn nuôi, bệnh xảy lứa tuổi lợn từ 1- 90 ngày Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy, đáng kể vai trò vi khuẩn E.coli, Salmonella spp, Cl.perfringens Để phòng, trị bệnh tiêu chảy lợn chủ yếu sử dụng kháng sinh Những bất lợi việc sử dụng kháng sinh đòi hỏi nhiều nhà khoa học nghiên cứu sản xuất số chế phẩm sinh học để thay kháng sinh, ®ã cã chÕ phÈm EM (Effective Microorganisms) ChÕ phÈm EM ®· ®ỵc sư dơng nhiỊu lÜnh vùc, nhng øng dụng EM phòng trị bệnh tiêu chảy cho lợn đợc nghiên cứu Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu vai trò E.coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens bệnh tiêu chảy lợn 1- 90 ngày tuổi Sử dụng chế phẩm EM-TK 21 phòng trị Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu vai trò vi khuẩn E.coli, Salmonella Cl.perfringens gây bệnh tiêu chảy lợn 1-90 ngày tuổi Xác định tác dụng phòng trị bệnh tiêu chảy chế phẩm EM-TK21 lợn từ 1-90 ngày tuổi thực tiễn sản xuất cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu Đối tợng phạm vi nghiên cứu Phòng thí nghiệm Viện Thú y quốc gia, Trại giống lợn Văn Giang- Hng Yên, Trại giống lợn Quang Trung, Gia Lâm - Hà Nội ý nghĩa đề tài Xác định biến động tỉ lệ phân lập vi khuẩn E.coli, Salmonella, Cl.perfringens lợn tiêu chảy yếu tố gây bệnh tiêu chảy Xác định tác dụng diệt khuẩn chế phẩm EM-TK21 với vi khuẩn phân lập đề định liều lợng EM-TK21 phòng, trị bệnh tiêu chảy lợn sản xuất Những đóng góp luận án Hiện vấn đề kháng thuốc vi sinh vật đờng tiêu hoá trở ngại lớn cho phơng pháp chữa bệnh Sử dụng EM-TK21 phòng trị bệnh tiêu chảy lợn thay cho dùng kháng sinh tránh tợng kháng thuốc vi khuẩn tồn d kháng sinh sản phẩm thịt Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, sức khoẻ ngời tiêu dùng Giảm chi phí chữa bệnh thuốc kháng sinh giảm tỷ lệ lợn bị còi cọc sau điều trị kháng sinh 5.Bố cục luận án Luận án gồm 188 trang, đó: đặt vấn đề trang; tỉng quan tµi liƯu 43 trang; néi dung vµ phơng pháp nghiên cứu 27 trang; kết nghiên cứu thảo luận 84 trang; kết luận đề nghị trang Trong có 41 bảng biểu; 10 biểu đồ hình; sơ đồ, công trình có liên quan; 190 tài liệu tham khảo (tài liệu tiếng việt 84; tài liệu nớc 106) ảnh minh hoạ Chơng I Tổng quan tài liệu Tiêu chảy hội chứng bệnh lý đờng tiêu hoá nhng chủ yếu vi khuẩn: E.coli, Salmonella spp, Cl.perfringens gây Trong nớc, kết Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phợng (1996) cho rằng, tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy từ (70- 85%), có nơi (100%) tỷ lệ chết (18-20%) Phùng thị Vân (1997) cho rằng, tỷ lệ lợn chết tiêu chảy (60,6%) so với (12,8%) chết nguyên nhân khác Cù Hữu Phú (2004) cho rằng, tỷ lệ lợn từ 35 ngày- tháng tuổi mắc tiêu chảy E.coli (85,71%) Theo Nguyễn Thị Nội (1989), lợn mắc tiêu chảy Salmonella tỷ lệ từ (82,8- 100%) Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1995) cho rằng, tỷ lệ lợn tiêu chảy nhiễm Salmonella từ (70- 90%) Hồ Văn Nam (1997), tỷ lệ lợn sơ sinh đến 12 tháng tuổi bị tiêu chảy Salmonella (22,03%) Trên giới, nghiên cứu cña Harel J (1991); Wilcock B P., Schwartz K J (1992) cho rằng, thờng xuyên gây tiêu chảy lợn lµ chđng S.cholerasuis tû lƯ lµ (95%); S.typhimurium (4%) vµ (1%) thc c¸c chđng kh¸c Laval A.(1997) cho r»ng, tû lệ chết tiêu chảy lợn sau cai sữa bắt đầu vỗ béo S.cholerasuis S.typhimurium từ (10- 100%); cßn theo Hsu F S.