ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH cầu TINH DỊCH và mối LIÊN QUAN GIỮA BẠCH cầu với một số CHỈ số TINH DỊCH đồ ở NAM GIỚI vô SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN VĂN HƯỞNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN VĂN HƯỞNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền Mã số : ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng HÀ NỘI - 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Sự hình thành biệt hóa tinh trùng .3 1.1.1 Đại cương trình hình thành tinh trùng người .3 1.1.2 Quá trình sinh tinh tinh hoàn 1.1.3 Sự thục tinh trùng mào tinh hoàn 1.2 Các loại tế bào tinh dịch 1.2.1 Tế bào sinh tinh 1.2.2 Tế bào không sinh tinh .10 1.3 Các phương pháp phát bạch cầu tinh dịch 12 1.3.1 Phương pháp nhuộm esterase 12 1.3.2 Phương pháp nhuộm elastase 12 1.3.3 Phương pháp nhuộm peroxidase .13 1.3.4 Phương pháp đo gốc tự oxy hóa BC tinh dịch Chemiluminescence 13 1.3.5 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch BC kháng thể đơn dòng .14 1.4 Các nghiên cứu nước giới bạch cầu tinh dịch 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 15 2.2.2 Các quy trình kỹ thuật 17 2.2.3 Phương pháp thu thập thông tin .18 2.3 Phân tích xử lý số liệu 18 2.4 Sai số cách khống chế: 18 2.4.1 Sai số .18 2.4.2 Cách khắc phục 19 2.5 Đạo đức nghiên cứu 19 Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 20 3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 20 3.2 Số lượng bạch cầu tinh dịch 21 3.3 Mối liên quan bạch cầu với số lượng, hình thái, độ di động tinh trùng 22 3.3.1 Tương quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng 22 3.3.2 Tương quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng 22 3.3.3 Tương quan số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng .23 Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN .24 4.1 Phương pháp phát bạch cầu tinh dịch phương pháp nhuộm peroxidase .24 4.2 Ti lệ mẫu có số lượng BC cao tong tinh dịch 24 4.3 Mối liên quan số lượng bạch cầu tinh dịch với số lượng, hình thái, độ di động tinh trùng 24 KẾT LUẬN 25 KIẾN NGHỊ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BC : Bạch cầu KHV : Kính hiên vi PMN : Polymorphonuclear leukocytes WHO : World Health Organization DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Tỉ lệ phần trăm số mẫu có số lượng “tế bào khác” cao tinh dịch 21 Bảng 3.2: Tỉ lệ phần trăm số mẫu số lượng bạch cầu cao tinh dịch 21 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ vô sinh I theo thời gian .20 Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ vô sinh II theo thời gian 20 Biểu đồ 3.3: Biểu lâm sàng viêm đường sinh dục tiết niệu 21 Biểu đồ 3.4 Tương quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng 22 Biểu đồ 3.5 Tương quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng 22 Biểu đồ 3.6 Tương quan số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng 23 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Q trình hồn thiện tinh trùng .7 Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành ĐẶT VẤN ĐỀ Tinh dịch đồ xét nghiệm đánh giá chức sinh sản nam giới độ tuổi sinh sản Hiện nay, có nhiều xét nghiệm chức sinh sản nam triển khai như: tinh dịch đồ, tìm tinh trùng nước tiểu, mức độ stress oxy hóa tinh