HOÀN THIỆN kĩ THUẬT REALTIME PCR để xác ĐỊNH đột BIẾN GEN BRAF v6 từ các mẫu BỆNH PHẨM ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ======= BÙI THỊ LÀNH HOÀN THIỆN KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V6 TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ======= BỘ Y TẾ BÙI THỊ LÀNH HOÀN THIỆN KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V6 TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền Mã số : 62720111 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Trang PGS.TS Nguyễn Quang Trung HÀ NỘI - 2019 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARMS – PCR : Amplification refactory mutation system – PCR ATC : Ung thư tuyến giáp biệt hóa DNA : Deoxynucleotid acid FTC : Ung thư tuyến giáp thể nang Kb : Kilobase pair MTC : Ung thư tuyến giáp thể tủy OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PTC : Ung thư tuyến giáp thể nhú UTTG : Ung thư tuyến giáp MỤC LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tuyến giáp bệnh ác tính nội tiết phổ biến với tỷ lệ mắc gia tăng nhanh chóng nhiều khu vực giới [1], [2], [3] Tại Mỹ, gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ung thư tuyến giáp nhanh nhất, với 50.000 ca mắc, chiếm tỷ lệ 3% số tất ca ung thư tính tới thời điểm [4] Ung thư tuyến giáp phân loại theo mô bệnh học thành nhóm chính: ung thư tuyến giáp dạng nhú (PTC), ung thư tuyến giáp dạng nang (FTC), ung thư tuyến dạng dạng tủy (MTC) ung thư tuyến giáp biệt hóa (ATC) Trong PTC chiếm tỷ lệ cao nhất, 80% [5] Đây nhóm ung thư có tiên lượng tốt với tỷ lệ sống sau năm 90%, bệnh hồn tồn chữa khỏi phát sớm điều trị kịp thời Tuy nhiên tỷ lệ tái phát sau điều trị tăng đáng kể theo thời gian, khoảng 20% sau 10 năm, 30% sau 30 năm theo dõi [6] Việt Nam nằm nhóm nước có tỷ lệ mắc ung thư tuyến giáp cao Theo Globocan 2018, ung thư tuyến giáp nằm nhóm mười ung thư phổ biến Lý giải gia tăng này, nhiều nghiên cứu vai trò việc chẩn đốn bệnh giai đoạn sớm phương tiện chẩn đoán tiên tiến, đại với độ nhạy, độ đặc hiệu cao [7] Chính việc nghiên cứu tìm hiểu chế bệnh sinh ung thư để từ tìm phương pháp chẩn đốn can thiệp kịp thời mối quan tâm hàng đầu nhà Y- sinh học Những phát chế bệnh sinh mức độ phân tử cho thấy ung thư tuyến giáp kết tích lũy đột biến gen Những đột biến gen làm suy giảm tăng cường mức tín hiệu tế bào gây rối loạn q trình phát triển, phân chia, biệt hóa, chết theo chương trình (apotosis) dẫn đến phát sinh ung thư Nhiều đột biến phát ung thư tuyến giáp bao gồm: đột biến gen gây ung thư, đột biến gen ức chế khối u đột biến gen sửa chữa Trong phải kể đến vai trò đột biến gen BRAF V600E chẩn đoán, tiên lượng điều trị bệnh [8], [9] Việc xét nghiệm tìm đột biến bệnh nhân ung thư tuyến giáp đặc biệt trước phẫu thuật có ý nghĩa vơ to lớn Nó khơng kết hợp với phương pháp chọc hút tế bào kim nhỏ để tăng khả phát ung thư mà có giá trị tiên lượng định hướng giúp bác sĩ lâm sàng lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho bệnh nhân [10] Tại Việt Nam xét nghiệm chưa phổ biến, giá thành cao Vì chúng tơi thực đề tài: “ Hồn thiện kỹ thuật Realtime-PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư tuyến giáp” với hai mục tiêu sau: Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư tuyến giáp Xác định tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E bệnh nhân ung thư tuyến giáp kỹ thuật Realtime-PCR Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm tình hình mắc ung thư tuyến giáp 1.1.1 Khái niệm Tuyến giáp tuyến nội