Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu gây tỷ lệ tử vong trên thế giới ngày nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1/3 dân số thế giới nhiễm lao. Mỗi năm, có thêm gần 9 triệu người mắc lao mới và khoảng 1,3 triệu người tử vong do lao. Trong đ , 81 số bệnh nhân thuộc về 22 nước c g nh n ng bệnh lao [133]. Trong khi đ , tỷ lệ ph t hiện m c dù liên tục được cải thiện nhưng chỉ đạt 66 số bệnh nhân ước tính [133], do c những hạn chế về công t c chẩn đo n, đ c biệt là lao kh ng thuốc. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được ph t hiện và chữa trị đang tiếp tục lây lan cho cộng đồng. Theo thống kê của WHO, Việt Nam là một quốc gia c tỷ lệ bệnh lao cao. Theo b o c o của Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) năm 2013, tổng số người mắc lao là 190.000; trong đó, số người mắc lao mới khoảng 130.000, số trường hợp tử vong do lao ước t nh là 17.000 người. Tình hình kh ng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đ ng lo ngại. Tỷ lệ vi khuẩn lao kh ng đa thuốc ở bệnh nhân điều trị lại là 23 , ở bệnh nhân lao mới là 4% [4]. Trong c c loại kh ng thuốc của vi khuẩn lao, kh ng rifampicin và isoniazid - những thuốc chủ l c trong điều trị lao - được quan tâm nhất vì thường dẫn đến thất bại trong điều trị và tử vong. Theo định nghĩa của WHO, “lao kh ng đa thuốc” là trường hợp kh ng với t nhất đồng thời rifampicin và isoniazid [135]. S đề kh ng với 2 thuốc chống lao dòng 1 này được cho là c đột biến trên một số gen liên quan, đ c biệt là c c gen rpoB và katG. Các nghiên cứu về t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao cho thấy, rất hiếm c c chủng kh ng rifampicin đơn thuần mà thường c t nhất 90 c c chủng lao lâm sàng kh ng rifampicin đồng thời cũng kh ng isoniazid [15], [62]. Như vậy, việc ph t hiện c c chủng lao kh ng rifampicin cũng c nghĩa là x c định được lao kh ng đa thuốc [92]. Các nghiên cứu về phân tử của vi khuẩn lao kh ng rifampicin đã công bố cho thấy, t nh kh ng rifampicin liên quan đến đột biến ở gen rpoB, còn kh ng isoniazid thường liên quan đến đột biến ở gen katG [112], [140]. Chẩn đo n lao kh ng thuốc chủ yếu vẫn d a vào phương ph p kh ng sinh đồ và phải mất khoảng 8 tuần mới cho kết quả. Chẩn đo n nhanh vi khuẩn lao kh ng thuốc, đ c biệt là kh ng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cần thiết trong công t c gi m s t và ki ểm so t lao. C c kit thương mại của nước ngoài chẩn đo n lao kh ng thuốc c gi thành cao và thường chỉ nhằm vào c c điểm đột biến 526, 531 trên gen rpoB và 315 trên gen katG. Các nghiên cứu về lao kh ng thuốc ở từng khu v c lại ph t hiện thêm c c điểm đột biến ở vị tr kh c như 514, 533, 176 trên gen rpoB; đ c biệt tần số c c đột biến thay đổi giữa c c cộng đồng người và vùng địa lý [15], [52], [65], [88], [110], [140]. Đ c điểm phân tử của c c chủng kh ng thuốc phân lập được từ c c vùng kh c nhau trên thế giới, nhất là từ c c quốc gia c tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ lao kh ng thuốc cao s tạo điều kiện thuận lợi cho việc ph t triển c hiệu quả hơn c c phương ph p phân tử để ph t hiện nhanh ch ng t nh kh ng thuốc phù hợp với từng nước và từng khu v c. Việt Nam chưa c c c dữ kiện đầy đủ về đ c điểm phân tử của vi khuẩn lao kh ng đa thuốc trong nước nên chưa c cơ sở để p dụng nguyên bản kit chẩn đo n lao kh ng thuốc của nước ngoài. Vì vậy chúng tôi th c hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam” nhằm mục tiêu: ố ủ ủ ẩ phân lậ ượ năm 2008-2009. ủ ư ẩ ẩ ố ở Việ N .