dịch…Trong tinh dịch đồ xét nghiệm đầu tay phổ biến chứa đựng nhiều số quan trọng trước người bác sĩ đưa định trường hợp có bất thường kết tinh dịch đồ[1][2] Trong tinh dịch người, tinh trùng trưởng thành có loại tế bào tế bào bong, tinh trùng non, bạch cầu Các tế bào gọi chung “tế bào khác”, hay “tế bào tròn” để phân biệt với tinh trùng trưởng thành Số lượng tế bào khác tinh dịch bình thường cho phép triệu/ml [3] Khi tê bào tăng mức cho phép, dù bạch cầu hay tinh trùng non đề nguyên nhân gây vô sinh nam giới Tuy nhiên, với phương pháp nhuộm thông thường Giemsa hay Papanicolau KHV quang học phân biệt phân biệt loại tế bào Đặc biệt bạch cầu tinh dịch cần phân biệt với loại tế bào lại để định hướng chẩn đoán điều trị trường hợp viêm nhiễm đường sinh dục tiết niệu Ngược lại, tinh dịch chứa nhiều tế bào tinh trùng non thường dấu hiệu bệnh lý tổn thương tinh hoàn, trình biệt hóa tinh trùng chưa hồn chỉnh Việc phân loại tế bào nhiều mức tinh dịch tế bào sinh tinh non hay bạch cầu có vai trò quan trọng chẩn đốn định điều trị [4] [5] Nhận thấy cần thiết tính khả thi vấn đề trên, góp phần chẩn đốn xác số tình trạng viêm nhiễm đường sinh dục nam, hỗ trợ chức sinh sản nam giới, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu tinh dịch mối liên quan bạch cầu số số tinh dịch đồ” Mục tiêu đề tài: Phát bạch cầu tinh dịch phương pháp nhuộm peroxidase Phân tích mối liên quan bạch cầu với số lượng, độ di động hình thái tinh trùng Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự hình thành biệt hóa tinh trùng 1.1.1 Đại cương q trình hình thành tinh trùng người Tinh trùng giao tử đực người mang nhiễm sắc thể đơn bội (n=23), loại tế bào có mức độ biệt hóa cao để thực chức sinh sản Quá trình sinh tinh phụ thuộc vào phát triển tinh hồn thời kì bào thai (bắt đầu vào khoảng tuần 4-6) Ở giai đoạn này, tế bào mầm sinh dục nguyên thủy gờ sinh dục bắt đầu tăng sinh, số bị thối hóa, số lại biệt hóa thành tiền tinh ngun bào ngưng lại giai đoạn Đến khoảng từ lúc sinh đến tháng tuổi, tiền tinh nguyên bào bắt đầu biệt hóa thành tinh nguyên bào tăng sinh Đến lúc dậy thì, tinh nguyên bào bắt đầu giảm phân để tạo thành tinh bào Tinh trùng sinh ống sinh tinh tinh hồn sau di chuyển vào mào tinh để hoàn thành trưởng thành cuối trước xuất tinh Nếu khơng có tượng phóng tinh tinh trùng chết, thối hóa hấp thụ tế bào biểu mơ mào tinh hồn Vào thời điểm phóng tinh tinh trùng di chuyển dọc theo ống dẫn theo, sau trộn lẫn với dịch tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến hành niệu đạo cuối tống xuất ngồi theo đường niệu đạo Q trình hình thành tinh trùng lúc dậy tiếp diễn liên tục lúc chết Quá trình sinh tinh q trình hiệu (mỗi ngày có 150 triệu tinh trùng tạo tinh hồn) q trình thụ tinh q trình khơng hiệu có hàng trăm triệu tinh trùng vào đường sinh dục nữ có tinh trùng thụ tinh cho trứng để tạo hợp tử Do đó, q trình sinh tinh giảm sút có tác động cá yếu tố vật lý, hóa học, sinh học hay ngồi thể số lượng chất lượng khơng đảm bảo làm cho q trình thụ tinh bị ảnh hưởng dẫn tới thiểu sinh sản [6][7][8] 1.1.2 Q trình sinh tinh tinh hồn Q trình hình thành tinh trùng tinh hoàn thực chất trình phát triển phân bào tinh nguyên bào (2n) chưa biệt hóa khơng có khả thụ tinh thành tinh trùng (1n) có độ biệt hóa cao khả