Đặc điểm phân tử gen VP2 của virut parvo trên lợn

Giải trình tự gen VP2 của virut PPV Phân tích và so sánh số liệu về mức độ tương đồng/khác biệt về trình tựnucleotit/axit amin tương ứng của gen VP2 của các chủng PPV phân lập trong nư

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN HÙNG CƯỜNG

ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN VP2 CỦA VIRUT PARVO TRÊN LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN HÙNG CƯỜNG

ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN VP2 CỦA VIRUT PARVO TRÊN LỢN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 02 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quảnêu trong Luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các số liệu,

ví dụ và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực Tôi đãhoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quyđịnh của Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo sau Đại học, Viện Sinhthái và Tài nguyên Sinh vật xem xét để tôi có thể bảo vệ Luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

NGƯỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Hùng Cường

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Diệu Thúy,Trưởng phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệmquý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ chỉ bảo tận tình về chuyên môn

và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ gen độngvật, Viện Công nghệ sinh học

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo sau đại học - Việnsinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất chotôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡtôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày… tháng … năm 2018

Học Viên

NGUYỄN HÙNG CƯỜNG

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

NGƯỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

MỞ ĐẦU 10

NỘI DUNG 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Khái quát về hội chứng gây suy giảm sinh sản ở lợn (PPV - Porcine parvovirut)12 1.1.1 Sự phát hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PPV 12

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 12

1.1.3 Đường truyền lây của virut 13

1.2 Tổng quan về virut PPV (Porcine Parvovirut) 15

1.2.1 Đặc điểm của virut 15

1.2.2 Cấu trúc virut 15

1.3 Các phương pháp phát hiện PPV 16

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 17

1.3.2 Phân lập virut 17

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 17

1.3.4 Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR 18

1.4 Tình hình nghiên cứu di truyền PPV trên thế giới 20

1.4.1 Biến đổi di truyền trên protein cấu trúc VP2 20

1.4.2 Phân loại PPV 22

1.5 Tình hình nghiên cứu PPV ở Việt Nam 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu nghiên cứu 29

2.2.1 Mồi sử dụng 29

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Tách ADN tổng số 31

2.3.2 Điện di ADN trên gel agarose 32

2.3.3 Phương pháp PCR khuếch đại gen phát hiện virut PPV và khuếch đại đoạn gen VP2 33

2.3.4 Tinh sạch đoạn gen để giải trình tự 33

2.3.5 Phân tích trình tự gen và axit amin tương ứng của các chủng PPV 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 35

3.2 Kết quả PCR phát hiện virut PPV 35

3.3 Kết quả nhân gen VP2 của virut PPV1 40

3.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen VP2 của virut PPV1 41

3.4.1 So sánh sự khác nhau về trình tự nucleotit của VP2 của virut PPV1 41

3.4.2 So sánh sự khác nhau về axit amin của VP2 44

3.4.3 So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và axit amin suy diễn của đoạn gen VP2 47

3.5 Phân tích cây phả hệ của PPV ở đoạn gen VP2 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại các chủng PPV lưu hành trên thế giới 22

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen 29

Bảng 2.2 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 30

Bảng 2.3 Các dung dịch đệm cần pha 30

Bảng 2.4 Các các hóa chất sử dụng 31

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt PCR 33

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm PPV1, PPV2, PPV3 phân lập ở VN 38

Bảng 3.2 Tỷ lệ đồng nhiễm PPV 39

Bảng 3.3 Vị trí axit amin của VP2 ở các chủng PPV châu Âu, châu Á và Việt Nam 46

Bảng 3.4 Tỷ lệ phần trăm tương đồng về trình tự nucleotit (phía trên đường chéo) và axit amin suy diễn (phía dưới đường chéo) của gen VP2 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh thai gỗ do lợn nái nhiễm PPV .

13 Hình 1.2 Các mốc thời gian chính của sự nhiễm virut PPV và đáp ứng miễn dịch (Meszaros và cs., 2017) 14

Hình 1.3 Cấu trúc của Parvovirut (viralzone.expasy.org) 15

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen Parvovirut điển hình (viralzone.expasy.org) 16

Hình 1.5 Cấu trúc ba chiều gen VP2 của virut PPV (Streck và cs., 2011) 21

Hình 1.6 Cây phả hệ di truyền dựa trên trình tự bộ gen capsid các chủng thuộc PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 phân lập từ lợn nuôi và lợn rừng (Cadar và cs., 2012)

24 Hình 1.7 Bản đồ các chuỗi gen capsid giả định của PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 cho thấy các đặc tính nucleotit và axit amin đặc trưng và cấu trúc thứ cấp dự đoán Bản đồ được xây dựng bằng phần mềm Geneious 4.8.5 (Cadar và cs., 2013)

26 Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm 31

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số của mẫu phân lập .

35 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV1 kích thước 194 bp .

35 Hình 3.3 Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 194 bp bằng công cụ BLAST 36

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV2 kích thước222 bp .

36 Hình 3.5 Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen PPV2 bằng công cụ BLAST 37 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với kiểu gen PPV3 kích thước 392 bp

37

Hình 3.7 Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen PPV3 bằng công cụ BLAST 38 Hình 3.8 Vị trí các đoạn mồi thuộc gen VP2 của virut PPV1 40 Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-I có kích thước 841 bp 41

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-II có kích thước 666 bp 41 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen VP2-III có kích thước 568 bp 41 Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự nucleotit đoạn gen VP2 của các mẫu PPV phân tích 42 Hình 3.13 Kết quả so sánh axit amin suy diễn trên gen VP2 của các mẫu phân tích ở