(1983), tû lƯ chÕt lµ (48%) Hogh P (1974) cho r»ng, tû lƯ chÕt Cl.perfringens gây viêm ruột hoại tử xuất huyết tiêu chảy lợn sơ sinh từ (50- 100%) Nabuurs M J A., Haagsma J et al, (1983) cho r»ng, tû lệ lợn theo mẹ bị tiêu chảy vi khn Cl.perfringens lµ (100%) vµ tû lƯ chÕt lµ (60%) Để phòng trị bệnh tiêu chảy lợn sử dụng loại vac xin, thuốc kháng sinh, chế phẩm sinh học Trong chế phẩm EM đợc giáo s Teruno Higa, Nhật Bản nghiên cứu tạo từ 2000 loài vi khuẩn có tự nhiên giữ lại 80 loài bao gồm: vi khuẩn quang hợp, xạ khuẩn, nÊm men, mèc vµng, Lactobacillus sp, Ngoµi EM-1, EM Bokashi, nhà khoa học Trờng Đại học Nông Nghiệp I- Hà Nội phối chế tạo EM- TK21 từ EM gốc sử dụng chăn nuôi thú y phòng trị bệnh có hiệu cao Trong nớc, nghiên cứu Phạm Khắc Hiếu (2002) cho rằng, EM-1 phòng trị tiêu chảy E.coli, Salmonella, Cl.perfringens lợn có hiệu Nguyễn Quang Thạch cs (2000) cho rằng, EM thứ cấp điều trị tiêu chảy lợn 1- 60 ngày tỷ lệ khỏi từ (74,28- 100%) sau 1-3 ngày EM-1 điều trị tiêu chảy Bò, số lợng vi khuẩn E.coli / 1gam phân giảm từ (8,68 triệu 7,63 triệu); Salmonella spp tõ (771 triƯu cßn 1,23 triƯu); tû lƯ khỏi (100%) Sử dụng EM-1 hiệu lực phòng bệnh cầu trùng gà (80%) EM- Bokashi cho lợn thịt tăng trọng bình quân/ tháng (109,18%) Trên giíi, Richard Taylor (2003); Eduardo Z.(1995); Konoplya E F., Higa T (1999) cho rằng, lợn thịt đợc vỗ béo EM-1 sau tháng tăng trọng bình quân gấp 1,5 lần Gà thịt 10 ngày tuổi dùng EM-1 sau 50 ngày sai khác so với đối chứng 150g/con Chơng Nội dung - nguyên liệu - phơng pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Xác định vai trò vi khuẩn E.coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens gây bệnh tiêu chảy lợn 1- 90 ngày tuổi 2.1.2 Xác định khả kháng khuẩn EM-TK21 ®èi víi E.coli, Salmonella spp, Cl perfringens (®iỊu kiƯn Invitro) 2.1.3.ứng dụng chế phẩm EM-TK21 phòng, trị bệnh tiêu chảy lợn 1- 90 ngày tuổi sản xuất 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.3 Phơng pháp nuôi cấy 2.3.1 Phơng pháp phân lập giám định vi khuẩn Quá trình nuôi cấy, phân lập giám định vi khuẩn theo quy trình thờng quy sử dụng phòng thí nghiệm môn Vi trùngViện Thú Y 2.3.2 Phơng pháp giám định số đặc tính sinh vật hoá học Ph¶n øng sinh H2S, ph¶n øng citrat, ph¶n øng sinh Indole, phản ứng Urea, phản ứng lên men đờng 2.4 Phơng pháp xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn phân lập đợc 2.4.1 Phơng pháp PCR xác định ®éc tè ®êng rt, u tè b¸m dÝnh cđa E.coli định type độc tố đờng ruột vi khuẩn Cl perfringens 2.4.2 Phơng pháp xác định khả sản sinh độc tố đờng ruột kháng nguyên bám dính Salmonella spp 2.4.3 Phơng pháp định type xác định độc tố đờng ruột dung huyết vi khuẩn Cl.perfringens 2.4.4 Phơng pháp xác định độc lực chuột chủng phân lập 2.4.5 Phơng pháp kháng sinh đồ 2.5 phơng pháp xác định khả kháng khn cđa EMTK21 ®èi víi E.coli, Salmonella spp, Cl perfringens (invitro) 2.5.1 Xác định khả cạnh tranh vi khuẩn (bằng phơng pháp xác định vi khuẩn 1ml canh khuẩn trớc sau tác động EM-TK21) 2.5.2 Xác định khả diệt khuẩn EM-TK21 (bằng phơng pháp bay TOKIN phơng pháp đặt ống trụ Heasley) 2.6 Thử nghiệm phòng, trị bệnh tiêu chảy EM-TK21 E.coli, Salmonella spp, Cl.perfringens gây động vật thí nghiệm 2.7 Kiểm tra tác dụng phòng, trị bệnh tiêu chảy EMTK21 lợn 1- 90 ngày tuổi sản xuất 2.8 Phơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu đợc xử lý theo phơng pháp thống kê sinh học chơng trình Excel Tô Cẩm Tú (1992); Nguyễn Đình Hiền (1998) Chơng Kết nghiên cứu thảo luận 3.1.Vi khuẩn đờng ruột bệnh tiêu chảy lợn 1-90 ngày tuổi 3.1.1 Kết xác định số loại khuẩn lạc, số lợng vi khuẩn hiếu khí phân lợn khỏe