thụ tinh gặp trứng Đây trình diễn liên tục ống sinh tinh tinh hoàn nam giới từ lúc dậy lúc chết Mỗi tinh nguyên bào phải trải qua giai đoạn để trở thành tinh trùng: ♦ Giai đoạn tinh nguyên bào: giai đoạn tinh nguyên bào phân bào nguyên nhiễm để tạo thành loại tinh nguyên bào tinh bào I để cung cấp cho trình sinh tinh ♦ Giai đoạn tinh bào: giai đoạn tinh bào phân chia giảm nhiễm lần để tạo tinh tử đơn bội ♦ Giai đoạn tinh tử: giai đoạn tinh tử biến đổi phận đuôi, nhân, Golgi, ti thể để biệt hóa thành tinh trùng trưởng thành có chức Các giai đoạn diễn đồng thời liên tục ống sinh tinh tinh hoàn, tế bào mầm nguyên thủy biệt hóa thành tinh ngun bào q trình ngừng lại tuổi dậy tiếp tục Ở tuổi dậy thì, ngày tinh hồn sản xuất từ 50-150 triệu tinh trùng [9][10] Quá trình diễn liên tục suốt đời người nam giới bắt đầu giảm từ tuổi 40 ♦ Giai đoạn tinh nguyên bào 16 Thu thập thông tin bệnh nhân Tên, tuổi, địa Có biểu viêm nhiễm hay khơng Lay mẫu tinh dịch (kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày) tinh trùng giá độ di động tinhĐánh trùnggiá số lượng “tế bào khác” Đánh giá số Đánh giá hình thái Đánh lượng tinh tùng Tế bào khác ≤ triệu/ml Tế bào khác > triệu/ml Nhuộm peroxidase Tính tỉ lệ mẫu có bất thường số lượng bạch cầu tinh dịch Phân tích mối liên quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng Phân tích mối liên quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh tùng Phân tích mối liên quan số lượng bạch cầu với tốc độ tinh trùng 17 Cỡ mẫu: n= Trong đó: - n : Số mẫu cần thu thập - : Mức ý nghĩa thống kê, lấy giá trị =0,05 - Z 1-/2: Giá trị tới hạn phân bố chuẩn với mức ý nghĩa phía sai lầm  ấn định (Z1-/2 = 1,96) - p: theo nghiên cứu giới cho thấy tỷ lệ xuất bạch cầu tinh dịch 10% [12] - = Sai số mong muốn (=0,05) Vậy n = 139 Thực tế thu thập…….mẫu 2.2.2 Các quy trình kỹ thuật ♦ Quy trình nhuộm peroxidase (sử dụng kit Viscosity-BR Viscosity-CH hãng Sperm Prosessor Pvt Ltd, India FDA phê duyệt)  (1) Bước 1: Dán nhãn đánh dấu mã bệnh nhân mẫu  (2) Bước 2: Đo thể tích tinh dịch (đơn vị mililit)  (3) Bước 3: Lấy 0,9ml dung dịch Reagent-I vào micro tube  (4) Bước 4: Thêm 0,1ml tinh dịch hóa lỏng mix (2) vào micro tube  (5) Bước 5: Mix micro tube  (6) Bước 6: Thêm giọt Reagent-II vào micro tube, lắc 1-2 phút  (7) Bước 7: Đê micro tube nhiệt độ phòng 20-30 phút Đánh giá kết nhuộm * (1) Lấy 10µL dung dịch nhuộm vào buồng phần tích tinh dịch buồng độ sâu 10µm đậy lamen * (2) Kiểm tra 10 vi trường KHV vật kính x40 18 * (3) Đếm: - Số lượng BC 10 vi trường - Số lượng BC bắt màu nâu (dương tính với peroxidase) 10 vi trường ♦ Đánh giá số lượng tinh trùng ♦ Đánh giá độ di động tinh trùng ♦ Đánh giá hình thái tinh tùng 2.2.3 Phương pháp thu thập thông tin 2.2.3.1 Kỹ thuật thu thập thông tin - Khai thác hồ sơ bệnh án phương pháp hỏi bệnh làm bệnh án - Thu thập số tinh dịch xét nghiệm tinh dịch đồ máy Casa: mật độ, tỷ lệ sống, độ di động, bất thường hình thái, thể tích pH 2.2.3.2 Các số nghiên cứu - Đặc điểm tình hình bệnh nhân: tuổi giới, trình độ văn hóa, nghề nghiệp - Các số tinh dịch đồ: mật độ, tỷ lệ sống, độ di động, bất thường hình thái, thể tích pH - tỷ lệ bạch cầu tinh dịch 2.3 Phân tích xử lý số liệu Quản lý số liệu Excel 2010 xử lý số liệu thu thập phần mềm SPSS phiên 