Việt Nam với các chủng PPV phân lập từ các khu vực khác nhau trên thế giới 45

Hình 3.14 Cây phân loại di truyền các chủng PPV của đoạn gen VP2 49

MỞ ĐẦU

Chăn nuôi lợn là một nghề truyền thống ở nước ta, nó đóng vai trò quan trọngtrong nền kinh tế quốc dân nói chung cũng như của mỗi gia đình nông dân Việt Namnói riêng Vai trò đó ngày càng được khẳng định trong giai đoạn hiện nay khi xã hội cónhu cầu càng cao về thịt để nâng cao chất lượng bữa ăn Chúng ta đã nhập nhiều giốnglợn ngoại có năng suất cao để cải tạo đàn lợn nội Nhờ vậy mà ngành chăn nuôi lợnngày càng phát triển Tuy nhiên bệnh tật luôn là mối đe dọa cho bất cứ ngành chănnuôi nào Có rất nhiều bệnh truyền nhiễm, bệnh do ký sinh trùng làm thiệt hại đáng kểcho ngành chăn nuôi Bên cạnh đó hội chứng suy giảm sinh sản do virut PPV gây nêncũng là một mối đe dọa cho sự phát triển của ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là nuôi lợnsinh sản

Trong những năm gần đây hội chứng suy giảm sinh sản lợn do virut PPV đãnổi lên như một vấn đề cần quan tâm của ngành chăn nuôi lợn Qua những biểu hiệnsuy giảm sinh sản của lợn và phân tích về dịch tễ học thì PPV được cho là một trongnhững tác nhân chính gây chết phôi và thai, dẫn tới suy giảm khả năng sinh sản Ngoài

ra PPV còn có thể làm tăng các ảnh hưởng bất lợi gây ra bởi virut PCV2 (PorcineCircoviral virus type 2) trong Hội chứng còi cọc sau cai sữa, gây ra những thiệt hại vềkinh tế trong chăn nuôi lợn công nghiệp

Thực tế cho thấy các tác nhân gây bệnh là virut ngày càng có sự biến đổi ditruyền cao, do đó hình thành nên nhiều biến chủng/dòng khác nhau, gây khó khăn chocông tác chẩn đoán chính xác bệnh Cho đến nay, các biện pháp khống chế bệnh được

áp dụng ở nhiều nước bằng cách sử dụng vaccine nhưng vẫn chưa đem lại hiệu quảnhư mong muốn Phương pháp PCR đã được sử dụng khá rộng rãi trên thế giới đểđồng thời nhận diện, phân biệt nhiều loại virut hoặc các chủng/dòng khác nhau củavirut PPV trong cùng một mẫu dựa vào kích thước đoạn gen được khuếch đại Tuynhiên, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về đặc trưng di truyền và trình tựnucleotit hệ gen PPV phân lập tại Việt Nam Xuất phát từ thực tiễn và yêu cầu trênchúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm phân tử gen VP2 của virut Parvo trên lợn”

Mục tiêu của đề tài:

Giải trình tự toàn bộ gen VP2 của virut PPV phân lập tại Việt Nam

Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ nucleotit và axit amin của các chủng virutPPV phân lập

 So sánh, đánh giá về quan hệ di truyền của các chủng virut PPV đang lưu hành tạiViệt Nam với các chủng virut đã phân lập trước đây, các chủng nguyên thủy, cácchủng đang lưu hành ở các vùng địa lý khác nhau trong khu vực và trên thế giới

Nội dung nghiên cứu:

Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện virut PPV

Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn toàn bộ gen VP2 của virut PPV

Tối ưu điều kiện PCR

Giải trình tự gen VP2 của virut PPV

Phân tích và so sánh số liệu về mức độ tương đồng/khác biệt về trình tựnucleotit/axit amin tương ứng của gen VP2 của các chủng PPV phân lập trong nước,

so sánh với các chủng trong khu vực và trên thế giới

Xây dựng cây phân loại di truyền dựa trên trình tự gen VP2 của các chủng PPV

phân lập ở Việt Nam, cùng với các chủng trong khu vực và trên thế giới

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về hội chứng gây suy giảm sinh sản ở lợn (PPV - Porcine

Vì vậy, bệnh này thường được gọi với tên dân dã là “Bệnh thai gỗ” (Hình 1.1) Bệnhnày được mô tả lần đầu tiên ở Đức và Mỹ vào năm 1965, sau đó là trên phạm vi toànthế giới (Cartwright & Huck., 1967; Johnson., 1973; Joo và cs., 1976; Vannier., 1978).PPV được xem là tác nhân chính gây rối loạn sinh sản ở lợn ở hầu hết các nước trênthế giới (Straw, B.E., 2006)

Tại Việt Nam

Trong những năm gần đây hội chứng suy giảm sinh sản lợn do virut PPV đã nổi lênnhư một vấn đề cần quan tâm của ngành chăn nuôi lợn Bệnh gây ảnh hưởng đến cácđàn lợn nái sinh sản Tần số rối loạn sinh sản ở các lứa đầu cao hơn các lứa sau Cácvùng sinh thái khác nhau được cho là không có ảnh hưởng đáng kể tới tỷ lệ rối loạnsinh sản ở lợn nái Kết quả xét nghiệm 4.166 mẫu huyết thanh lấy từ các trang trại lợnnái tỉnh Long An cho thấy số mẫu dương tính với virut PPV chiếm 69,5% Phân tích

52 mẫu thai chết lưu đã phát hiện thấy có sự xuất hiện đồng thời của virut PPV và kháng thể PPV (Nguyễn Huỳnh., 2000)

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu lâm sàng chính của lợn nái nhiễm PPV đặc trưng bởi hiện tượng sảythai, đẻ non, thai hóa gỗ với nhiều kích thước khác nhau, chết phôi và giảm khả năngsinh sản (giảm lứa đẻ) Hầu hết các trường hợp nhiễm PPV đơn thuần không gây triệuchứng lâm sàng ở lợn trưởng thành hoặc lợn con Độc lực của PPV được xác định bởimức độ nghiêm trọng của sự suy giảm khả năng sinh sản mà nó có thể gây ra ở lợn nái

Hình 1.1 Hình ảnh thai gỗ do lợn nái nhiễm PPV.