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y Nguyễn Thị Thu Thái NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN rpoB, katG CỦA VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Lao kháng đa thuốc thách thức cho chiến chống lao toàn cầu Đây trường hợp lao kháng với đồng thời rifampicin isoniazid Kháng rifampicin liên quan đến đột biến gen rpoB, kháng isoniazid thường liên quan đến đột biến gen katG Việt Nam quốc gia có tỷ lệ bệnh lao lao kháng thuốc cao Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng đa thuốc bệnh nhân lao 4%, bệnh nhân điều trị lại 23% Chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc đáp ứng yêu cầu giám sát kiểm soát bệnh lao Đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập được từ các quốc gia có tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ lao kháng thuốc cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển có hiệu quả các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện nhanh chóng tính kháng thuốc phù hợp với từng nước và từng khu vực Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB và katG liên quan đến kháng đa thuốc chủng vi khuẩn lao phân lập năm 2008-2009 Xác định giá trị phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB katG vi khuẩn lao kháng đa thuốc phân lập từ bệnh viện đại diện cho miền Bắc, Trung Nam Việt Nam - Góp phần bổ sung thông tin đột biến liên quan đến kháng đa thuốc vi khuẩn lao sở khoa học cho việc khuyến cáo lựa chọn đột biến sử dụng để sàng lọc lao kháng đa thuốc với độ nhạy độ đặc hiệu cao - Đề xuất sử dụng codon đột biến (rpoB531, rpoB526, rpoB516 katG315) đưa vào sử dụng test phân tử sàng lọc lao kháng đa thuốc trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc Việt Nam BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 114 trang: Đặt vấn đề: 02 trang, Tổng quan: 31 trang, Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 18 trang, Kết nghiên cứu: 25 trang, Bàn luận: 35 trang, Kết luận: 02 trang, Kiến nghị: 01 trang Luận án có 29 bảng, 01 biểu đồ, 16 hình minh họa, 142 tài liệu tham khảo có 12 tài liệu tiếng Việt, 130 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lao Lao bệnh truyền nhiễm xuất từ lâu Sự tương tác lao, đại dịch HIV/AIDS phát triển chủng lao kháng thuốc gây thách thức vô to lớn cho chiến chống lao của loài người 1.1.1 Tình hình bệnh lao giới: Hiện nay, giới có khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao Theo công bố WHO, năm 2012 có thêm khoảng 8,6 triệu người mắc lao 1,3 triệu người tử vong lao Trong số các trường hợp tử vong, có 170 000 trường hợp lao kháng đa thuốc 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam: Năm 2012, Việt Nam đứng thứ 12/22 nước có gánh nặng bệnh lao cao toàn cầu Năm 2013, tỉ lệ mắc lao thể 144/100.000 dân; tỉ lệ mắc lao thể 209/100.000 dân; tỉ lệ tử vong lao 19/100.000 dân 1.2 Vi khuẩn lao Tác nhân gây bệnh lao phức hợp gồm nhiều loài gọi chung Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) Khả gây bệnh loài khác nhau, loài gây bệnh thường xuyên người Mycobacterium tuberculosis (MTB) 1.2.1 Đặc điểm hình thể, cấu trúc: Vi khuẩn lao có hình trực mảnh, khó bắt màu thuốc nhuộm thông thường Thường nhuộm theo phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ 1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn lao ưa khí bắt buộc, khó nuôi cấy và là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R 1.2.3 Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao: Bộ gen hoàn chỉnh MTB chủng H37Rv có chiều dài 4.411.532 bp, bao gồm 3974 gen, đó có 3924 gen mã hóa cho protein, 50 gen mã hóa cho các RNA chức 1.3 Vi khuẩn lao kháng thuốc 1.3.1 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao hiện Vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc thách thức lớn cho công tác phòng chống lao toàn cầu Việt Nam 27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc toàn cầu Năm 2013, tỷ lệ kháng đa thuốc bệnh nhân điều trị lại 23%, bệnh nhân lao 4% 1.3.2 Phân loại kháng thuốc của vi khuẩn lao Trong trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt: lao kháng đơn thuốc, lao kháng đa thuốc, lao kháng đa thuốc mở rộng Lao kháng đa thuốc (MDR-TB) vi khuẩn lao kháng với loại thuốc isoniazid rifampicin, kháng thêm số tác nhân hoá trị liệu khác 1.3.3 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao Tính kháng thuốc vi khuẩn lao cho có đột biến gen liên quan 1.3.3.1 Kháng rifampicin: Kháng rifampicin thường đột biến vùng lõi 81 bp, vùng "hot-spot mutation" (vùng định kháng rifampicin - RRDR) gen rpoB, với khoảng 96% chủng MTB kháng rifampicin phân lập Kháng đơn với rifampicin rất hiếm gặp, mà hầu hết các chủng lao kháng rifampicin cũng kháng với các thuốc khác, đặc biệt là isoniazid – kháng đa thuốc 1.3.3.2 Kháng isoniazid: Cơ sở phân tử tính kháng với isoniazid phức tạp đa dạng đột biến gen khác MTB Trong đó, chủ yếu đột biến ở gen katG Đề kháng isoniazid dạng kháng thuốc thường gặp nhất, kháng đơn độc kết hợp với thuốc khác 1.4 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc 1.4.1 Phương pháp kiểu hình: dựa sở sinh trưởng vi khuẩn lao môi trường chứa thuốc kháng sinh Có nhiều phương pháp kiểu hình, nhiên phương pháp tỷ lệ môi trường Loewenstein-Jensen sử dụng rộng rãi 1.4.2 Phương pháp xác định kiểu gen: dựa sở xác định đột biến gen có liên quan kháng thuốc tương ứng kỹ thuật sinh học phân tử Đây phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, rút ngắn thời gian xác định vi khuẩn lao kháng thuốc (1-2 ngày) Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen coi hữu ích chuẩn xác việc phát đột biến liên quan kháng thuốc vi khuẩn lao 1.5 Nghiên cứu giá trị chẩn đoán của các phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc 1.5.1 Trên giới Nhiều nghiên cứu đánh giá phương pháp sinh học phân tử khác chẩn đoán lao kháng thuốc kháng đa thuốc khu vực khác giới Các tác giả thế giới đều đánh giá các kỹ thuật sinh học phân tử có giá trị cao việc phát hiện nhanh tính kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc của vi khuẩn lao với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kỹ thuật giải trình tự đời đã được coi là tiêu chuẩn vàng cho việc xác định các đột biến kháng thuốc Vì vậy, nhiều nghiên cứu thế giới đã lấy kỹ thuật giải trình tự làm sở để phát triển, thiết kế cũng đánh giá các kỹ thuật phân tử xác định nhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn lao 1.5.2 Tại Việt Nam Các nghiên cứu nước đều có chung nhận xét rằng, việc áp dụng xét nghiệm sinh học phân tử với độ nhạy và độ đặc hiệu cao có lợi nơi có tỉ lệ kháng thuốc cao Việt Nam; đặc biệt ưu tiên với các trường hợp nghi ngờ lao kháng đa thuốc cao, bệnh nhân HIV (+), các trường hợp tiếp xúc với lao kháng đa thuốc và các trường hợp lao tái phát, lao điều trị lại cho phép phát hiện sớm các trường hợp lao kháng đa thuốc, sẽ là công cụ hỗ trợ hữu hiệu cho việc xây dựng chế độ điều trị phù hợp với bệnh nhân lao, đặc biệt bệnh nhân lao