Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpob, katg của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở việt nam (tt)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y Nguyễn Thị Thu Thái NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN rpoB, katG CỦA VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thái Sơn PGS.TS Đinh Ngọc Sỹ Phản biện 1: GS TS Tạ Thành Văn Phản biện 2: GS TSKH Phùng Đắc Cam Phản biện 3: PGS TS Lê Hữu Song Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường, họp Học viện Quân Y vào hồi: …….giờ……., ngày…….tháng…….năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Học viện Quân Y ĐẶT VẤN ĐỀ Lao kháng đa thuốc thách thức cho chiến chống lao toàn cầu Đây trường hợp lao kháng với đồng thời rifampicin isoniazid Kháng rifampicin liên quan đến đột biến gen rpoB, kháng isoniazid thường liên quan đến đột biến gen katG Việt Nam quốc gia có tỷ lệ bệnh lao lao kháng thuốc cao Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng đa thuốc bệnh nhân lao 4%, bệnh nhân điều trị lại 23% Chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc đáp ứng yêu cầu giám sát kiểm soát bệnh lao Đặc điểm phân tử của chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập từ quốc gia có tỷ lệ bệnh lao tỷ lệ lao kháng thuốc cao tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển có hiệu kỹ thuật sinh học phân tử để phát nhanh chóng tính kháng thuốc phù hợp với từng nước từng khu vực Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB và katG liên quan đến kháng đa thuốc chủng vi khuẩn lao phân lập năm 2008-2009 Xác định giá trị phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc phân lập từ bệnh viện đại diện cho miền Bắc, Trung Nam của Việt Nam - Góp phần bổ sung thông tin đột biến liên quan đến kháng đa thuốc vi khuẩn lao sở khoa học cho việc khuyến cáo lựa chọn đột biến sử dụng để sàng lọc lao kháng đa thuốc với độ nhạy độ đặc hiệu cao - Đề xuất sử dụng codon đột biến (rpoB531, rpoB526, rpoB516 katG315) đưa vào sử dụng test phân tử sàng lọc lao kháng đa thuốc trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc Việt Nam BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 114 trang: Đặt vấn đề: 02 trang, Tổng quan: 31 trang, Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 18 trang, Kết nghiên cứu: 25 trang, Bàn luận: 35 trang, Kết luận: 02 trang, Kiến nghị: 01 trang Luận án có 29 bảng, 01 biểu đồ, 16 hình minh họa, 142 tài liệu tham khảo có 12 tài liệu tiếng Việt, 130 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lao Lao bệnh truyền nhiễm xuất từ lâu Sự tương tác lao, đại dịch HIV/AIDS sự phát triển của chủng lao kháng thuốc gây thách thức vô cùng to lớn cho chiến chống lao của loài người 1.1.1 Tình hình bệnh lao thế giới: Hiện nay, giới có khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao Theo công bố của WHO, năm 2012 có thêm khoảng 8,6 triệu người mắc lao 1,3 triệu người tử vong lao Trong số trường hợp tử vong, có 170 000 trường hợp lao kháng đa thuốc 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam: Năm 2012, Việt Nam đứng thứ 12/22 nước có gánh nặng bệnh lao cao toàn cầu Năm 2013, tỉ lệ mắc lao thể 144/100.000 dân; tỉ lệ mắc lao thể 209/100.000 dân; tỉ lệ tử vong lao 19/100.000 dân 1.2 Vi khuẩn lao Tác nhân gây bệnh lao phức hợp gồm nhiều loài gọi chung Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) Khả gây bệnh của loài khác nhau, loài gây bệnh thường xuyên người Mycobacterium tuberculosis (MTB) 1.2.1 Đặc điểm hình thể, cấu trúc: Vi khuẩn lao có hình trực mảnh, khó bắt màu thuốc nhuộm thông thường Thường nhuộm theo phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ 1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn lao ưa khí bắt buộc, khó nuôi cấy vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R 1.2.3 Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao: Bộ gen hoàn chỉnh của MTB chủng H37Rv có chiều dài 4.411.532 bp, bao gồm 3974 gen, có 3924 gen mã hóa cho protein, 50 gen mã hóa cho RNA chức 1.3 Vi khuẩn lao kháng thuốc 1.3.1 Tình hình kháng thuốc vi khuẩn lao Vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc thách thức lớn cho công tác phòng chống lao toàn cầu Việt Nam 27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc toàn cầu Năm 2013, tỷ lệ kháng đa thuốc bệnh nhân điều trị lại 23%, bệnh nhân lao 4% 1.3.2 Phân loại