(https:// w ww.pi g 333 c om/patho l o g y -atla s/ m u mmi f ied- f etuses_56 )

Biểu hiện bệnh chỉ thấy ở lợn nái chửa, lợn nái sinh sản Các kết quả nghiêncứu cho thấy 7 - 8 ngày sau khi lợn nái chửa bị nhiễm virut thì bị sốt kèm theo giảmlượng bạch cầu Đây là kết quả của sự nhiễm trùng huyết Trong thời gian này, virut cóthể được phân lập từ máu và trong các mô tổ chức có khả năng sinh trưởng cao nhưniêm mạc phổi, tế bào gan, lách, thận, tinh trùng, nhau thai và bào thai

Ngay sau khi virut vào đến bào thai, chúng gây chết thai của nái chửa dưới 44ngày Các bào thai chết ở các nái này có thể bị phân huỷ và được hấp thụ ngược lạihoàn toàn nếu bào thai dưới 35 - 36 ngày tuổi Lúc đó, lợn lại có thể động dục trở lại.Nếu virut vào sau 44 ngày kể từ khi mang thai thì quá trình chửa vẫn xảy ra bìnhthường nhưng khi đó sẽ có một số thai chết hoặc phát triển kém cho đến lúc sinh,trong khi đó một số thai vẫn phát triển bình thường

Phụ thuộc vào thời điểm nhiễm virút gây bệnh, nên lúc lợn đẻ ta có thể thấy có

sự khác nhau lớn trong quá trình phát triển của bào thai của cùng 1 nái đẻ: khi thì bịthai khô, khi thì thai chết, một số con thì phát triển bình thường với các kích cỡ khácnhau Lúc đẻ ra con thì chết yểu ngay sau khi đẻ, con sống bình thường Đôi khichúng ta cũng ghi nhận được một số nái bị sảy thai Song sảy thai không phải là dấuhiệu điển hình của bệnh

1.1.3 Đường truyền lây của virut

Bệnh xảy ra chủ yếu trên lợn nái hậu bị, nái đã đẻ nhiều lứa và lợn đực dưới 70

- 80 ngày tuổi, đặc biệt với những con nái không có miễn dịch thường nhiễm PPV vàogiai đoạn đầu của thai kỳ Virut được tìm thấy trong dịch mũi, hạch, amidan, nước tiểu

và phân Đối với nái: virut thường xuất hiện ở màng niêm mạc âm hộ, trên lợn nọc:

virut thường có ở dịch tinh hoàn và tinh trùng.

Con đường xâm nhiễm chính của PPV là qua mũi, miệng và đường sinh dục.Virut xâm nhiễm qua đường mũi miệng hay đường sinh dục, khoảng 10 ngày sau trênlợn cái virut đi vào đường máu gây giảm bạch cầu, và từ ngày 10 – 14 virut vào đếnnhau thai Virut có thể xuyên qua màng nhau thai ở ngày thứ 30 sau khi thụ tinh vàlàm cho toàn bộ số phôi bị lây nhiễm bị chết và hóa gỗ Những nái bị nhiễm virut vàogiai đoạn cuối của thời kỳ mang thai có thể không gây chết thai Riêng đối với lợnđực, có thể phát hiện thấy virut trong dịch tinh hoàn và tinh trùng khoảng 5 – 9 ngàysau khi nhiễm Ngoài ra, bệnh có thể lây lan từ nọc sang lợn nái hoặc ngược lại do giaophối trực tiếp với heo mắc bệnh hoặc gieo tinh nhân tạo từ tinh dịch của nọc mắc bệnh

PPV cũng truyền từ mẹ sang con qua nhau thai Kết quả nhiễm trùng ở bào thaitùy thuộc vào thời điểm nhiễm PPV trên lợn nái mang thai Các nghiêm cứu thựcnghiệm và nghiên cứu dịch tễ chỉ ra rằng nhiễm PPV trong 6 tháng đầu của thai kỳ cóthể dẫn đến việc sảy thai Phôi thai lợn có khả năng miễn dịch sau ngày thứ 70 củathai kỳ Sự lây truyền theo chiều dọc từ mẹ sang con thông qua nhau thai mất từ 12đến 18 ngày, do đó nếu lợn nái bị nhiễm PPV sau ngày thứ 56

không gây tổn hại cho đàn con

của thai kỳ thường

Hình 1.2 Các mốc thời gian chính của sự nhiễm virut PPV và đáp ứng miễn dịch

(Meszaros và cs., 2017)Hình 1.2 cho thấy dòng màu xanh lá cây thể hiện thòi gian các kháng thể từ cơthể lợn nái bảo vệ thai thụ động cho đến 22 tuần tuổi Các con nái nên được tiêmchủng ngay sau khoảng thời gian này khi các kháng thể bắt đầu cạn kiệt, nhờ có sự tăng cường của vaccine con nái sẽ duy tri miễn dịch lâu dài Dòng màu đỏ thể hiện

khoảng thời gian phôi dễ bị nhiễm virut PPV cho đến khi phát triển của khả năng miễndịch ở sau ngày thứ 70 của thai kỳ (Meszaros và cs., 2017)

Virut PPV có thể tồn tại được ở môi trường bên ngoài và truyền nhiễm bệnhtrong nhiều tháng Các dụng cụ chăn nuôi và chuồng trại bị ô nhiễm có thể là nguồntruyền nhiễm PPV liên lục Loại virut này cũng có thể bám vào quần áo của ngườichăn nuôi và di chuyển từ trang trại này sang trang trại khác, và ngoài ra người ta cũngcho rằng các loài gặm nhấm có thể đưa tác nhân này vào các đàn gia súc mới (Streck

và cs., 2011)

1.2 Tổng quan về virut PPV (Porcine Parvovirut)

1.2.1 Đặc điểm của virut

Tác nhân gây bệnh là virut thuộc giống Parvovirut, phân họ Parvoviride nhiễmtrên động vật có xương sống Các nghiên cứu về dịch tễ và chẩn đoán đã chứng minhrằng PPV là nguyên nhân chính gây nên chết phôi và làm suy giảm sinh sản ở lợn.PPV là virut không vỏ, có kích thước nhỏ, hình dạng tròn, đường kính khoảng 18 -