kháng đa thuốc, góp phần hạn chế sự lây lan các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt kháng đa thuốc cộng đồng 1.6 Gen rpoB và katG liên quan đến kháng thuốc ở vi khuẩn lao 1.6.1 Gen rpoB Gen rpoB mã hoá cho tiểu phần β của ARN polymerase (một enzyme quan trọng trình phiên mã biểu gen MTB), là đích tác động của kháng sinh rifampicin Gen rpoB có chiều dài 3534bp, mã hoá cho protein với 1178 acid amin 1.6.2 Gen katG Gen katG có kích thước 2223bp với 741 codon mã hoá, nằm nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao, chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase – peroxidase (enzyme hoạt hoá isoniazid thành dạng hoạt động) 1.7 Nghiên cứu gen rpoB katG chủng vi khuẩn lao 1.7.1 Trên thế giới 1.7.1.1 Nghiên cứu gen rpoB với kháng rifampicin Nhiều nghiên cứu khu vực khác giới xác định phần lớn chế phân tử kháng rifampicin với khoảng 69 đột biến điểm thay đổi nucleotid, đột biến thêm đoạn, 16 đột biến mất đoạn và 38 đột biến thay thế nhiều nucleotid Trong đó, đột biến vị trí 531, 526 516 thường gặp và thường gắn liền với các chủng kháng đa thuốc Các kiểu đột biến thường gặp nhất là Ser531Leu, His526Tyr và Asp516Val 1.7.1.2 Nghiên cứu gen rpoB với kháng isoniazid Các nghiên cứu giới đã xác định 100 loại đột biến gen katG Trong đó, đột biến hay gặp vị trí 315, chủ yếu kiểu đột biến Ser315Thr, chiếm tới 30-95% chủng lao lâm sàng kháng isoniazid Vị trí đột biến này được coi là một dấu ấn quan trọng của đề kháng với isoniazid Tuy nhiên, nghiên cứu từ nhiều khu vực khác giới cho thấy rằng, tần xuất đột biến gen rpoB katG khác chủng phân lập từ vùng địa lý khác 1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Tại Việt Nam, có nghiên cứu xác định đột biến xảy gen rpoB katG chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin isoniazid Các nghiên cứu nước sử dụng kỹ thuật phân tử khác để xác định đột biến kháng thuốc Các nghiên cứu phân tử gen rpoB katG chủng vi khuẩn lao kháng thuốc tập trung vùng miền định mà chưa bao phủ toàn quốc, nghiên cứu thường đánh giá kỹ thuật chẩn đoán áp dụng thiết kế thử nghiệm kỹ thuật áp dụng chủng lao phân lập địa điểm Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lao được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện: Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - thành phố Hồ Chí Minh thời gian 2008-2009 - 143 chủng vi khuẩn lao giải trình tự phát hiện đột biến gen rpoB và katG , đó: 30 chủng nhạy cảm với các thuốc chống lao; 54 chủng có kiểu hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn với rifampicin 51 chủng MDR); 59 chủng có kiểu hình kháng với isoniazid (13 chủng kháng đơn với isoniazid 46 chủng MDR) 2.2 Địa điểm nghiên cứu Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - TP Hồ Chí Minh, Học viện quân Y, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Công nghệ sinh học 2.3 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu: Các sinh phẩm, hóa chất dùng tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng giải trình tự gen 2.3.2 Thiết bị: tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng giải trình tự gen 2.3.