20.0 2.4 Sai số cách khống chế: 2.4.1 Sai số Trong trình lấy mẫu Trong trình làm tinh dịch đồ Trong trình nhuộm peroxidase đếm số lượng bạch cầu Trong trình nhập xử lý số liệu 19 2.4.2 Cách khắc phục  Trong trình lấy mẫu: Lấy mẫu theo quy định như: - Kiêng quan hệ từ 3-5 ngày trước lấy mẫu - Vệ sinh tay trước lấy mẫu - Tinh dịch lấy tay thủ dâm xuất tinh trực tiếp vào lọ đựng mẫu - Lọ đựng tinh dịch phải tiệt trùng làm loại nhựa không ảnh hưởng đến tinh trùng - Không lấy mẫu cách quan hệ  Trong trình làm tinh dịch đồ: - Tuân thủ bước làm xét nghiệm tinh dịch đồ  Trong trình nhuộm peroxidase đếm số lượng bạch cầu - Tuân thủ bước theo protocol - Đếm số lượng bạch cầu cách cẩn thận tránh bỏ sót  Trong q trình nhập xử lý số liệu - Số liệu kiểm tra lại trước nhập vào phần mềm - Cần nhập liệu cẩn thận, nhập xong phiếu kiểm tra lại lượt phiếu chuyển sang nhập phiếu 2.5 Đạo đức nghiên cứu - Bệnh nhân giải thích rõ mục đích nghiên cứu, lợi ích có đóng góp cho khoa học phương pháp xét nghiệm - Bệnh nhân hồn tồn tự nguyện tham gia nghiên cứu có ký giấy cam kết - Thông tin bệnh nhân đảm bảo bí mật tuyệt đối - Số liệu phân tích bệnh nhân sử dụng cho nghiên cứu khơng dùng cho mục đích khác 20 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu Vô sinh I ≤1 năm >1 đến 1 đến 1-2 khác 2-3 triệu/ml triệu/ml Số lượng tế bào khác >3 triệu/ml Tỉ lệ phần trăm Bảng 3.2: Tỉ lệ phần trăm số mẫu số lượng bạch cầu cao tinh dịch Số lượng bạch cầu >1-2 triệu/ml Số lượng bạch cầu 2-3 triệu/ml Số lượng bạch cầu >3 triệu/ml Tỉ lệ phần trăm 3.3 Mối liên quan bạch cầu với số lượng, hình thái, độ di động tinh trùng 22 Số lượng tnh trùng (triệu/ml) 3.3.1 Tương quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng 100 80 60 40 f(x) = - 6.99x + 45.15 R² = 0.03 20 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Số lượng bạch cầu (triệu/ml) Biểu đồ 3.4 Tương quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng hình thái bất thường tinh trùng 3.3.2 Tương quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng 100 80 60 40 f(x) = - 6.99x + 45.15 R² = 0.03 20 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Số lượng bạch cầu (triệu/ml) Biểu đồ 3.5 Tương quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng 23 3.3.3 Tương quan số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng độ di động tinh trùng (%) 100 80 60 40 f(x) = - 6.99x + 45.15 R² = 0.03 20 0 0.5 1.5 2.5 3.5 Số lượng bạch cầu (triệu/ml) Biểu đồ 3.6 Tương quan số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng 24 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Phương pháp phát bạch cầu tinh dịch phương pháp nhuộm peroxidase 4.2 Ti lệ mẫu có số lượng BC cao tong tinh dịch 4.3 Mối liên quan số lượng bạch cầu tinh dịch với số lượng, hình thái, độ di động tinh trùng 25 KẾT LUẬN Dự kiến kết luận theo mục tiêu Tỉ lệ mẫu có BC cao tinh dịch Tỉ lệ mẫu có tế bào bất thường cao BC tinh dịch Mối liên quan bạch cầu với số lượng, độ di động hình thái tinh trùng KIẾN NGHỊ 26 Dự kiến kiến nghị theo kết TÀI LIỆU THAM KHẢO WHO (2010), WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, fifth edition Trần Đức Phấn, Phan Thị Hoan, Nguyễn Xuân Tùng (2010) Sử dụng máy CASA xét nghiệm tinh dịch điểm cần lưu ý trả lời kết xét nghiệm tinh dịch