26 nm, cấu trúc đối xứng 20 mặt (Hình 1.3) Đây là loại virut bền với các yếu tố môitrường, có thể chịu được ngưỡng pH rộng từ 3,0 - 8,0 có khả năng chịu nhiệt đến hànggiờ ở 80°C PPV có đặc điểm không dễ dàng nhân lên trong điều kiện in vitro bởi vìvirut này có xu hướng tạo ra nhiều tiểu phần tương tác khiếm khuyết đặc biệt trongtrường hợp nuôi cấy với nồng độ cao hoặc nhiều lần cấy chuyển (Choi và cs., 1987).1.2.2 Cấu trúc virut

Hình 1.3 Cấu trúc của Parvovirut (viralzone.expasy.org)CP: capsid protein; ssDNA (single-strand DNA): ADN sợi đơn

Vật liệu di truyền của virut là ADN sợi đơn, mạch thẳng, âm, với kích thướcphân tử khoảng 5kb (Molitor và cs., 1983)

Cấu trúc hệ gen điển hình của Parvovirut được trình bày ở hình 1.4 Hệ gencủa PPV được đặc trưng bởi cấu trúc kẹp tóc (hairpin) ở hai đầu tận cùng 5’- 3’(Bergeron và cs., 1993; Tattersalvà cs., 2006) và 2 khung đọc mở (Open reading frame– ORF) mã hóa cho protein không cấu trúc (non-structural protein – NSP) và protein

vỏ capsid (VP) Đầu 3’ của ADN virut có cấu trúc hình dạng chữ Y giống vớiParvovirut của loài gặm nhấm Đầu 5’- chứa vùng lặp lại 127 về phía đầu C- củaprotein capsid ORF1 mã hóa cho các protein không chức năng (NS1, NS2 và NS3)tổng hợp các enzyme có hoạt tính helicase và nickase cần thiết cho quá trình sao chép,

có tính bảo tồn cao, ORF2 mã hóa cho các protein chức năng (VP1, VP2 và VP3) nhưcapsid protein VP1 và VP2 được dịch mã bởi các ARN khác nhau, trong khi đó VP3được tạo nên do việc phân cắt protein từ VP2 (Molitor và cs., 1983; Ran và cs., 1989;Bergeron và cs., 1993)

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen Parvovirut điển hình (viralzone.expasy.org)

Non-structural ORF: Khung đọc mở mã hóa protein không chức năngStructuralORF: Khung đọc mở mã hóa protein chức năng

NS: Gen mã hóa protein không chức năng; VP: Gen mã hóa capsid protein1.3 Các phương pháp phát hiện PPV

Phương pháp sinh học phân tử là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiệnnay trong chẩn đoán nhằm phát hiện một số đặc điểm của vật liệu di truyền (ADN,ARN) ở tác nhân bệnh, thường được sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type,định lượng, xác định tính kháng thuốc của các tác nhân bệnh, chủ yếu là virut và vikhuẩn Bên cạnh ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xétnghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử vẫn có một số nhược điểm như khả năng cho kếtquả dương tính và âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng của kết quả chẩn đoán trong một số

trường hợp không rõ ràng, thiếu tính thống nhất trong kết quả thu được từ các kit khácnhau, cần thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề Dưới đây là một số phương phápcho phép phát hiện và chẩn đoán sớm tác nhân gây bệnh.

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Heo nái bị bệnh thường không có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng Một số biểu hiện

có thể nhận thấy là nái đẻ ra ít con, tỷ lệ đẻ thấp (36 %), số con ít (dưới 5 con) hoặc đẻ

ra với nhiều thai khô Nhiều trường hợp heo sinh con ra bị chết Các dấu hiệu rối loạnsinh sản thường thấy là phối nhiều lần không đậu thai, chậm động dục hoặc heo náiđang mang thai có thể động dục trở lại và có biểu hiện động dục không thường xuyên,sẩy thai và tăng số lượng thai khô hoặc số đẻ non, kéo dài thời gian mang thai, đẻkhông có con Tùy theo giai đoạn nái mang thai bị nhiễm mà số lượng thai bị tiêu biến,thai khô, thai chết hoặc đẻ ra yếu ớt có thay đổi khác nhau

Sự nhiễm bệnh ở con đực không gây ảnh hưởng gì đến khả năng sinh dục củachúng, nhưng là nguồn lây lan bệnh qua tinh dịch Vì vậy, cần phải Kiểm tra định kỳtinh dịch để loại bỏ các heo đực nhiễm PPV tránh lây truyền cho heo nái qua đườnggiao phối

1.3.2 Phân lập virut

Virut PPV thường được phân lập từ nhiều mẫu bệnh có biểu hiện lâm sàng khácnhau bao gồm: huyết thanh, tinh dịch, màng tế bào, máu, tim, gan, phổi, lá lách…Trong đó dịch thu nhận từ phổi và huyết thanh là những mẫu dùng để phân lập viruttốt nhất khi có dịch PPV bùng nổ Môi trường phân lập virut chủ yếu là môi trườngMARC-145 Virut được nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu miễn dịch với khánghuyết thanh đặc hiệu Việc phân lập thành công virut PPV phụ thuộc rất nhiều vàođiều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

Có nhiều nghiên cứu để pháp hiện các kháng thể trong huyết thanh đối với virutPPV Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Indirect fluorescent antibody - IFA);trung hòa virut huyết thanh (Serum virut neutralization - SNV); xét nghiệm đơn lớp kỹthuật ôxyhóa (Immunoperoxidase monolayer assay - IMPA) và kỹ thuật xét nghiệmELISA (Enzyme linked immunosorbent assay - ELISA) tất cả đều có thể được sử dụngcho việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với virut PPV Phản ứng IFA, SNV vàELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các phòng thí nghiệm ở miền nam

nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở Châu Âu TheoTamošiūnas PL và cs (2013) ELISA cho kết quả có độ đặc hiệu và độ nhạy cao đốivới việc phát hiện kháng thể virut PPV trong huyết thanh Nhược điểm của phươngpháp này là cho kết quả dương tính giả.