tiêu chảy Bảng 3.1.Loại khuẩn lạc, số lợng vi khuẩn hiếu khí phân lợn khỏe tiêu chảy Phân lợn khoẻ mạnh Nhóm Số tuổi Kiểu Vk/g phân mẫu (ngày) khuẩn lạc (triệu) (n) 1-21 37 4,20 22-45 38 4,82 46-90 40 5,22 Tæng 115 4,75 103,90±6,5 126,727,6 167,307,0 132,647,0 Phân lợn tiêu chảy Số Kiểu Vk/g phân mẫu khuẩn lạc (triệu) (n) 37 4,41 38 5,38 40 5,76 115 5,18 252,81±5,3 206,37±4,1 247,36±4,8 235,51±4,7 B¶ng 3.1 cho thấy có khác biệt số lợng vi khuẩn loại khuẩn lạc lợn khoẻ tiêu chảy: Trong phân lợn khỏe trung bình có 103,9 - 167,3 triƯu vi khn hiÕu khÝ 1gam ph©n, thc 4-5 loại vi khuẩn đờng ruột khác Trong phân lợn tiêu chảy số lợng vi khuẩn hiếu khí trung bình cao phân lợn khỏe khoảng lần (235.51 triƯu so víi 132.64 triƯu vi khn/1gam ph©n), nhiên số loại vi khuẩn tăng không đáng kể (5.18 loại khuẩn lạc so với 4.75 loại) Đối với lợn khỏe, số lợng vi khuẩn hiếu khí đờng ruột số loại vi khuẩn tăng theo lứa tuổi lợn: nhóm lợn 46-90 ngày tuổi có số loại vi khn cao nhÊt: 5,22 lo¹i víi tỉng sè 167,3 triƯu vi khuẩn/1gam phân thấp nhóm lợn từ 1-21 ngày có 4,2 loại với 103,9 triệu vi khuẩn Đối với lợn tiêu chảy, số lợng vi khuẩn số loại vi khuẩn khác theo lứa tuổi lợn: nhóm lợn 1-21 ngày tuổi có số loại vi khuẩn thấp nhất: 4,41 loại nhng số lợng vi khuẩn cao với (252,81) triệu vi khuẩn/1gam phân nhóm lợn 22-45 ngày có số loại vi khuẩn cao nhất: 5,76 loại nhng số lợng vi khuẩn thấp (206,37) triệu vi khuẩn 3.1.2 Kết phân lập xác định vi khuẩn Bảng 3.2 Kết phân lập xác định vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy E.coli Salmonella spp Cl.perfringens Sè Sè Tû Sè Sè Tû Sè Số Tỷ T T Địa điểm mẫu mẫu lệ mẫu mÉu lÖ mÉu mÉu lÖ (n) (+) (%) (n) (+) (%) (n) (+) (%) Hà Nội Hng Yên Tỉng hỵp 58 57 115 58 57 115 100 100 100 58 57 115 53 53 106 92,37 92,98 93,17 58 57 115 46 47 93 79,3 82,4 80,8 B¶ng 3.2 cho thÊy tû lƯ nhiƠm lo¹i vi khn có khác địa điểm lấy mẫu Tỷ lệ nhiễm E.coli Hà Nội Hng Yên (100%) Tỷ lệ nhiễm Salmonella trung bình (93,17%) Trong Hà Nội (92,37%); Hng Yên (92,98%) Tỷ lệ nhiễm Cl.perfringens trung bình (80,8%) Trong Hà Nội nhiễm (79,3%); Hng Yên (82,4%) Kết phù hợp với kết Nguyễn Bá Hiên (2001)[] cho rằng, tỷ lệ nhiễm Salmonella (90,37%); Nguyễn Thị Nội (1989)[] tỷ lệ nhiễm Salmonella từ (41-100%); Hồ Văn Nam cs (1997) cho rằng, tû lƯ nhiƠm tõ 40 - 88,8% Cï H÷u Phó vµ cs (2000)[] cho r»ng, tû lƯ nhiƠm Salmonella spp trung bình (80%) 3.1.3 Sự biến động tổng số vi khuẩn hiếu khí phân lợn khoẻ tiêu chảy Bảng 3.5 kết phân lập từ phân lợn trạng thái khoẻ mạnh tiêu chảy thờng gặp loại vi khuẩn E.coli, Salmonella spp, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus, B.subtilis Số lợng loại vi khuẩn số lợng vi khuẩn nhóm lợn khác rõ rệt Tỷ lệ nhiễm E.coli phân lợn khoẻ mạnh tiêu chảy (100%) lợn tiêu chảy số lợng vi khuẩn/1gam phân cao phân lợn khỏe trung bình khoảng lần (155,88 triệu so với 55,44 triệu lợn 1- 21 ngày); số lợng vi khuẩn khác lứa tuổi, lợn 1- 21 ngày cao với (158,88) triệu, thấp lợn 46-90 ngày víi (147,92) triƯu Vi khn Salmonella cã sè lỵng trung bình/1gam phân cao phân lợn khỏe khoảng lần (51,34 triệu so với 21,39 triệu lợn 1-21 ngày); lợn 1-21 ngày tiêu chảy số lợng vi khuẩn cao (51,34) triệu, thấp lợn 46- 90 ngày (46,36) triệu Số lợng vi khuẩn Klebsiella tõ 10,88-16,8 triƯu vi khn/1gam ph©n; Streptococcus tõ 2,8 - 7,1 triÖu; Staphylococcus tõ 5,33 13,91 triÖu, B subtilis tõ 5,83 - 9,46 triệu Kết nghiên cứu phù hợp với kết Hồ Văn Nam, Trơng Quang, (1997)[]; Nguyễn Bá Hiên (2001)[] cho rằng, lợn bị tiêu chảy tỷ lệ nhiễm E.coli (100%); Salmonella spp lµ (90,37%); Streptococcus lµ (62,08%); Staphylococcus lµ (32,46%); Klebsiella (62,5%) ; B.subtilis (42,38%) Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên cs, (2004)[] cho rằng, lợn tiêu chảy tỷ lệ E.coli (88,71%), Salmonella (80%), Streptococcus (42,86%); Klebsiella, Bacillus sp tỷ lệ (24,29%) Chúng tháy lợn tiêu chảy có dấu hiệu loạn khuẩn rõ rệt, có tăng đột ngột mức số vi khuẩn đờng ruột giảm cách đáng kể số loài vi khuẩn cộng sinh khác.Thực chất biến động loại vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn Cl.perfringens gây nên Bảng 3.5 Sự biến động tổng số vi khuẩn hiếu khí phân lợn khoẻ tiêu chảy Ch Số lợng vi khuẩn gam phân (triệu) ỉ tiêu Nhóm 1-21 ngày tuổi 22 - 45 ngày tuổi Tăng lợn Tiêu Vi khuẩn Khoẻ (+) chảy mạnh giảm Tiêu chảy (-) Khoẻ mạn h 46 - 90 ngày tuổi Tăng (+) giảm (-) Tăng Tiêu Khoẻ (+) chảy mạnh giảm (-) E.coli 155,8 55,4 +100, 153, 65,1 +88,7 147,9 90,9 +56,9 Salmonella 44 85 5 5,33 cus Streptococc 6 10,88 7,65 +3,23 11,8 8,21 +3,59 16,80 10,0 +6,73 Staphylococ 51,34 21,3 +29,9 46,9 27,6 +19,2 46,36 31,6 +14,7 spp Klebsiella 10,6 - 5,3 10,1 13,4 - 3,38 13,91 15,6 - 1,69 2,83 1,35 +1,48 6,06 2,53 +3,53 7,10 4,21 +2,89 5,83 10,9 - 5,15 7,61 13,7 - 6,14 9,46 18,0 - 8,54 us B.subtilis 10 Cl.perfringens l« thí nghiệm giảm mạnh lô đối chứng tăng nhanh râ rƯt theo mèc thêi gian tríc vµ sau tác động chế phẩm EM-TK21 Lô thí nghiệm số lợng vi khuẩn/1ml : E.coli từ (975 triệu 367 triƯu); Salmonella tõ (950 triƯu cßn 395 triƯu); Cl.perfringens tõ (923 triệu 418 triệu) Lô đối chứng số lợng vi khuẩn/1ml tăng nhanh (so với lô thí nghiệm) sau giờ: E.coli tăng (1,91 lần); Salmonella tăng (2,47 lần); Cl.perfringens tăng (2,03 lần) Chúng cho vi sinh vật hữu hiệu chế phẩm EM-TK21 có tác dơng diƯt khn rÊt m¹nh víi vi khn E.coli, Salmonella Cl.perfringens điều kiện (Invitro) 3.2.3 Kết kháng khuẩn EM-TK21 với E.coli, Salmonella Cl.perfringens phân lập đợc 3.2.3.1.Kết kháng khuẩn EM-TK21 với E.coli chuẩn, E.coli phân lập, E.coli kháng thuốc *Kết kháng khuẩn EM-TK21 hấp Tyndal, hấp ớt 1200C/30và dạng Biomas với E.coli Bảng 3.32 Kết kháng khuẩn EM-TK21 hấp Tyndal, hấp ớt 1200C- 30, dạng Biomas E.coli ((theo phơng pháp đặt ống trụ HEALEY) Dạng thử Đờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) EMTK- LiỊu thư §èi EMTK- §èi EMTK- 21 hÊp chøng 21 hÊp - chøng 21 d¹ng Tyndal Vi khn 120 C0 §èi chøng Biomas 30’ B1676 24.0 0 24.0 0 22.4 0 E22 23.0 0 22.8 0 21.6 0 E26 25.0 0 24.9 0 23.0 0 E210 23.4 0 23.6 0 21.8 0 20 E211 25.5 0 25.0 0 24.2 0 Ghi chó: E210, E211 lµ vi khn ®· kh¸ng thuèc kh¸ng khuÈn: S, L, FS, SH, OL, MTZ, PB §/c1: níc cÊt; §/c2: §èi chøng b»ng níc cất chỉnh pH = 3,5 Từ kết bảng 3.33 cho thấy: tác dụng kháng khuẩn EMTK21 dạng mạnh với E.coli EM-TK21 hấp Tyndal, hấp ớt 1200C/30 phút cho đờng kính vòng vô khuẩn lớn tơng đơng với dạng tơi từ 22,8 mm- 25,5mm, dạng Biomas từ 21,6 mm 24,2mm Điều chứng tỏ dới tác động nhiệt độ cao thời gian dài EM-TK21 tác dụng tốt vi khuẩn E.coli, kể chủng E.coli kháng loại thuốc kháng khuẩn thông thờng Trong xung quanh ống trụ nhỏ nớc cất nớc cất chỉnh pH = 3,5 vi khuẩn phát triển tốt, không xuất vòng vô khuẩn 3.2.3.2 Kết kháng khuẩn EM-TK21 với Salmonella chuẩn, Salmonella spp phân lập, Salmonella spp kháng thuốc (theo phơng pháp đặt ống trụ HEALEY) Kết kháng khuẩn EM-TK21 hÊp Tyndal, hÊp 120 C/30’, d¹ng Biomas 21 Bảng 3.34 Kết kháng khuẩn EM-TK21 hấp Tyndal, hÊp 