Y học thực hành 727 (7), 56 - 61 WHO (2000), WHO manual for the standardized investigation, diagnosis, and management of the infertile male, Cambridge University Press, 32-35 Trần Quán Anh, Nguyễn Bửu Triều (2009), Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất Y học, 88-95 Johanisson (2000), Evaluation of ‘round cell’ in semen analysis: a comparative study Nguyễn Khắc Liêu (2003), Chẩn đoán điều trị vô sinh, Nhà xuất Y học Ngô Gia Hy (2000), Hiếm muộn vô sinh nam, Nhà xuất Thuận Hóa Irvine D.S (2002) Male infertility: Causes and management Medical progress Nguyễn Xuân Bái (2002), Nghiên cứu đặc điểm tinh dịch đồ 1000 cặp vợ chồng thiểu sinh sản, Luận văn thạc sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 10 J H Clein (2001), “Sự thụ tinh”, Thụ tinh ống nghiệm, NXB Y học, tr 91 – 104 11 WHO (1999), WHO laboratory manual for the Examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, fourth edition, United Kongdom 12 Johanisson (2000), Evaluation of ‘round cell’ in semen analysis: a comparative study 13 Couture (1976), Improved staining method for differentiating immature germ cells from white blood cells in human semenfluid 14 Homyk (1990), Differential diagnosis of immature germ cells in semen utilizing monoclonal antibody MHS-10 to the intra-acrosomal antigen SP-10 15 Ezeh (1998), Soy lecithin replaces egg yolk for cryopreservation of human sperm without adversely affecting postthaw motility, morphology, sperm DNA integrity, or sperm binding to hyaluronate 16 J Fedder (1996) Nonsperm Cells in Human Semen: With Special Reference to Seminal Leukocytes and their Possible Influence on Fertility Journal of Reproductive Systems p.41-65 17 Wolff H1 (1995) The biologic significance of white blood cells in semen Fertin steril PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Ngày làm bệnh án: I- HÀNH CHÍNH Mã số BA: Họ tên BN: Tuổi: Địa chỉ: Nghề nghiệp: Điện thoại: II- LÝ DO ĐI KHÁM Lý khám: Khám lần thứ: III-TIỀN SỬ Lối sống: - Thuốc lá: điếu/ ngày Số năm hút: - Bia, rượu: cốc/chén/ ngày - Luyện tập thể thao: - Số lần ăn đậu phụ, uống sữa đậu nành/tuần: - Số lần ăn hải sản, thịt đỏ/tuần: Bệnh lý toàn thân: - Bệnh toàn thân từ trước đến ( Xơ gan, tiểu đường, béo phì, bệnh tự miễn, tiếp xúc hóa chất, phóng xạ, thuốc gây vơ sinh….) : - Trong vòng tuần trở lại đây: + Có sốt khơng: + Có căng thẳng, stress khơng: + Có ngộ độc hóa chất, phóng xạ khơng: - Bệnh lý phận sinh dục: + Tiền sử chấn thương: + Tiền sử phẫu thuật: + Tiền sử viêm nhiễm (lậu, giang mai,…): IV- KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM Kết tinh dịch đồ Hình thái tinh trùng bất Thể tích pH Mật Tổn % độ g sống thường Đầu Cổ Đuôi Bào tương Tế Vận bào tốc c Bạc h cầu ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN VĂN HƯỞNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH. .. thường số lượng bạch cầu tinh dịch Phân tích mối liên quan số lượng bạch cầu với số lượng tinh trùng Phân tích mối liên quan số lượng bạch cầu với hình thái tinh tùng Phân tích mối liên quan số lượng... chức sinh sản nam giới, tiến hành nghiên cứu đề tài: Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu tinh dịch mối liên quan bạch cầu số số tinh dịch đồ Mục tiêu đề tài: Phát bạch cầu tinh dịch phương pháp