1.3.4 Phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR

Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện virut PPV trong các mẫu bệnh phẩm

Vì không cần phải phân lập virut trong môi trường nuôi cấy tế bào nên phương phápPCR giúp tiết kiệm thời gian để phát hiện virut PPV hơn so với phương pháp nuôi cấy

tế bào PCR còn được xem là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

 Phương pháp Realtime-PCR

Realtime-PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn cDNAchuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng real time-PCR,quá trình nhân bản cDNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp.Realtime-PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản cDNA bằng phản ứngPCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩmADN được tạo thành Phương pháp này có độ đặc hiệu cao, chính xác tuy nhiên giáthành của phương pháp tương đối đắt, thiết kế phản ứng khó khăn và đòi hỏi kỹ thuậttay nghề cao và chuyên sâu

Xiao và cs (2013) sử dụng phương pháp realtime-PCR trong việc pháp hiệnsớm, nhanh sự đa dạng di truyền của các chủng virut PPV trong mẫu bệnh phẩm thuthập từ: huyết thanh, phân và mô phổi của những con lợn bị nhiễm bệnh Tỷ lệ pháthiện được tìm thấy phổ biến ở Mỹ với tỷ lệ nhiễm là 20,7 % trong mô phổi và 7,6 % ởmẫu phân Điều này tương tự như nghiên cứu đã được mô tả trước đây ở Hungary, nơiPPV có tổng thể tỷ lệ nhiễm là 10,5 % (4/38) trong mẫu phổi, 6,0 % (13 /215) trongmẫu phân và 1,8 % (2/111) trong mẫu huyết thanh (Csagola và cs., 2012)

 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanhnhiều bản sao các đoạn ADN mà không qua tạo dòng Phương pháp này được KaryMullis đưa ra năm 1986 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR được thựchiện hoàn toàn trong các ống eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rấtnhiều bản sao ADN Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩnđoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải

mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của

sinh vật ở mức độ phân tử,…

Nguyên lý: Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp sốlượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzymepolymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quátrình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần có mồi

- là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn.Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hìnhthành một mạch mới hoàn chỉnh

Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng vàlàm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng và thường đượcthực hiện với các bước sau:

tính:

Bước đầu tiên trong hệ thống nhân bội PCR là làm biến tính mẫu ADN bằng cách

 Tổng hợp, kéo dài

chuỗi:

năng xúc tác của Taq DNA polymerase Sự tổng hợp ADN được khởi động ở đầu 3’hydroxyl của mỗi mồi

 Ứng dụng của phương pháp dựa trên nguyên lý PCR trong chẩn đoán bệnh PPV

Nhiều công trình nghiên cứu xây dựng phương pháp PCR để phát hiện sự cómặt của virut PPV, thu mẫu xét nghiệm dưới các dạng khác nhau như máu, huyếtthanh, hạch lympho, hạch amidan, tim, gan, phổi, lá lách, bào thai do sảy,… Kim và cs.(2003) sử dụng phương pháp multiplex seminested PCR để đồng thời phát hiện vàphân biệt PPV và PCV2 trong tinh dịch của lợn Kết quả tinh dịch dương tính với PPV

và PCV2 lần lượt là 42,9 % và 20,4 % (n=98)

Huang và cs (2004) đã xây dựng phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh

đồng thời PPV, PRV và PCV2 với độ nhạy của phương pháp đạt 1x10-4ng (tươngđương với 10.000 phân tử ADN virut) Tương đương với kết quả trên, độ đặc hiệu của

(2012)

Giammarioli và cs (2008) đã phát triển và sau đó đánh giá hiệu quả sử dụngphương pháp multiplex PCR trong việc xác định độ đồng nhiễm của các virut trên lợn.Kết quả phân tích độ nhạy của phương pháp được kiểm tra trên gel agarose sau khinhuộm với ethidium bromide (EtBr) cho phép phát hiện nồng độ virut ít nhất là 0,2-

200 pcg trong phương pháp single PCR (sPCR) và 20-200 pcg trong mPCR Thínghiệm được thực hiện trên nồng độ pha loãng 10x của các mẫu có chứa tất cả cácvirut để xác định giới hạn phát hiện của multiplex PCR Độ nhạy của phương phápmPCR so với sPCR tương ứng để phát hiện một trong năm loại virut là giống hệt nhau

loại virut đồng nhiễm trên lợn

1.4 Tình hình nghiên cứu di truyền PPV trên thế giới

1.4.1 Biến đổi di truyền trên protein cấu trúc VP2

PPV là một virut ssADN nhỏ, với bộ gen có khoảng 5000 nucleotit mã hóacho bốn protein được phiên mã từ hai promoter Hai protein không cấu trúc, NS1 vàNS2 được mã hóa từ đầu 5’ ORF đóng vai trò quan trọng trong việc sao chép ADN.Ngoài ra, còn có hai protein cấu trúc được mã hóa từ đầu 3’ ORF là VP1 và VP2.Protein VP2 nhỏ được tạo ra bằng cách ghép nối từ cùng một khuôn ARN với proteinlớn hơn VP1 Do đó, toàn bộ trình tự chuỗi VP2 có mặt trong chuỗi trình tự của VP1.Hai đoạn lặp lại 127 bp liên quan đến độc lực PPV (Bergeron và cs., 1993; Zeeuw vàcs., 2007) bắt đầu ngay trước VP2 bộ ba phiên mã kết thúc của VP2 Gần đây, mộtprotein thứ ba VP3 được phát hiện là một sản phẩm biến đổi sau khi phân cắt proteincủa VP2 (Simpson và cs., 2002) Ba loại protein VP1, VP2 và VP3 tập hợp lại thànhdạng icosahedral capsid (Chapman & Rossmann và cs., 1993; Parrish và cs., 2010).Đặc điểm đa dạng sinh học của PPV gây ra các tính chất bệnh khác nhau, tuy cơ sở ditruyền của việc gây bệnh chưa được xác định, nhưng protein cấu trúc dường nhưđóng một vai trò quan trọng So sánh bộ gen giữa chủng nguyên thủy NADL-2(GenBank L23427) và chủng độc lực Kresse (U44978) cho thấy rằng tất cả các vị trínucleotit thay thế được tìm thấy trong protein không cấu trúc đều không có ý nghĩa,trong khi đó 6/8 sự thay thế nucleotit nằm trong các gen cấu trúc (VP1/VP2) đã dẫn