1200C- 30’, d¹ng Biomas víi Salmonella spp (theo phơng pháp đặt ống trụ HEALEY) Dạngth Đờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) Đối EM-TK21 hấpTynd chứng al EM-TK21 Đối EM-TK21 Đối hấpớt chứng dạng chøng 120 C- 28.1 SA 27.2 SA 30.1 Vi khuÈn SA Biomas 30 28.0 0 27.2 0 30.0 0 28.0 0 26.8 0 28.5 0 SA 31.0 0 31.0 0 29.2 0 SA 29.5 0 29.2 0 29.4 0 Ghi chú: SA 4, SA vi khuẩn kháng thuèc kh¸ng khuÈn: S, F, OL, MTZ, PB, TE, F/M, N, ALM Đ/c1 : đối chứng nớc cất, Đ/c : níc cã pH = 3,5 B¶ng 3.35 cho thÊy EM-TK21 hấp Tyndal; hấp ớt 1200C/30' cho vòng vô khuẩn tõ (27,2 -31 mm), d¹ng Biomas tõ ( 26,8 - 29,4 mm) Mặc dù vi sinh vật EM- TK21 bị tiêu diệt nhiệt độ, nhng chất kháng khuẩn dịch chiết thảo mộc không bị phá huỷ cho vòng vô khuẩn tác dụng mạnh với chủng SA , SA kháng thuốc Đồng thời có ý nghĩa việc xác định tách chiết chất kháng khuẩn EM- TK21 nhiệt độ cao mà giữ nguyên hoạt lực kháng khuẩn 3.2.3.3.Kết kháng khuẩn EM-TK21 với Cl.perfringens Bảng 3.35 Kết kháng khuẩn EM-TK21 với Cl.perfringens (theo phơng pháp đặt ống trụ HEALEY) Chỉ tiêu đánh Đờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) giá EMEMEMEMNớc Nớc TK21 TK21 TK21 TK21 cất chỉnh Dạng tơi hấp hấp ớt dạng độ thử Tyndal 120 C- Bioma pH=3, LiỊu 30' s thư Vikhn C21 C 27 0,2ml 0,4ml 0,2ml 19,9 23,5 19,7 19,9 23,3 19,7 22 19,5 23,3 19,3 18,2 21,4 17,3 0 0 0 C30 0,4ml 0,2ml 0,2ml 23,3 19,8 23,4 23,2 19,8 23,2 23.2 19,5 23,3 21,4 17,4 21,4 0 0 0 Ghi chó: C21 lµ chđng vi khuẩn phân lập từ phân lợn tiêu chảy; C27 C30 chủng vi khuẩn phân lập từ phân lợn tiêu chảy kháng: Neomycin, Kanamycin, Norfloxacin, Tetracyclin, Streptomycin §/c1: Níc cÊt; §/c2: Níc cÊt ®· chØnh pH =3,5 Qua b¶ng 3.36 cho thÊy: Víi liỊu 0,2 ml EM-TK21 dạng Biomas có đờng kính vòng vô khuẩn từ (17,3 -17,4 mm); liều 0,4ml (21,4 mm) Tuy vòng vô khuẩn (17,4 mm) thấp nhất, nhng đối chiếu với qui định hoạt lực kháng sinh viện Philaxia (Hunggary) hãng Oxoid (Anh) vòng vô khuẩn mẫn cảm với vi khuẩn Cl.perfringgens Chứng tỏ dù bị tác động nhiệt EM-TK21 có tác dụng kháng khuẩn mạnh Cl perfringens kể chủng C27, C30 kháng thuốc Đồng thời cho thấy hoạt lực kháng khuẩn phụ thuộc vào liều lợng EM-TK21 liều cao tác dụng kháng khuẩn mạnh 3.3 Kết sử dụng EM-TK21 phòng, trị tiêu chảy lợn 190 ngày tuổi sản xt B¶ng 3.39 cho thÊy sư dơng EM-TK21 tû lƯ bảo hộ trung bình (81,33%), xấp xỉ tỷ lệ bảo hộ dùng kháng sinh (84,67) không mắc tiêu chảy Lô đối chứng tỷ lệ không mắc tiêu chảy trung bình (44,67%) Sử dụng chế phẩm EM-TK21 có khả bảo vệ tốt đàn lợn từ 1- 90 ngày tuổi tác dụng làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy, giảm tỷ lệ chết mà giúp thể lợn tăng trởng tốt Bảng 3.39 Kết phòng bệnh tiêu chảy EM-TK21 lợn 1-90 ngày 23 Chỉ tiêu theo dõi Sử dụng EM-TK21 ( n =50) Không mắc tiêu chảy Ngày Sử dơng Spectinomycin §èi chøng ( n = 50) ( n =50) Mắc tiêu chảy Không mắc tiêu chảy Không Mắc tiêu mắc tiêu chảy chảy Mắc tiêu chảy Số lSố Sè lSè lTû Sè lTû Tû Tû Sè l- Tû ti ỵng Tû lƯ lỵng ỵng ỵng lƯ ỵng lƯ lƯ lƯ ỵng lƯ (con (%) (co (con (con) (%) (con) (%) (%) (%) (con) (%) lỵn ) n) ) 1-21 37 74 13 26 38 76 12 24 26 52 24 48 2245 39 78 11 22 40 80 10 20 17 34 33 66 4690 46 92 49 98 40 80 10 20 24 3.3.2 Kết trị bệnh tiêu chảy EM-TK21 lợn 1-90 ngày Bảng 3.40 Kết trị bệnh tiêu chảy EMTK21 lợn 1-90 ngày Sử dụng EMChỉ TK21 tiêu (n = 50) theo dõi Ngày Sử dụng Cofacoli (n = 50) (n = 10) Khái M¾c Khái Mắc tiêu Mắc tiêu Chết bệnh tiêu bệnh chảy chảy tiêu chảy Số Tỷ Sốchảy Tỷ Số Tỷ Sè