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng PCR có trình tự tương ứng sau: Sản phẩm Gen đích Mồi Trình tự PCR (bp) rpoB-F 5’-ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT-3’ rpoB_seq 528 rpoB5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT-3’ R katG_seq katG-F 5’ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG 3’ 684 katG-R 5’ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT 3’ 2.3.4 Phần mềm: Phân tích kết quả giải trì nh tự bằng phần mềm BioEdit 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu phương pháp mô tả cắt ngang phương pháp thực nghiệm labo có đối chứng 2.4.2 Phương pháp thu thập số liệu - Các số liệu tính kháng thuốc thu thập làm kháng sinh đồ bổ sung Bệnh viện Phổi Trung Ương Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch -TP Hồ Chí Minh - Kỹ thuật tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lao được thực hiện tại Học viện quân Y - Thực hiện kỹ thuật giải trình tự phân tích đặc điểm phân tử gen rpoB tiến hành Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, gen katG tại Viện công nghệ sinh học 10 Sơ đồ nghiên cứu 2.5 Kỹ thuật xét nghiệm 2.5.1 Kỹ thuật kháng sinh đồ phát vi khuẩn lao kháng thuốc Được thực Bệnh viện Phổi Trung Ương Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh theo quy trình thống Chương trình chống lao Quốc gia 2.5.2 Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn nghiên cứu 2.5.3 Kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA * Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB và katG: Khuếch đại DNA gen rpoB (sản phẩm PCR có chiều dài 528 bp, chứa vùng RRDR gen rpoB) và khuếch đại DNA gen katG (sản phẩm PCR có chiều dài 684 bp, chứa vị trí codon 315 gen katG) với cặp mồi đặc hiệu 2.5.4 Tách dòng gen rpoB katG phục vụ cho giải trình tự Sản phẩm PCR sau tinh đưa vào plasmid vector tách dòng plasmid pGEM®-T pBT, sau biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Sản phẩm biến nạp sau được cấy trải môi trường LB Agar có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicilin, chọn khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc vi khuẩn 13 RRDR gen rpoB Đột biến vùng RRDR ở chủng kháng đa thuốc 94,1% - Các vị trí đột biến liên quan kháng rifampicin gen rpoB (n=54): Các vị trí đột biến thường gặp 531 (50%), 526 (29,63%), 516 (9,26%) Các vị trí đột biến mới phát hiện: 530 và mất đoạn từ codon 511-515 Mất đoạn 511-515 TGAGCCAATTCA GTC Val TTG Leu CTC Leu ATG TTG Met Leu 23 TAC Tyr GAC Asp TGG Trp TTC Phe CGC CAG Arg Gln CCG Pro AGC Ser ACC Thr Hình 3.2 Số lượng kiểu đột biến vùng RRDR Có 15 kiểu đột biến vị trí riêng biệt Tại codon 531, kiểu đột biến TCG → TTG (Ser → Leu) chiếm ưu thế; codon 526 có đa 14 dạng kiểu đột biến (6 kiểu); gặp kiểu đột biến GAC → GTC (Asp → Val) codon 516 - Các kiểu kết hợp vị trí đột biến xảy đoạn gen rpoB (n=54): Trong số 54 chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin; tỷ lệ chủng mang 1, 2, vị trí đột biến 72,2%; 16,7%; 5,6%; chủng đoạn codon 511-515 Các đột biến đơn thường xuất vùng RRDR của gen rpoB, với chủng có kết hợp nhiều vị trí đột biến xuất đột biến vùng RRDR của gen rpoB 3.1.3 Đặc điểm phân tử gen katG Bảng 3.11 Kết giải trình tự đoạn 684bp gen katG Chủng vi khuẩn lao Xác định đột biến Đặc tính Số lượng Đột biến Không đột chủng biến Nhạy thuốc 10 10 Kháng H 59 48 (81,4%) 11 (18,6%) Tổng số 69 48 21 Trong 59 chủng kháng isoniazid; 48 81,4% chủng đột biến gen katG; 18,6% chủng có kiểu hình kháng isoniazid không phát đột biến đoạn 684bp gen katG Bảng 3.12 Tỷ lệ đột biến chủng kháng đơn với isoniazid Đột biến Không đột biến Tổng số và kháng đa thuốc Kháng đơn H Kháng đa thuốc N tỷ lệ % n tỷ lệ % 46,2 42 91,3 53,8 8,7 13 100 46 100 Tổng số 48 11 59 Tần suất xuất đột biến gen katG chủng kháng đa thuốc cao có ý nghĩa thống kê so với chủng kháng đơn với isoniazid (p