tới sự thay đổi của axit amin được phiên mã Cụ thể, trong số các axit amin của genVP2, có 5 sự thay đổi là phù hợp khi so sánh với các chủng đã được phân lập trướcđây (I215T, D378G, H383Q, S436P và R565K) và ba trong số những thay đổi này(D378G, H383Q và S436P) được cho là chịu trách nhiệm cho những ái lực mô khácnhau (Bergeron và cs., 1996) Như thể hiện trên hình 4 (Streck và cs., 2011), các vịtrí được chỉ ra bằng các chấm tròn màu đỏ thể hiện sự khác biệt giữa các chủngNADL-2 và Kresse, ngoại trừ vị trí 436, được hiển thị chấm tròn màu tím Các chấmtròn màu xanh đại diện cho các vị trí thay thế ở các chủng mới, được thể hiện trên môhình không gian ba chiều, tạo bằng phần mềm Cn3D 4.1, các tọa độ này được lấy từ

đối với các gen VP1 và VP2, tỷ lệ này tương tự với tỷ lệ đã biết ở các chủng virutPPV (Streck và cs., 2011) Việc sử dụng liên tục vaccine bất hoạt ở các đàn lợn trong

ba thập kỷ qua cùng với các báo cáo số liệu về sự suy giảm sinh sản do virut PPV đãcho thấy tầm quan trọng trong việc giám sát liên tục các chủng PPV phân lập Để giảiquyết những vấn đề này, gần đây việc phân loại các chủng virut PPV đã được thực

hiện bằng cách xác định các đa hình nucleotit, phân tích phát sinh loài và ước lượng

tỷ lệ tiến hóa phân tử của PPV

Tỷ lệ mang virut PPV7 ở đàn lợn hậu bị trong các trại nhiễm và không nhiễm PPV7

là không khác biệt nhiều, tương ứng là 16,7 % và 13,6- 21,7 % (Palinski và cs.,2016)

Bảng 1.1 Phân loại các chủng PPV lưu hành trên thế giới

(Hijikata và cs., 2001) quá trình điều tra Hepatitis E ở

PPV1 (được biết đến với tên gọi PPV “cổ điển”- classical PPV) là tác nhân gây

ra rối loạn sinh sản ở lợn nái Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa protein capsid củaPPV cho thấy sự biến đổi di truyền ở phân tử VP dẫn đến sự hình thành các phânnhóm PPV khác nhau Chủng virut PPV có tên NADL-2 được sử dụng làm vaccine,tuy nhiên, nó có vài vị trí khác biệt trên protein capsid so với các chủng PPV gây bệnh

Những năm gần đây, do đặc tính ưu việt của PCR và sự phát triển của kỹ thuậtgiải trình tự gen thế hệ mới, nhiều chủng PPV mới được phát hiện Đầu tiên trong số

đó là chủng PPV2 được tìm thấy trong huyết thanh lợn trong quá trình điều traHepatitis E ở Myanmar (Hijikata và cs., 2001) Tiếp theo, vào năm 2006-2007 ở TrungQuốc, Parvovirut có đặc tính di truyền tương tự được tìm thấy trong huyết thanh lợn bịbệnh sốt cao “high fever” (nhiễm PPV) và hội chứng PMWS (Wang và cs., 2010) vàđến năm 2012 PPV được tìm thấy ở Hungari (Csagola và cs., 2012) Kết quả phân tíchcủa Xiao và cs (2013) tại 18 bang của Mỹ cho thấy, tỷ lệ lưu hành PPV2 ở lợn (các lứatuổi khác nhau) chiếm 20% (100/483) ở mẫu phổi và 7,6% (14/185) mẫu phân Kếtquả so sánh trình tự gen cho thấy mức tương đồng giữa chủng phân lập tại Mỹ vàchủng phân lập tại Trung Quốc năm 2006-2007 (95,4-97,7%) cao hơn so với cácchủng phát hiện năm 2001 tại Myanma (94,7%) Cây phả hệ di truyền xây dựng dựatrên trình tự toàn bộ hệ gen virut PPV chỉ ra rằng: 2 chủng PPV phân lập tại Mỹ đượcnhóm cùng với các chủng PPV2 phân lập tại Trung Quốc và Myanma, và có quan hệgần gũi với PARV4

Đến năm 2008, chủng PPV mới được phân lập tại Hồng Kông với tên gọi làPhoV (Porcine hokovirut) Kết quả phân tích trình tự hệ gen của PhoV bộc lộ mức độtương đồng cao với Parvovirut 4 ở người và hokovirut ở bò, tạo thành nhánh riêngtrong họ Parvovirut (Lau và cs., 2008) Nghiên cứu gần đây của Chueng và cs (2010)

đã xếp loại PhoV chính là PPV3 Phân bố địa lý chính xác của phân nhóm này chưađược xác nhận, tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ nhiễm PPV3 tươngđối cao phát hiện trên lợn nuôi ở Anh (Szelei và cs., 2010) và Hungari (Csagola và cs.,2012), trên lợn rừng ở Đức (Adlhoch và cs., 2010) và Rumania (Cadar và cs., 2011)

Một phân nhóm PPV mới, đó là PPV4, được phát hiện năm 2005 từ đàn lợnnhiễm bệnh liên quan đến hội chứng còi cọc sau cai sữa (PCVAD – Porcine Circovirusassociated disease) tại phía Bắc Carolina, Mỹ (Cheung và cs., 2010) và tiếp theo đó làtại Trung Quốc (Huang và cs., 2010; Zhang và cs., 2011) PPV4 có mức độ tươngđồng cao nhất với Parvovirut 2 ở bò, nhưng mức độ mã hóa và sắp xếp hệ gen lạitương tự với bocavirut vì PPV4 mã hóa cho 1 khung đọc mở nữa (ORF3) định vị giữaORF1 và ORF2 giống như bocavirut Mặc dù tỷ lệ đàn lợn dương tính nhiễm PPV4trên thế giới nói chung còn thấp, dao động trong khoảng 2,09-6,6% (Huang và cs.,

2010; Zhang và cs., 2011; Csagola và cs., 2012) nhưng tỷ lệ nhiễm PPV4 trong các đàn dương tính lại khá cao, chiếm đến 20-50%.