chÕt Tû lƯ lƯ co lƯ lƯ ti lỵn co con (%) n (%) n (%) 1-21 §èi chøng Sè (%) Tû lÖ (%) Sè Tû lÖ (%) 36 72 14 28 37 74 13 26 10 90 80 22-45 44 88 12 45 90 10 10 80 50 46-90 48 96 49 98 10 50 20 Bảng 3.40 cho thấy sử dụng EM-TK21 trị bệnh, tỷ lệ khỏi trung bình (85,33%); tỷ lệ không khỏi (14,7%) Điều trị kháng sinh tỷ lệ khỏi bệnh trung bình (87,33%); tỷ lệ không khỏi (12,66%) Chúng thấy hiệu trị bệnh EM-TK21 không thua so với hiệu thuốc kháng sinh ( 85,33% so víi 87,33%) NÕu sư dơng EM-TK21 kÞp thời, liều lợng thích hợp hiệu điều trị cao Sau điều trị lợn tăng trọng tốt, không bị còi cọc chậm lớn nh điều trị thuốc kháng sinh Tránh tợng tồn d kháng sinh sản phẩm thịt, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm sức khoẻ ngời tiêu dùng 25 Chơng Kết luận đề nghị I Kết luận; Từ kết nghiên cứu đây, rút mét sè kÕt luËn chÝnh nh sau: 1.1 Tæng sè vi khuẩn/1g phân lợn trạng thái khoẻ trung bình 132,64 x106.Vi khuẩn E.coli trung bình 70,51 x 106 /1g phân, Salmonella spp 26,9 x 106/1g phân, Cl.perfringens 77,12 x 106 /1g phân 1.2 Tổng số vi khuẩn /1g phân lợn trạng thái tiêu chảy 235,51 x 106, tổng số vi khuẩn tăng cao nhiều so với trạng thái khoẻ.(E.coli 153,55 x106/1g phân, Salmonellaspp 48,21x106/1g phân Cl.perfringens 699 x 106/1g phân) Các chủng E.coli, Salmonella spp Cl.perfringens tác nhân nguy hiểm gây tiêu chảy cho lợn 1- 90 ngày 2.1 Bằng phơng pháp PCR xác định đợc 100% số chủng E.coli sản sinh độc tố STb, số chủng sản sinh độc tố STa chiếm 61,56%, số chủng sản sinh độc tố LT chiếm 44,15%, số chủng mang loại độc tố (STa + STb + LT) chiÕm 68,53% - Sè chñng E.coli mang yÕu tố bám dính F4 (K88) 59,4%; F5 (K99) 7,5%; F6 lµ 14,1% vµ F18 lµ 9,4% 2.2 B»ng phản ứng khuyếch tán da thỏ xác định chđng Salmonella spp sinh ®éc tè thÈm xt nhanh (RPF) chiếm 60%, độc tố thẩm xuất chậm (DPF) 46,66% sinh loại độc tố (RPF + DPF) 33,33% - Bằng phơng pháp ngng kết hồng cầu trùc tiÕp ph¸t hiƯn sè chđng Salmonella spp mang kh¸ng nguyên bám dính chiếm tỷ lệ 84,6% 26 2.3 Kết xác định độc tố định type Cl perfringens phơng pháp PCR phát tổng số mẫu nghiªn cøu cã chđng Cl perfringens thc type A chiÕm 83,33% vµ chđng thc type D chiÕm 16,67% Không phát thấy Cl perfringens type B, C, E - Kết dung huyết 69 chủng Cl.perfringens kh¸c KiĨu dung hut kÐp chiÕm 75,36%, dung hut kiểu 12,5% Còn lại 10,14% không gây dung huyết Các chủng vi khuẩn phân lập có độc lực mạnh, gây chết chuột thí nghiệm 100%, thời gian gây chết là12 giờ, 18giờ, 24 36 Kết xác định đợc serotype kháng nguyên E.coli là: O64,O141,O149 Có 48,33% số chủng thuộc nhóm kháng nguyên O149, số chủng thuộc nhóm O141 21,66% 18,33% thuộc nhóm O64 Thuốc kháng sinh Colistin, Spectinomycin cã tû lƯ mÉn c¶m cao víi loại vi khuẩn: E.coli, Salmonella, Cl.perfringens Tỷ lệ kháng Colistin từ 54,2%- 70,83%; Spectinomycin từ 62,5%70,83% Nên sử dụng Spectinomycin Colistin để phòng, trị bệnh tiêu chảy cho lợn EM-TK21 có tác dụng diệt vi khuẩn E.coli, Salmonella spp Cl.perfringens tốt Sử dụng EM-TK21 để điều trị phòng bệnh tiêu chảy vi khuẩn gây có hiệu cao - Phòng bệnh tiêu chảy EM-TK21 đạt tỷ lệ bảo hộ 81,3% Tăng trọng trung bình 14kg/ con/ tháng lứa tuổi lợn - Điều trị tiêu chảy EM-TK21 đạt tỷ lệ khỏi bệnh 85,3% Sau điều trị lợn nhanh lớn, không bị còi cọc, hệ vi sinh vật đờng ruột ổn định II Đề nghị: 27 - Nghiên cứu sâu thêm chế tác dụng kh¸ng khn cđa chÕ phÈm EM-TK21 víi vi khn hiÕu khí yếm khí đờng ruột lợn - áp dụng rộng rãi chế phẩm EM-TK21 địa phơng để phòng, trị bệnh lợn bị