kháng thuốc vi khuẩn lao Trong trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt: lao kháng đơn thuốc, lao kháng đa thuốc, lao kháng đa thuốc mở rộng Lao kháng đa thuốc (MDR-TB) vi khuẩn lao kháng với loại thuốc isoniazid rifampicin, kháng thêm số tác nhân hoá trị liệu khác 1.3.3 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao cho có sự đột biến gen liên quan 1.3.3.1 Kháng rifampicin: Kháng rifampicin thường đột biến vùng lõi 81 bp, vùng "hot-spot mutation" (vùng định kháng rifampicin - RRDR) của gen rpoB, với khoảng 96% chủng MTB kháng rifampicin phân lập Kháng đơn với rifampicin gặp, mà hầu hết chủng lao kháng rifampicin cũng kháng với thuốc khác, đặc biệt isoniazid – kháng đa thuốc 1.3.3.2 Kháng isoniazid: Cơ sở phân tử của tính kháng với isoniazid phức tạp sự đa dạng đột biến gen khác của MTB Trong đó, chủ yếu đột biến gen katG Đề kháng isoniazid dạng kháng thuốc thường gặp nhất, kháng đơn độc kết hợp với thuốc khác 1.4 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc 1.4.1 Phương pháp kiểu hình: dựa sở sự sinh trưởng của vi khuẩn lao môi trường chứa thuốc kháng sinh Có nhiều phương pháp kiểu hình, nhiên phương pháp tỷ lệ môi trường Loewenstein-Jensen sử dụng rộng rãi 1.4.2 Phương pháp xác định kiểu gen: dựa sở xác định đột biến gen có liên quan kháng thuốc tương ứng kỹ thuật sinh học phân tử Đây phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, rút ngắn thời gian xác định vi khuẩn lao kháng thuốc (1-2 ngày) Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen coi hữu ích chuẩn xác việc phát đột biến liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao 1.5 Nghiên cứu giá trị chẩn đoán của phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc 1.5.1 Trên thế giới Nhiều nghiên cứu đã đánh giá phương pháp sinh học phân tử khác chẩn đoán lao kháng thuốc kháng đa thuốc khu vực khác giới Các tác giả giới đánh giá kỹ thuật sinh học phân tử có giá trị cao việc phát nhanh tính kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc của vi khuẩn lao với độ nhạy độ đặc hiệu cao Kỹ thuật giải trình tự đời đã coi tiêu chuẩn vàng cho việc xác định đột biến kháng thuốc Vì vậy, nhiều nghiên cứu giới đã lấy kỹ thuật giải trình tự làm sở để phát triển, thiết kế cũng đánh giá kỹ thuật phân tử xác định nhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn lao 1.5.2 Tại Việt Nam Các nghiên cứu nước có chung nhận xét rằng, việc áp dụng xét nghiệm sinh học phân tử với độ nhạy độ đặc hiệu cao có lợi nơi có tỉ lệ kháng thuốc cao Việt Nam; đặc biệt ưu tiên với trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc cao, bệnh nhân HIV (+), trường hợp tiếp xúc với lao kháng đa thuốc trường hợp lao tái phát, lao điều trị lại cho phép phát sớm trường hợp lao kháng đa thuốc, công cụ hỗ trợ hữu hiệu cho việc xây dựng chế độ điều trị phù hợp với bệnh nhân lao, đặc biệt bệnh nhân lao kháng đa thuốc, góp phần hạn chế sự lây lan chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc cộng đồng 1.6 Gen rpoB và katG liên quan đến kháng thuốc ở vi khuẩn lao 1.6.1 Gen rpoB Gen rpoB mã hoá cho tiểu phần β của ARN polymerase (một enzyme quan trọng trình phiên mã biểu gen MTB), đích tác động của kháng sinh rifampicin Gen rpoB có chiều dài 3534bp, mã hoá cho protein với 1178 acid amin 1.6.2 Gen katG Gen katG có kích thước 2223bp với 741 codon mã hoá, nằm nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao, chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase – peroxidase (enzyme hoạt hoá isoniazid thành dạng hoạt động) 1.7 Nghiên cứu gen rpoB và katG ở chủng vi khuẩn lao 1.7.1 Trên thế giới 1.7.1.1 Nghiên cứu gen rpoB với kháng rifampicin Nhiều nghiên cứu khu vực khác giới đã xác định phần lớn chế phân tử kháng rifampicin với khoảng 69 đột biến điểm thay đổi nucleotid, đột biến thêm đoạn, 16 đột biến đoạn 38 đột biến thay nhiều nucleotid Trong đó, đột biến vị trí 531, 526 516 thường gặp thường gắn liền với chủng kháng đa thuốc Các kiểu đột biến thường gặp Ser531Leu, His526Tyr Asp516Val 1.7.1.2 Nghiên cứu gen rpoB với kháng isoniazid Các nghiên cứu giới đã đã xác định 100 loại đột biến gen katG Trong đó, đột biến hay gặp vị trí 315, chủ yếu kiểu đột biến Ser315Thr, chiếm tới 30-95% chủng lao lâm sàng kháng isoniazid Vị trí đột biến coi dấu ấn quan trọng của đề kháng với isoniazid Tuy nhiên, nghiên cứu từ nhiều khu vực khác giới cũng