Tỷ lệ lưu hành virut PPV ở lợn nuôi (n=120) và lợn rừng (n=842) tại vùngTransylvania, phía Tây Rumania đã được tiến hành xác định bằng phương pháp PCR.Kết quả nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ dương tính với PPV2 là 25% (30/120) đối vớilợn nuôi, bvà 10,3% (87/842) đối với lợn rừng 17,5% (21/120) lợn nuôi dương tínhvới PPV3 Đối với PPV4, tỷ lệ lợn rừng mang virut là rất thấp 0,95% (8/842), ngượclại có đến 10% lợn nuôi phát hiện được virut (12/120) Tỷ lệ đồng nhiễm PPV2 vàPPV3 là cao nhất, đạt 79% (31/39) ở lợn nuôi và 54,1% ở lợn rừng (213/390) Nghiêncứu của Cadar và cs., (2013) dựa trên trình tự toàn bộ gen mã hóa protein capsid đãcung cấp thông tin về quan hệ di truyền, dịch tễ phân tử và đóng góp của tái tổ hợp vàchọn lọc vào quá trình tiến hóa phân tử của các chủng virut PPV mới phân lập (PPV2,PPV3, PPV4) trên đối tượng vật chủ là lợn nuôi và lợn rừng Đây chính là công trìnhkhoa học đầu tiên công bố sự có mặt của PPV2 và PPV4 trên quần thể lợn rừng

Hình 1.6 Cây phả hệ di truyền dựa trên trình tự bộ gen capsid các chủng thuộc PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 phân lập từ lợn nuôi và lợn rừng (Cadar và cs., 2012)

Hình 1.6 (Cadar và cs., 2012) trình bày kết quả phân tích quan hệ di truyền củacác chủng PPV cổ điển và PPV mới dựa trên trình tự gen mã hóa toàn bộ proteincapside Kết quả cho thấy phân nhóm PPV1 và PPV2 có quan hệ gần gũi với nhau,trong khi đó, PPV3 và PPV4 được xếp gần nhau hơn và cách biệt với PPV1 và PPV2.Các chủng thuộc PPV1 được phân thành 6 nhóm khác biệt phù hợp với các phân loại

di truyền trong các nghiên cứu trước đây Các chủng PPV2 được phân thành 2 phânnhóm rõ rệt theo cây phân loại di truyền Phân nhóm thứ 1 của PPV2 bao gồm cácchủng PPV2 phân lập từ lợn nuôi ở Rumania, với đặc trưng là sự thay thế của các axit

các chủng PPV2 phân lập từ lợn rừng và chủng PPV2 phát hiện đầu tiên ở Myanma.PPV3 được phân chia rõ ràng thành 4 phân nhóm (A-D), đặc trưng bởi các đột biến

lại với nhau và tách biệt với các chủng PPV4 phân lập từ Mỹ và Trung Quốc Phântích cây phả hệ di truyền chỉ ra rằng các chủng PPV phân lập từ lợn rừng có mức độ đadạng di truyền cao hơn các chủng phân lập từ lợn nuôi mặc dù chúng thuộc cùng mộtvùng địa lý

Chủng PPV phân lập ở Đức có sự khác biệt di truyền lớn so với các chủng thamchiếu trên GenBank và chủng virut vaccine hiện đang sử dụng (Zimmermann và cs.,2006) Mức độ đột biến di truyền của các chủng PPV2, PPV3 và PPV4 phân tích ở cả

PPV4 Giá trị này tương đương với mức biến đổi di truyền ở các virut ARN (Cadar

và cs., 2013)

Điều này gợi ý rằng tốc độ tiến hóa cao của gen cap ở PPV2 có thể ảnh hưởngbởi hiện tượng tái tổ hợp thường xuyên, hiện tượng này cũng tìm thấy ở các virutADN sợi đơn khác (Duffy and Holmes., 2008) Đây được xem là nhóm có tỷ lệ thaythế nucleotit cao nhất trong số các virut ADN sợi đơn ở PPV1 và PPV2 (Streck và cs.,2011) Ngày càng nhiều bằng chứng gợi ý các cơ chế tiến hóa khác nhau của PPV như:đồng tiến hóa trong quan hệ virut - vật chủ, sự giao truyền cùng và khác loài, tái tổ hợp

và chọn lọc, đóng vai trò quan trọng trong tiến hóa của PPV (Lukashov và Goudsmit.,2001; Shackelton và cs., 2005; 2007; Streck và cs., 2001; Cadar và cs., 2012)

Hình 1.7 Bản đồ các chuỗi gen capsid giả định của PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 chothấy các đặc tính nucleotit và axit amin đặc trưng và cấu trúc thứ cấp dự đoán Bản đồ

được xây dựng bằng phần mềm Geneious 4.8.5 (Cadar và cs., 2013)

Nghiên cứu của Ni và cs., (2014) xác nhận sự có mặt của PPV mới (PPV6) đanglưu hành tại các trang trại lợn ở Trung Quốc Hệ gen PPV6 có kích thước khoảng 6,1

kb, và có sắp xếp hệ gen tương đương với các parvovirut khác, với đặc trưng là:5’UTR- ORF1-ORF2-3’UTR PPV6 có kích thước phân tử của hệ gen và gen cấu trúclớn hơn so với PPV5 Tuy nhiên, kết quả phân tích trình tự nucleotit của 5 chủngPPV6 cho thấy chúng có 20,5-42,5% trình tự ADN tương đồng với các chủngParvovirut và mức tương đồng cao nhất với PPV4 Ở mức độ axit amin, PPV6 có mứctương đồng cao nhất với trình tự protein không cấu trúc của PPV4 (49,8%) và vớiprotein cấu trúc của PPV5 (29,8%) Cho dù PPV6 có mức độ tương đồng axit aminthấp so với các parvovirut khác, các motif trình tự bảo thủ quan trọng cho các chứcnăng của parvovirut đã được tìm thấy, ví dụ như: motif khởi đầu sao chép (I, II), các

tích cây phả hệ di truyền chứng minh rằng: PPV6 cùng với PPV4 và PPV5 tạo nên mộtnhánh riêng biệt có khác biệt di truyền với nhóm xác định trước đây trong phân họParvovirut và có thể xếp thành chi mới trong Copiparvovirut (Xiao và cs., 2013a)