tiết lớn thể, có trọng lượng 20-25 g người trưởng thành, nằm vị trí trước cổ, ngang đốt sống cổ đến đốt sống ngực 1, sụn nhẫn, trước khí quản Vai trò sản xuất hormone T4 (Tetra-iod-thyronin) T3 (Tri-iod-thyronin) điều hòa chuyển hóa hoạt động số quan thể Hình 1.1: Giải phẫu tuyến giáp Ung thư tuyến giáp loại ung thư có nguồn gốc chủ yếu từ hai loại tế bào bao gồm tế bào nang giáp tế bào C cận nang 1.1.2 Phân loại ung thư tuyến giáp ( UTTG) Theo mô bệnh học chia làm nhóm chính: 10 - Ung thư tuyến giáp thể nhú (PTC): chiếm tỷ lệ 70- 80%, thể dễ chữa khỏi tiến triển chậm Bệnh nhân dễ có di hạch cổ tiên lượng tốt - Ung thư tuyến giáp thể nang (FTC): chiếm tỷ lệ 10-15% có di hạch cổ tốc độ tiến triển nhanh Cũng có khả di xa vào xương hay hai phổi - Ung thư tuyến giáp thể tủy (MTC): chiếm tỷ lệ 5-10%, nguồn gốc từ tế bào C cận nang, dạng ung thư liên quan đến vấn đề nội tiết yếu tố di truyền gen gia đình - Thể khơng biệt hóa (ATC): chiểm tỷ lệ 2% thể khó tiên lượng, ác tính khó có khả điều trị khỏi 1.1.3 Các phương pháp điều trị UTTG Tùy thể, giai đoạn, tình trạng người bệnh mà bác sỹ lâm sàng lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp Các phương pháp điều trị bao gồm: - Phẫu thuật: Phẫu thuật tuyến giáp biết đến từ năm trước công nguyên với phẫu thuật viên Galen tác giả Albucais ( Ả Rập) ngày vai trò chiếm vị trí quan trọng, biện pháp chính, lựa chọn đầu tay cho hầu hết bệnh nhân ung thư tuyến giáp - Điều trị I 131 : mục đích tiêu hủy mơ giáp lại sau phẫu thuật, tiêu diệt tổn thương vi di di xa khơng có khả phẫu thuật Liều I 131 thường dùng 50-200mCi giai đoạn chưa có di xa Có thể nâng liều lên tới 500mCi có di xa - Điều trị hormon thay thế: Liệu pháp hormon thay bổ sung lượng T3, T4 ngoại sinh, giúp tạo nên nồng độ cao hormon máu, gián tiếp thông qua tuyến đồi tuyến yên làm giảm hoạt động phát triển tế bào tuyến giáp thể, giúp trì bệnh ổn định lâu dài Theo khuyến cáo nhà ung thư học Mỹ, hormon hay dùng Lovothyroxin 38 Biểu đồ 3.1: Đặc điểm giới tính Nhận xét: 3.2.1.3 Các yếu tố tiên lượng Bảng 3.4: Đặc điểm yếu tố tiên lượng ung thư tuyến giáp Đặc điểm Kích thước khối u Giai đoạn Di hạch cổ Di xa Nhận xét: Tỷ lệ (N=) 39 3.2.2 Phân bố kiểu gen đối tượng nghiên cứu Bảng 3.5: Phân bố kiểu gen BRAF V600E mẫu máu Gen BRAF V600E Tần số kiểu gen Bình Dị hợp tử thường Đồng (Wild (Homozygous type) (Heterozygou ) Tần số alen hợp tử ) Alen T Alen A (Wild type (Mutant allele) allele) Mẫu máu Nhận xét: Bảng 3.6: Phân bố kiểu gen BRAF V600E mẫu mô Gen BRAF V600E Tần số kiểu gen Bình Nhận xét: Đồng hợp thường Dị hợp tử tử (Wild (Heterozygou) (Homozygous type) Mẫu mô Tần số alen ) Alen T Alen A (Wild type (Mutant allele) allele) 40 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Bàn luận hồn thiện quy trình kỹ thuật Real – time PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư tuyến giáp 4.2 Bàn luận so sánh kết Real – time PCR kết giải trình tự 4.3 Bàn luận ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E đối tượng nghiên cứu DỰ KIẾN KẾT LUẬN 41 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 42 DỰ KIẾN KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU TT THỜI GIAN NỘI DUNG CÔNG VIỆC Tháng 7/2019 Thông qua đề cương nghiên cứu Từ tháng 7/2019 – tháng 5/2020 Thu thập số liệu nghiên cứu Từ tháng 5/2020 – tháng 6/2020 Xử lý số liệu Tháng 7/2020 – tháng 8/2020 Viết chỉnh sửa luận án Tháng 9/2020 Bảo vệ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Davies L and Welch H.G (2006) Increasing Incidence of Thyroid Cancer in the United States, 1973-2002 JAMA, 295(18), 2164 Leenhardt L., Grosclaude P., and Chérié-Challine L (2004) Increased Incidence of Thyroid Carcinoma in France: A True Epidemic or Thyroid Nodule Management Effects? Report from the French Thyroid Cancer Committee Thyroid, 14(12), 1056–1060 SEER Cancer Statistics Review 1975-2004 - Previous Version - SEER Cancer Statistics Thyroid Cancer - Cancer Stat Facts A National Cancer Data Base report on 53,856 cases of thyroid carcinoma treated in the U.S., 1985‐1995 - Hundahl - 1998 - Cancer - Wiley Online Library Mazzaferri E.L and Jhiang S.M (1994) Long-term impact of initial surgical and medical therapy on papillary and follicular thyroid cancer Am J Med, 97(5), 418–428 Increasing incidence of thyroid cancer is due to increased pathologic detection - Surgery Cohen Y., Xing M., Mambo E., et al (2003) BRAF Mutation in Papillary Thyroid Carcinoma JNCI J Natl Cancer Inst, 95(8), 625–627 Xing M (2007) BRAF Mutation in Papillary Thyroid Cancer: Pathogenic Role, Molecular Bases, and Clinical Implications Endocr Rev, 28(7), 742–762 10 BRAF Mutation Testing of Thyroid Fine-Needle Aspiration Biopsy Specimens for Preoperative Risk Stratification in Papillary Thyroid Cancer | Journal of Clinical Oncology 11 Xing M (2005) BRAF mutation in thyroid cancer Endocr Relat Cancer, 12(2), 245–262 12 Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., et al (2018) Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA Cancer J Clin, 68(6), 394–424 13 Key Statistics for Thyroid Cancer 14 Jemal A., Siegel R., Xu J., et al (2010) Cancer Statistics, 2010 CA Cancer J Clin, 60(5), 277–300 15 Dal Maso L., Lise M., Zambon P., et al (2011) Incidence of thyroid cancer in Italy, 1991-2005: time trends and age-period-cohort effects Ann Oncol, 22(4), 957–963 16 Enewold L., Zhu K., Ron E., et al (2009) Rising Thyroid Cancer Incidence in the United States by Demographic and Tumor Characteristics, 1980-2005 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 18(3), 784–791 17 Williams D (2008) Radiation carcinogenesis: lessons from Chernobyl Oncogene, 27(S2), S9–S18 18 Memon A., Godward S., Williams D., et al (2010) Dental x-rays and the risk of thyroid cancer: A case-control study Acta Oncol, 49(4), 447–453 19 Nikiforova M.N (2000) Proximity of Chromosomal Loci That Participate in Radiation-Induced Rearrangements in Human Cells Science, 290(5489), 138–141 20 Schmid D., Behrens G., Jochem C., et al (2013) Physical activity, diabetes, and risk of thyroid cancer: a systematic review and metaanalysis Eur J Epidemiol, 28(12), 945–958 21 Wang H (2015) Obesity and Risk of Thyroid Cancer: Evidence from a Meta-Analysis of 21 Observational Studies Med Sci Monit, 21, 283–291 22 Almquist M., Johansen D., Björge T., et al (2011) Metabolic factors and risk of thyroid cancer in the Metabolic syndrome and Cancer project (Me-Can) Cancer Causes Control, 22(5), 743–751 23 Rezzónico J.N., Rezzónico M., Pusiol E., et al (2009) Increased Prevalence of Insulin Resistance in Patients With Differentiated Thyroid Carcinoma Metab Syndr Relat Disord, 7(4), 375–380 24 Renehan A.G., Tyson M., Egger M., et al (2008) Body-mass index and incidence of cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective observational studies The Lancet, 371(9612), 569–578 25 Santen R.J., Yue W., and Wang J.