PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH STAPHYLOCOCCUS AUREUS

L/O/G/O PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH STAPHYLOCOCCUS AUREUS NỘI DUNG Tổng quan S.aureus Quy trình phân tích S.aureus Ví dụ PP phân tích S.aureus TỔNG QUAN S.AUREUS Staphylococcus aureus Thuộc họ Staphylococcaceae Còn gọi Tụ cầu vàng Sống hiếu khí tùy nghi Khóa phân lồi S aureus Giới (Kingdom): Bacteria Nghành (Phylum): Lớp (Class): Bộ Firmicutes Bacilli (Order): Bacillales Họ (Family): Staphylococcaceae Giống (Genus): Staphylococcus Lồi (Species): S aureus PƯ catalase, coagulase dương tính PƯ oxidase âm tính Hầu hết có khả tan huyết (95%) Lên men tạo acid từ mannitol Phát triển môi trường chứa 15% NaCl Trên môi trường không chọn lọc tạo sắc tố vàng Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt Dấu hiệu nhiễm bệnh S aureus Khả gây ngộ độc thực phẩm • Sinh độc tố ruột: enterotoxin A, B, C, D, E bền nhiệt – Viêm dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố – Viêm ruột non – đại tràng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ cầu với số lượng lớn (>105 vi khẩn/1g thức ăn) • Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc Quy trình phân tích S.aureus Phương pháp định lượng truyền thống • Phương pháp đếm khuẩn lạc • Phương pháp MPN Phương pháp đại • Phương pháp ELISA • Phương pháp PCR QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Định lượng mẫu, đồng mẫu (10g mẫu 90ml mơi trường SPW) Pha lỗng mẫu theo nồng độ pha lỗng thập phân QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS BẰNG PP MPN MSB Cấy ml vào ống nghiệm chứa 10ml MSB 1ml (-) (+) Ủ 37 ± 0,5oC 24 - 48 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 10-1 Ống (+) môi trường chuyển sang màu vàng 1ml Ống (-) môi trường không chuyển màu 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 -2 Cấy ống (+)10sang môi trường BPA 1ml Ủ 37 ± 0,5oC khoảng 48 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-3 Chọn kl đặc trưng cấy chuyển sang TSA BPA MSB 10ml KL đặc trưng TSA Ủ 37 ± 0,5oC qua đêm TSA Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương thỏ Ủ 37 ± 0,5oC theo dõi sau 2, 4, 6, Nếu khơng có kết dương tính ủ đến 24 Kết quả: Đọc kết thử nghiệm Coagulase Tra bảng MPN ống (+) Phát Tất (-) Không Phát Đọc kết thử nghiệm coagulase 10-1 10-2 10-3 Kết MPN MPN/g VÍ DỤ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH S.AUREUS THỰC TẾ Định tính Staphylococcus aureus mẫu chả lụa chợ Đồng Xồi - Bình phước   Quy trình thực hiện: Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị dung dịch mẫu thử Cấy mẫu Đọc kết Khẳng định Bước 1: Chuẩn bị mẫu  Mẫu chả lụa cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng đồng Bước 2: Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân xác 10g mẫu chả lụa chuẩn bị cho vào túi nilon vô trùng - Thêm 90ml nước đệm phosphate đồng mẫu vòng phút => dung dịch mẫu thử 10-1 - Hút xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn ml nước đệm phosphate, lắc => dung dịch 10-2 - Tiếp tục làm tương tự vậy, ta thu dung dịch mẫu thử 10-3 Bước 3: Cấy mẫu -Từ nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, lấy 1ml dung dịch mẫu thử cho sang đĩa thạch BairdParker -Dùng que trang vô trùng, dàn mẫu thử cẩn thận lên mặt đĩa thạch - Để đĩa có nắp đậy khô khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng - Lật ngược đĩa, ủ tủ ấm 350C 2448h Bước 4: Đọc kết -Sau 24 khuẩn lạc S aureus có đường kính 0,5 - 1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khỏang – mm bao quanh -Đánh dấu mặt đáy đĩa khuẩn lạc có đặc điểm tiếp tục ủ đến 48 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus môi trường BPA Bước 4: Đọc kết -Sau 48 khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng – 1,5 mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và có vòng sáng rộng khoảng 2 4mm bao quanh.  -Đếm đánh dấu hai dạng khuẩn lạc Độ pha loãng Khuẩn lạc S aureus đặc trưng Khuẩn lạc S aureus không đặc trưng 10-1 10-2 92 38 45 19 10-3 11 Bước 5: Khẳng định - Chọn khuẩn lạc dạng khuẩn lạc chọn đếm bước tiến hành thử nghiệm coagulase sau: + Dùng đầu que cấy thẳng vô trùng, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ chọn vào ống nghiệm có chứa sẵn 0,2 ml môi trường canh thang BHB đồng thời cấy ria lên ống thạch nghiêng môi trường bảo quản chủng TSA Ủ ấm 350C / 18-24h + Thêm 0,3 ml huyết tương thỏ hồn ngun vào ống dịch ni cấy BHB, lắc + Ủ ấm 350C kiểm tra đông tụ huyết tương Bước 5: Khẳng định - Sau huyết tương đông tụ  Những cục đông tụ huyết tương nhỏ hoặc yếu có thể quan sát bằng cách nghiêng nhẹ ống nghiệm phần dung dịch hỗn hợp phản ứng đến gần phía miệng ống nghiệm, cục đơng tụ huyết tương lớn nhô bề mặt dung dịch - Những ống dịch ni cấy BHB có thử nghiệm coagulase dương tính khẳng định có S.aureus KẾT QUẢ +Ống nghiệm chứa khuẩn lạc đặc trưng: ống (+), ống (-) +Ống nghiệm chứa khuẩn lạc không đặc trưng: ống (+), ống (-) Ống nghiệm dương tính với thử nghiệm coagulase nên mẫu chả lụa kiểm tra có chứa staphylococcus aureus   L/O/G/O Thank You! www.themegallery.com ...NỘI DUNG Tổng quan S .aureus Quy trình phân tích S .aureus Ví dụ PP phân tích S .aureus TỔNG QUAN S .AUREUS Staphylococcus aureus Thuộc họ Staphylococcaceae Còn gọi Tụ... 0,5oC 24 - 48 1.1 1.2 1.3 1.4 1 .5 10-1 Ống (+) môi trường chuyển sang màu vàng 1ml Ống (-) môi trường không chuyển màu 2.1 2.2 2.3 2.4 2 .5 -2 Cấy ống (+)10sang môi trường BPA 1ml Ủ 37 ± 0,5oC... kết thử nghiệm coagulase 10-1 10-2 10-3 Kết MPN MPN/g VÍ DỤ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH S .AUREUS THỰC TẾ Định tính Staphylococcus aureus mẫu chả lụa chợ Đồng Xồi - Bình phước   Quy trình thực hiện: Chuẩn