Gần đây nhất PPV7 được phát hiện trong các mẫu phân, huyết thanh và phổi từnhững con lợn nái trưởng thành khỏe mạnh ở Mỹ (Palinski và cs., 2016) Ở TrungQuốc, PPV7 được phát hiện trong huyết thanh các mẫu được thu thập trong năm 2014

từ hai trang trại nuôi lợn thương phẩm (Xing và cs., 2017) Hệ gen PPV7 có kíchthước 4103 bp bao gồm hai khung đọc mở ORF liền kề mã hóa cho 672 và 469 axit

amin Phân tích BLASTP của protein cho thấy axit amin ở vị trí 672 có sự tương đồng42,4% so với EhPV2 (Eidolon helvum parvovirut 2) và 37,9 % so với TuPV (Turkeyparvovirut) Ở axit amin 469 không có sự tương đồng đáng kể với các protein đã biết.Phân tích cây phả hệ di truyền và phát sinh loài cho thấy PPV7, EhPV2 và TuPV tạonên một nhánh phân biệt có khác biệt di truyền với nhóm xác định trước đây trongphân họ Parvovirut (Palinski và cs., 2016) Việc phát hiện ra PPV7 mới cung cấpthông tin về đa dạng di truyền của virut PPV Mặc dù PPV4, PPV5, PPV6 và PPV7được phát hiện trong những năm gần đây nhưng các đặc tính sinh học của các virutnày cũng như mối liên quan tới bệnh sinh sản ở lợn vẫn còn nhiều vấn đề cần tiếp tụcđược nghiên cứu.

1.5 Tình hình nghiên cứu PPV ở Việt Nam

Chất lượng sinh sản của con nái đóng góp vai trò quan trọng trong việc cungcấp nguồn con giống tốt cho chăn nuôi lợn Ở các nước Đông Nam Á, trong đó có ViệtNam, hiện tại có nhiều vấn đề về đàn nái sinh sản bị bệnh truyền nhiễm và bệnh sinhsản Phương pháp phòng chống thường được áp dụng là tiêm phòng vaccine và sửdụng kháng sinh Để hạn chế tối đa chi phí cho chăn nuôi, nhiều nông hộ có thể đãdừng tiêm phòng vaccine và sự ảnh hưởng có thể nhìn thấy bằng sự xuất hiện bệnh tật

mà những bệnh này làm giảm hiệu suất sinh sản Ở các nước nhiệt đới, điều kiện thờitiết cũng là yếu tố tạo điều kiện cho dịch bệnh phát triển nhiều Ở Việt Nam, hội chứngsuy giảm sinh sản lợn do PPV được quan tâm nhiều từ những năm đầu 1990 Bệnh gâytổn thất lớn trên trên các đàn nái sinh sản, những năm gần đây do tiêm phòng cũng nhưđáp ứng miễn dịch tự nhiên nên bệnh hiện nằm trong tầm kiểm soát

Năm 2007, Sở khoa học và công nghệ Tiền Giang hỗ trợ đề tài “Khảo sát tìnhhình rối loạn sinh sản ở heo nái và đề ra giải pháp khắc phục tình trạng chậm lêngiống, phối giống không đậu, sẩy thai, để non” với nội dung “Tìm hiểu mối quan hệgiữa tình trạng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp, bệnh dịch tả, bệnh giả dại, bệnh sẩythai truyền nhiễm, bệnh phó thương hàn và bệnh do Parvovirut với khả năng sinh sảncủa heo nái, từ đó đề xuất gải pháp khắc phục”

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Huỳnh (2000) đưa ra nhận định rằng Porcineparvovirut là yếu tố quan trọng tác động tới sự suy giảm khả năng sinh sản của lợn nái

ở tỉnh Long An Tỷ lệ suy giảm sinh sản ở lợn nái từ 21,7% - 26,1%, tỷ lệ suy giảm

sinh sản ở lứa đẻ là 7,6% - 9% Tần số suy giảm sinh sản ở các lứa đầu cao hơn các lứasau và các vùng sinh thái khác nhau không có ảnh hưởng đáng kể tới tỷ lệ suy giảmsinh sản ở lợn nái Xét nghiệm 4.166 mẫu huyết thanh cho thấy tỉ lệ kết quả dươngtính với Porcine parvovirut chiếm 69,5% Phân tích 52 mẫu thai chết lưu đã phát hiệnđồng thời virut PPV và kháng thể PPV.

Nói chung, cho đến nay chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu và công

bố về đặc trưng di truyền và trình tự nucleotit hệ gen PPV phân lập tại Việt Nam Đâyđược xem là nghiên cứu đầu tiên phân tích, đánh giá mức độ biến đổi di truyền củaPPV đang lưu hành tại Việt Nam, so với các chủng đang lưu hành trong khu vực vàtrên thế giới, so với chủng virut vaccine đang sử dụng Từ đó, xác định phân nhóm ưuthế của chủng PPV đang lưu hành tại các địa phương

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian tiến hành: Luận văn được tiến hành từ 09/2017 đến 10/2018

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Gen động vật – Viện Công nghệ sinh học– Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu phổi lợn (n=74) được thu thập từ một số lò mổ và chợ ở các tỉnh nhưBắc Giang (n=10); Hòa Bình (n=20); Hà Nội (n=24); Hà Tĩnh (n=20) Mỗi lò mổ vàchợ thu thập không quá 5 mẫu

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen

Bảng 2.4 Các các hóa chất sử dụngS

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm2.3.1 Tách ADN tổng số

Phương pháp này dựa trên phương pháp của Sambrook và Russell (2001)