-P (2015) Estrogen metabolites and breast cancer Steroids, 99, 61–66 26 Ashton K., Proietto A., Otton G., et al (2009) Estrogen receptor polymorphisms and the risk of endometrial cancer: Estrogen receptor polymorphisms and the risk of endometrial cancer BJOG Int J Obstet Gynaecol, 116(8), 1053–1061 27 Gallo D., Ferlini C., and Scambia G (2010) The EpithelialMesenchymal Transition and the Estrogen-Signaling in Ovarian Cancer Curr Drug Targets, 11(4), 474–481 28 Kamat A (2011) Estrogen-Mediated Angiogenesis in Thyroid Tumor Microenvironment Is Mediated Through VEGF Signaling Pathways Arch Otolaryngol Neck Surg, 137(11), 1146 29 Rajoria S., Suriano R., George A., et al (2011) Estrogen Induced Metastatic Modulators MMP-2 and MMP-9 Are Targets of 3,3′Diindolylmethane in Thyroid Cancer PLoS ONE, 6(1), e15879 30 Rajoria S., Suriano R., Shanmugam A., et al (2010) Metastatic Phenotype Is Regulated by Estrogen in Thyroid Cells Thyroid, 20(1), 33–41 31 Ward J.M and Ohshima M (1986) The Role of Iodine in Carcinogenesis Essential Nutrients in Carcinogenesis Springer US, Boston, MA, 529–542 32 Gangolli S.D., van den Brandt P.A., Feron V.J., et al (1994) Nitrate, nitrite and N-nitroso compounds Eur J Pharmacol Environ Toxicol Pharmacol, 292(1), 1–38 33 Hiasa Y., Kitahori Y., Kitamura M., et al (1991) Relationships between serum thyroid stimulating hormone levels and development of thyroid tumors in rats treated with N - bis -(2-hydroxypropyl)nitrosamine Carcinogenesis, 12(5), 873–877 34 Physical activity and cancer etiology: associations and mechanisms | SpringerLink 35 Russell J.P., Engiles J.B., and Rothstein J.L (2004) Proinflammatory Mediators and Genetic Background in Oncogene Mediated Tumor Progression J Immunol, 172(7), 4059–4067 36 Samani A.A., Yakar S., LeRoith D., et al (2007) The Role of the IGF System in Cancer Growth and Metastasis: Overview and Recent Insights Endocr Rev, 28(1), 20–47 37 Ulrich C.M., Wiskemann J., and Steindorf K (2012) Physiologische und molekulare Mechanismen der Wirkung von körperlicher Aktivität auf das Krebsrisiko und den Verlauf einer Krebserkrankung Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz, 55(1), 3–9 38 Kimura T., Van Keymeulen A., Golstein J., et al (2001) Regulation of Thyroid Cell Proliferation by TSH and Other Factors: A Critical Evaluation of in Vitro Models Endocr Rev, 22(5), 631–656 39 Czarniecka A., Oczko-Wojciechowska M., and Barczyński M (2016) BRAF V600E mutation in prognostication of papillary thyroid cancer (PTC) recurrence Gland Surg, 5(5), 495–505 40 Howell G.M., Hodak S.P., and Yip L (2013) RAS Mutations in Thyroid Cancer The Oncologist, 18(8), 926–932 41 Kaczmarek-Ryś M., Ziemnicka K., Budny B., et al (2015) RET gene mutations spectrum in patients with medullary thyroid carcinoma (MTC) from Great Poland region Hered Cancer Clin Pract, 13(S2), A12, 18974287-13-S2-A12 42 Hsiao S.J and Nikiforov Y (2014) Molecular approaches to thyroid cancer diagnosis Endocr Relat Cancer, ERC-14-0166 43 Zaballos M.A and Santisteban P (2017) Key signaling pathways in thyroid cancer J Endocrinol, 235(2), R43–R61 44 Vidal A.P., Andrade B.M., Vaisman F., et al (2013) AMP-activated protein kinase signaling is upregulated in papillary thyroid cancer Eur J Endocrinol, 169(4), 521–528 45 Leonardi G.C., Candido S., Carbone M., et al (2012) BRAF mutations in papillary thyroid carcinoma and emerging targeted therapies (Review) Mol Med Rep, 6(4), 687–694 46 Chromosomal assignment of two human B-raf(Rmil) proto-oncogene loci: B-raf-1 encoding the p94Braf/Rmil and