cho thấy rằng, tần xuất đột biến gen rpoB katG khác chủng phân lập từ vùng địa lý khác 1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Tại Việt Nam, cũng đã có nghiên cứu xác định đột biến xảy gen rpoB katG chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin isoniazid Các nghiên cứu nước cũng đã sử dụng kỹ thuật phân tử khác để xác định đột biến kháng thuốc Các nghiên cứu phân tử gen rpoB katG chủng vi khuẩn lao kháng thuốc chỉ tập trung vùng miền định mà chưa bao phủ toàn quốc, nghiên cứu cũng thường đánh giá kỹ thuật chẩn đoán áp dụng thiết kế thử nghiệm kỹ thuật áp dụng chủng lao phân lập địa điểm Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lao phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện: Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - thành phố Hồ Chí Minh thời gian 2008-2009 - 143 chủng vi khuẩn lao giải trình tự phát đột biến gen rpoB katG , đó: 30 chủng nhạy cảm với thuốc chống lao; 54 chủng có kiểu hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn với rifampicin 51 chủng MDR); 59 chủng có kiểu hình kháng với isoniazid (13 chủng kháng đơn với isoniazid 46 chủng MDR) 2.2 Địa điểm nghiên cứu Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - TP Hồ Chí Minh, Học viện quân Y, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Công nghệ sinh học 2.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu: Các sinh phẩm, hóa chất dùng tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng giải trình tự gen 2.3.2 Thiết bị: tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng giải trình tự gen 2.3.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng PCR có trình tự tương ứng sau: Sản phẩm Gen đích Mồi Trình tự PCR (bp) rpoB-F 5’-ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT-3’ rpoB_seq rpoB528 5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT-3’ R katG-F 5’ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG 3’ katG_seq 684 katG-R 5’ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT 3’ 10 2.3.4 Phần mềm: Phân tích kết giải trình tự phần mềm BioEdit 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu phương pháp mô tả cắt ngang phương pháp thực nghiệm labo có đối chứng 2.4.2 Phương pháp thu thập số liệu - Các số liệu tính kháng thuốc thu thập làm kháng sinh đồ bổ sung Bệnh viện Phổi Trung Ương Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch -TP Hồ Chí Minh - Kỹ thuật tách chiết DNA của chủng vi khuẩn lao thực Học viện quân Y - Thực kỹ thuật giải trình tự phân tích đặc điểm phân tử gen rpoB tiến hành Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, gen katG Viện công nghệ sinh học 14 RRDR gen rpoB Đột biến vùng RRDR chủng kháng đa thuốc 94,1% - Các vị trí đột biến liên quan kháng rifampicin gen rpoB (n=54): Các vị trí đột biến thường gặp 531 (50%), 526 (29,63%), 516 (9,26%) Các vị trí đột biến phát hiện: 530 đoạn từ codon 511-515 Mất đoạn 511-515 TGAGCCAATTCA GTC Val TTG Leu CTC Leu ATG TTG Met Leu 23 TAC Tyr GAC Asp TGG Trp TTC Phe CGC CAG Arg Gln CCG Pro AGC Ser ACC Thr Hình 3.2 Số lượng và kiểu đột biến vùng RRDR Có 15 kiểu đột biến vị trí riêng biệt Tại codon 531, kiểu đột biến TCG → TTG (Ser → Leu) chiếm ưu thế; codon 526 có sự đa dạng kiểu đột biến (6 kiểu); chỉ gặp kiểu đột biến GAC → GTC (Asp → Val) codon 516 - Các kiểu kết hợp vị trí đột biến xảy đoạn gen rpoB (n=54): Trong số 54 chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin; tỷ lệ chủng mang 1, 2, vị trí đột biến 72,2%; 16,7%; 5,6%; chủng đoạn codon 511-515 Các đột biến đơn thường chỉ xuất vùng RRDR của gen rpoB, với chủng có sự kết hợp nhiều vị trí đột biến xuất đột biến vùng RRDR của gen rpoB 15 3.1.3 Đặc điểm phân tử gen katG Bảng 3.11 Kết giải trình tự đoạn 684bp gen katG Chủng vi khuẩn lao Xác định đột biến Đặc tính Số lượng Đột biến Không đột chủng biến Nhạy thuốc 10 10 Kháng H 59 48 (81,4%) 11 (18,6%) Tổng số 69 48 21 Trong 59 chủng kháng isoniazid; 48 81,4% chủng đột biến gen katG; 18,6% chủng có kiểu hình kháng isoniazid không phát đột biến đoạn 684bp của gen katG Bảng 3.12 Tỷ lệ đột biến chủng kháng đơn với isoniazid Đột biến Không đột biến Tổng số và kháng đa thuốc Kháng đơn H Kháng đa thuốc N tỷ lệ % n tỷ lệ % 46,2 42 91,3 53,8 8,7 13 100 46 100 Tổng số 48 11 59 Tần suất xuất đột biến gen katG chủng kháng đa thuốc cao có ý nghĩa thống kê so với chủng kháng đơn với isoniazid (p