tiêu chảy Đồng thời, mở réng so s¸nh víi c¸c chÕ phÈm sinh häc kh¸c đợc triển khai nghiên cứu số quan khoa học thuộc lĩnh vực chăn nuôi thó y 3.1.4.1 Sù biÕn ®éng vi khn E.coli phân lợn khoẻ tiêu chảy Bảng 3.4 cho thấy: phân lợn khoẻ tỷ lệ nhiễm E.coli (100%) biến động tăng dần theo tuổi lợn Số lợng vi khuẩn biến động từ (55,44) triệu nhóm lợn 1-21 ngày đến (90,96) triệu vi khuẩn nhóm lợn 46-90 ngày Số lợng vi khuẩn trung bình (70,51) triệu vi khuẩn gam phân 28 Trong phân lợn tiêu chảy, tỷ lệ nhiễm E.coli 100% giống lợn khoẻ, nhng số lợng vi khuẩn tăng cao Số lợng vi khn biÕn ®éng tõ 147,92 - 158,88 triƯu vi khn (thấp lợn 46-90 ngày tuổi cao lợn 1-21 ngày) Số lợng vi khuẩn trung bình 153,55 triệu vi khuẩn 1gam phân Nhóm 1-21 ngày số lợng vi khuẩn cao phân lợn khoẻ 2,86 lần (158,88 triệu so với 55,44 triệu vi khuẩn/1gam phân); nhóm 22 - 45 ngày cao phân lợn khoẻ 2,36 lần (153,85 triệu so với 65,14 triệu vi khuẩn/1gam phân) Nhóm 60-90 ngày tiêu chảy số lợng vi khuẩn cao phân lợn khoẻ 1,62 lần (147,92 triệu so với 90,96 triệu vi khuẩn/1gam phân) Số lợng vi khuẩn E.coli trung bình 1gam phân lợn tiêu chảy lứa tuổi lợn cao 2,28 lần so với lợn khoẻ Kết nghiên cứu cao kết Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1995)[] cho rằng, tỷ lệ nhiễm E.coli lợn khoẻ (14,66%), lợn tiêu chảy (33,84%); Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo (2000)[] cho rằng, tỷ lệ nhiễm E.coli lợn tiêu chảy biến động từ 64,5 -73% Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú cs (1989)[] cho rằng, tỷ lệ nhiễm E.coli lợn khoẻ (20%) lợn bị tiêu chảy mãn tính tỷ lệ nhiễm E.coli (100%) Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên cs (2004)[] cho rằng, tỷ lệ nhiễm E.coli phân lợn tiêu chảy từ 80% - 90% Bảng 3.4 Sự biến động vi khuẩn E coli phân lợn khoẻ tiêu chảy Chỉ tiêu Ngày Lợn khoẻ mạnh Số Tỷ mẫu lệ dkiểm ơng tra tính Lợn tiêu chảy Tăng( +)Giả Số lỵng vi Sè Tû Sè lỵng vi khn m(-) khn mÉu lƯ so víi kiĨ dSè lỵng vk/ Sè lỵng vk/g khoẻ m ơng khuẩn khuẩn lạc phân (triệu g tra tính lạc vk) 29 tuổi lợn 1-21 22-45 46-90 Tỉng sè (n) 37 (%) 100 X mX ph© n (TriÖ u) 10,2 0,8 55,4 12,6 0,5 65,1 38 100 40 17,5 0,9 90,9 100 115 100 13,4 (n) (%) 37 +103 36,2 158,8 ,44 100 1,20 8 2,86 lÇn 38 +88, 31,5 153,8 71 100 1,18 2,36 lÇn 40 29,9 147,9 100 1,30 70,5 115 30 100 X 32,5 mX (TriÖu ) +56, 96 1,62 lÇn +83, 153,5 04 2,18 lÇn 3.1.2 Sự biến động vi khuẩn Salmonella phân lợn khoẻ tiêu chảy Bảng 3.5 cho thấy: phân lợn khoẻ tỷ lệ nhiễm Salmonella spp biến động trung bình (77,68%) biến động tăng dần theo tuổi lợn Tỷ lệ nhiễm biến động từ (64,13%) nhóm lợn 1-21 ngày đến (88,88%) nhóm lợn 46-90 ngày Số lợng vi khuẩn cao lợn 46-90 ngày (31,66) triệu/1gam phân, thấp lợn 1-21 ngày (21,39) triệu vi khuẩn.Số lợng vi khuẩn trung bình (26,9) triệu vi khuẩn gam phân Trong phân lợn tiêu chảy, tỷ lệ nhiễm Salmonella spp biến động trung bình (93,53%) biến động tăng dần theo tuổi lợn Tỷ lệ nhiễm biến động từ (90,47%) nhóm lợn 1-21 ngày đến (98,66%) nhóm lợn 46-90 ngày, So với lợn khoẻ tỷ lệ nhiễm tăng (15,85%) Số lợng vi khn biÕn ®éng tõ 46,36 - 51,34 triƯu vi khuẩn (thấp lợn 46-90 ngày tuổi cao lợn 1-21 ngày) Số lợng vi khuẩn trung bình 48,21 triệu vi khuẩn 1gam phân Nhóm 1-21 ngày số lợng vi khuẩn cao phân lợn khoẻ 2,4 lần (51,34 triệu so với 21,39 triệu vi khuẩn/1gam phân); nhóm 22 - 45 ngày cao phân lợn khoẻ 1,69 lần (46,95 triệu so với 27,66 triệu vi khuẩn/1gam phân) Nhóm 46-90 ngày tiêu chảy số lợng vi khuẩn cao phân lợn