B-raf-2, a processed pseudogene - PubMed - NCBI 47 BRAF gene - Genetics Home Reference - NIH 48 Garnett M.J and Marais R (2004) Guilty as charged Cancer Cell, 6(4), 313–319 49 Wan P.T.C., Garnett M.J., Roe S.M., et al (2004) Mechanism of Activation of the RAF-ERK Signaling Pathway by Oncogenic Mutations of B-RAF Cell, 116(6), 855–867 50 Brummer T., Naegele H., Reth M., et al (2003) Identification of novel ERK-mediated feedback phosphorylation sites at the C-terminus of BRaf Oncogene, 22(55), 8823–8834 51 Davies H., Bignell G.R., Cox C., et al (2002) Mutations of the BRAF gene in human cancer Nature, 417(6892), 949–954 52 Namba H., Nakashima M., Hayashi T., et al (2003) Clinical Implication of Hot Spot BRAF Mutation, V599E, in Papillary Thyroid Cancers J Clin Endocrinol Metab, 88(9), 4393–4397 53 Abrosimov A., Saenko V., Rogounovitch T., et al (2007) Different structural components of conventional papillary thyroid carcinoma display mostly identicalBRAF status Int J Cancer, 120(1), 196–200 54 Kim J., Giuliano A.E., Turner R.R., et al (2006) Lymphatic Mapping Establishes the Role of BRAF Gene Mutation in Papillary Thyroid Carcinoma: Ann Surg, 244(5), 799–804 55 Kim K.H., Kang D.W., Kim S.H., et al (2004) Mutations of the BRAF Gene in Papillary Thyroid Carcinoma in a Korean Population Yonsei Med J, 45(5), 818 56 Lee J.-H., Seok Lee E., Kim Y.-S., et al (2006) BRAF mutation and AKAP9 expression in sporadic papillary thyroid carcinomas Pathology (Phila), 38(3), 201–204 57 Xing M., Westra W.H., Tufano R.P., et al (2005) BRAF Mutation Predicts a Poorer Clinical Prognosis for Papillary Thyroid Cancer J Clin Endocrinol Metab, 90(12), 6373–6379 58 Fagin J.A (2004) How thyroid tumors start and why it matters: kinase mutants as targets for solid cancer pharmacotherapy J Endocrinol, 183(2), 249–256 59 Gaastra W (1985) Chemical cleavage (maxam and gilbert) method for DNA sequence determination Methods Mol Biol Clifton NJ, 2, 333–341 60 Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., et al (1991) Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’ 3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase Proc Natl Acad Sci, 88(16), 7276–7280 61 Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., et al (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res, 17(7), 2503–2516 Phụ lục 1: MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU HÀNH CHÍNH I Họ tên bệnh nhân: Tuổi: Giới: Địa chỉ: SĐT liên hệ: Ngày vào viện CHUYÊN MÔN II Khám lâm sàng: - Kích thước tuyến giáp - Di hạch cổ - Di xa Cận lâm sàng: - Siêu âm: - Chọc hút tế bào: - Giải phẫu bệnh: - Xét nghiệm đột biến gen BRAF V600E: Phụ lục 2: QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL – TIME PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E Phụ lục 3: QUY TRÌNH KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E Ở BỆNH NHÂN UTTG ... “ Hoàn thiện kỹ thuật Realtime- PCR để xác định đột biến gen BRAF V60 0E từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư tuyến giáp với hai mục tiêu sau: Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân. .. HỌC Y HÀ NỘI ======= BỘ Y TẾ BÙI THỊ LÀNH HOÀN THIỆN KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V6 TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền... nhân ung thư tuyến giáp Xác định tỷ lệ đột biến gen BRAF V60 0E bệnh nhân ung thư tuyến giáp kỹ thuật Realtime- PCR 9 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm tình hình mắc ung thư tuyến giáp 1.1.1