khoẻ 1,46 lÇn (46,36 triƯu so víi 31,66 triƯu vi khn/1gam phân) Số lợng vi khuẩn Salmonella spp trung bình 1gam phân lợn tiêu chảy lứa tuổi lợn cao 1,79 lần so với lợn khoẻ Bảng 3.5 Sự biến động vi khuẩn Salmonella phân lợn khoẻ tiêu chảy Chỉ tiêu Ngày tuổi lợn 1-21 Lợn khoẻ mạnh Lợn tiêu chảy Số Tỷ lệ Số lợng vi khuẩn Số Tỷ lệ mẫu dơng Số lợng vk/ mẫu dkiể tính kiể ơng g khuẩn lạc m (%) phân m tÝnh mx tra x (TriÖu tra (%) (n) 37 ) Tăng(+) Giảm (-) so với Số lợng vk/g khoẻ khuẩn lạc phân (triệuvk (Triệu ) mx x ) Số lỵng vi khn (n) 64,1 56,5 0,60 21,39 31 37 90,4 10,4 +29,95 0,62 51,34 (2,4 lÇn) 38 80,0 70,2 0,55 27,66 46-90 40 88,8 65,4 0,23 31,66 Tỉng hỵp 115 22-45 77,6 64,0 38 91,4 8,92 0,86 46,95 +19,29 (1,69 lÇn) 40 98,6 9,18 0,67 46,36 +14,70 (1,46 lÇn) 93,5 9,50 +21,31 (1,79 lần) 26,90 115 48,21 *Kết định type huyết vi khuẩn Salmonella phân lập Bảng 3.11 Kết định serotype kháng nguyên O Salmonella phân lập Số TT Nhóm huyết Kết giám định Số chủng nghiên cứu Dơng tính (+) Tỷ lÖ (%) B1 (1,4,5,12) 20 20 D1 (1,9,12) 20 45 E4(3),(16), (24) 20 35 B¶ng 3.11 cho thÊy: sè chđng Salmonella thc nhãm D1 chiÕm tû lƯ lµ (45%); sè chđng thc nhãm B1 tû lƯ lµ (20%) vµ sè chđng thc nhãm E4 tỷ lệ (35%) Sau xác định đợc serotype kháng nguyên chủng Salmonella kháng huyết O đơn giá (dựa vào kết bảng 3.11), tiếp tục xác định serotype vi khuẩn Salmonella phân lập đợc Bảng 3.12 Kết định serotype vi khuẩn Salmonella phân lập 32 Kháng nguyên O Kháng nguyên H "H" pha "H" pha Nhãm Sèm Thµnh Thµnh Éu phÇn phÇn Sè mÉu (+) Tû lƯ (%) B1 i 1, 20 D1 E4 20 c g, m 1, 1, 20 45 35 100 Tªn vi khuÈn Salmonella S typhimurim S.cholerae suis S enteritidis Qua bảng 3.12 thấy: chđng D1 lµ S.choleraesuis chiÕm tû lƯ (45%); chđng E4 lµ S.enteritidis chiÕm tû lƯ (35 %) vµ B1 lµ chđng S typhimurium tû lƯ lµ (20%) Nh vËy, sù có mặt nhiều (chiếm 45%) phân lợn tiêu chảy chủng Salmonella thuộc nhóm D1 Chính chủng S cholerae suis gây bệnh tiêu chảy cho lợn theo mẹ địa bàn lấy mẫu nghiên cứu 33 Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1996) cho rằng, tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy chủng S choleraesuis gây (60%); chủng S.typhimurium S.enteritidis (20%) Trần Xuân Hạnh, 1995 mắc tiêu chảy chủng S choleraesui tỷ lệ 38,7% ( tỷ lệ lợn khỏe 2,8%); chủng S typhimurium tỷ lệ 16,9%; chủng S.derby 11,3%; lại chủng khác Theo Lê Văn Tạo cộng sù, 1993[63] chđng S choleraesui chiÕm tû lƯ lµ 50%, chđng S typhimurium chØ cã 6,25% KÕt qu¶ thấp kết tác giả Một số chủng Salmonella mà xác định serotype nêu thờng Serotype phổ biến thờng xuyên tìm thấy lợn đợc nhiều tác giả nghiên cứu Đồng thời, lợn mắc tiêu chảy việc phát có tỷ lệ cao chủng S enteritidis S choleraesuis cho thấy vai trò serotype bệnh Phó thơng hàn lợn Sự phát triển bệnh serotype gây dẫn đến tình trạng lợn bị bội nhiễm vi khuẩn Salmonella gây phát bệnh dẫn đến chÕt lỵn 34 ... phòng, trị bệnh tiêu chảy cho lợn EM-TK2 1 cã t¸c dơng diƯt vi khn E.coli, Salmonella spp Cl .perfringens tốt Sử dụng EM-TK2 1 để điều trị phòng bệnh tiêu chảy vi khuẩn gây có hiệu cao - Phòng bệnh. .. Kết phòng bệnh tiêu chảy EM-TK2 1 lợn 1-9 0 ngày 23 ChØ tiªu theo dâi Sư dơng EM-TK2 1 ( n =50) Không mắc tiêu chảy Ngày Sử dụng Spectinomycin Đối chứng ( n = 50) ( n =50) Mắc tiêu chảy Không mắc tiêu. .. trị bệnh tiêu chảy EMTK21 lợn 1-9 0 ngày Sử dụng EMChỉ TK21 tiêu (n = 50) theo dâi Ngµy Sư dơng Cofacoli (n = 50) (n = 10) Khỏi Mắc Khỏi Mắc tiêu Mắc tiêu Chết bệnh tiêu bệnh chảy chảy tiêu ch¶y