PHÂN LẬP CHẤT KHÁNG SINH CHỮA BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN. VÍ DỤ CỤ THỂ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CINEREORUBER SUBP. (HT28)

PHÂN LẬP CHẤT KHÁNG SINH CHỮA BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN. VÍ DỤ CỤ THỂ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CINEREORUBER SUBP. (HT28) Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin Hiện tượng kháng kháng sinh xuất hiện Công nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh Xạ khuẩn có tiềm năng lớn nên được lựa chọn phân lập kháng sinh

PHÂN LẬP CHẤT KHÁNG SINH CHỮA BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN VÍ DỤ CỤ THỂ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CINEREORUBER SUBP (HT28) Trần Thị Đức Ý Trần Nguyễn Xuân Trinh Võ Thị Phương An Võ Thị Phương Thảo Nguyễn Mai Yến ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1928, Alexander Fleming phát penicillin Hiện tượng kháng kháng sinh xuất Công nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh Xạ khuẩn có tiềm lớn nên lựa chọn phân lập kháng sinh ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên  Xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes, lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae chi Streptomyces chiếm phần lớn  Phân bố: nước, chất hữu có sẵn, chất, nhiều đất - Đất giàu hữu cơ, khoáng, bề mặt nhiều mùn - 25-280C - Độ ẩm: 40-55% - pH: 6,8-7,5  60-70% xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả hình thành chất kháng sinh ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN đặc điểm hình thái xạ khuẩn Khuẩn ty - Rất phát triển giống hệ sợi nấm - Đường kính khoảng 0,21,0 μm đến 2-3 μm - Phân nhánh, khơng có vách ngăn không bị đứt đoạn - Màu sắc: trắng, vàng, nâu, đỏ, lục, lam, tím ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN đặc điểm hình thái xạ khuẩn Khuẩn ty Khi nuôi cấy môi trường đặc, phát triển thành loại ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN đặc điểm hình thái xạ khuẩn Khuẩn lạc - Tập hợp nhóm xạ khuẩn riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc - Chắc, xù xì, dạng thơ ráp, phấn vơi; khơng suốt, nếp tỏa theo hình phóng xạ - Màu sắc: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng - Đường kính thay đổi, trung bình 0,5-2mm - Cấu tạo lớp: Lớp vỏ ngoài, lớp lớp ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN đặc điểm hình thái xạ khuẩn Cấu tạo xạ khuẩn Thành tế bào Màng nguyên sinh chất Tế bào chất Chất nhân hạt dự trữ THÀNH TẾ BÀO - Thành phần peptidoglycan tạo lớp vách vững chắc, bên ngồi có lớp vỏ nhày - Dày khoảng 10-20nm Gồm lớp: lớp ngoài, lớp giữa, lớp - Cho phép chất kháng sinh, axit amin, chất dinh dưỡng…đi qua cách dễ dàng MÀNG SINH CHẤT - Có độ dày 7-9nm - Cấu tạo lớp : photpholipid, protein nằm trong, ngồi hay xun qua màng THÍ NGHIỆM Môi trường nghiên cứu Môi trường Môi trường Môi Môi Gause MPA (g/l) trường A- trường A(g/l) (g/l) 4H (g/l) Tinh bột tan: 20 NaCl: 0,5 KNO3: MgSO4.7H2 O: 0,5 K2HPO4: 0,5 FeSO4: 0,01 Thạch: 20 Nước máy vừa đủ lít pH = 6,8 – Cao thịt: NaCl: Pepton: 10 Thạch: 20 Nước máy vừa đủ lít pH=7 Glucose: 10 Bột đâu tương: 10 NaCl: CaCO3: Nước máy vừa đủ lít pH=7 Glucose: 15 Bột đậu tương: 15 NaCl: CaCO3: Nước máy vừa đủ lít pH=7 Môi trường Gause (g/l) Cao thịt: Pepton: NaCl: Glucose: 10 Thạch: 20 Nước máy vừa đủ lít pH= 7-7,4 THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp giữ giống TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG KẾT QUẢ - Chủng HT28 Cấy sang ống - Xuất vòng Chủng HT28 ni ống để hoạt hóa vơ khuẩn lớn giữ thạch nghiêng giống hoạt tính tốt (Gause 1) - Sau 5-7 ngày nuôi cấy, kiểm tra ống giống, loại ống nhiễm - Bảo quản 350C - Trước sử dụng cấy sang ống THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp lên men xạ khuẩn kháng sinh TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG - Xạ khuẩn lên men môi trường (trừ MPA) - Sau 96 ni máy 220v/p, t0 phòng - Xác định hoạt tính kháng sinh pp đục lỗ thạch để chọn mt Đảm bảo chủng sinh trưởng tốt, hiệu suất kháng sinh cao KẾT QUẢ - Môi trường Môi trường lên Gause xuất men tốt vòng tròn Gause vơ khuẩn lớn THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh PHƯƠNG PHÁP KHỐI THẠCH PHƯƠNG PHÁP ĐỤC LỖ TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG KẾT QUẢ - Nuôi xạ khuẩn môi trường Gause 2, 5-7 ngày - Khi xạ khuẩn mọc tốt dùng khoan nút chai khoan thỏi thạch đặt vào đĩa petri cấy sẵn VSV kiểm định - Để 4-5 40C nuôi ấm 28-300C - Đọc kết 24 với XK, ngày với VSV kiểm định Sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh môi trường - Mỗi môi trường cho vòng tròn vơ khuẩn có kích thước khác Chọn mơi trường có kích thước vòng tròn vơ khuẩn lớn TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG KẾT QUẢ - Xa khuẩn nuôi Gause máy lắc 220v/p 28300C - Sau 120 li tâm 5000v/10p thu dịch kháng sinh thô - Dùng khoan nút chai khoan lỗ bề mặt thạch hộp petri, nhỏ vào lỗ 0,1 ml dịch cần thử - Tương tự pp khối thạch Thử hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn dung dịch - Mỗi dung dịch cho vòng tròn vơ khuẩn có kích thước khác Chọn mơi trường có kích thước vòng tròn vơ khuẩn lớn THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp chiết tách chất kháng sinh DMHC CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ SINH KHỐI CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH NGOẠI BÀO TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG - Sau lên men 5- Tách chất kháng - Dịch ethanol ngày, tách sinh từ sinh khối cho vòng tròn vơ riêng dịch ni khuẩn lớn cấy sinh khối - Sinh khối: tách DM khác tỉ lệ 1:1 (V/V) - HH DM:sinh khối lắc 30’ t0 phòng, li tâm loại sinh khối - Dung mơi chiết thử hoạt tính VSV kiểm định pp đục lỗ thạch KẾT QUẢ Chủng HT28 có chất kháng sinh sinh khối, tách nhiều DM ethanol TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG - Dịch lên men Tách chất kháng - Tại pH = 3, DM sau loại sinh từ dịch iso-butanol cho sinh khối ngoại bào vòng tròn vơ tách khuẩn lớn DMHC, tỉ lệ 1:1 (V/V) - Hh lắc 30’ t0 phòng, li tâm thu dịch ngoại bào - Khảo sát chọn pH thích hợp để CKS thu cao - Thử hoạt tính DM chiết VSV kiểm định pp đục lỗ thạch KẾT QUẢ Chủng HT28 có chất kháng sinh dịch ngọai bào, tách nhiều DM isobutanol pH=3 THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định số tính chất CKS KHẢ NĂNG BỀN TRONG pH CỦA CKS KHẢ NĂNG BỀN VỚI NHIỆT ĐỘ CỦA CKS TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG - Sau lên men 5- - Thử khả - Vòng tròn vơ ngày, li tâm bền pH khuẩn thu dịch lên chất khoảng pH từ 3-9 men kháng sinh khơng - Chỉnh pH từ 3- - Chủng có thay đổi NaOH khoảng bền 0,5M pH cao thuận CH3COOH lợi cong nghệ thu hồi, 0,4M 10’ tinh chế, mở t0 phòng rộng khả - Chỉnh dịch lên ứng dụng men mức pH HT28 pH=7 - Tiến hành thử hoạt tính pp đục lỗ thạch KẾT QUẢ Chất kháng sinh có khả bền vững pH TIẾN HÀNH MỤC ĐÍCH HIỆN TƯỢNG KẾT QUẢ - Dịch ni cấy - Thử khả - 400C, 20’ đầu - Chất kháng đem lọc, đun bền với nhiệt hoạt tính sinh cách thủy độ CKS không đổi bền với nhiệt 400C, 600C, - Phục vụ cho - Tăng nhiệt độ - Nên chiết tách 800C, 1000C cơng nghệ hoạt tính giảm bảo quản kéo dài 20, 40, tách chiết nhiệt độ không 60 phút tinh chế CKS 500C - Để nguội có hiệu - Xác định hoạt cao tính kháng sinh pp đục lỗ thạch THÍ NGHIỆM Các phương pháp nghiên cứu Phương pháp xử lí số liệu Kết nghiên cứu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm excel lập trình sẵn KẾT LUẬN - Ngày chất kháng sinh phân lập từ xạ khuẩn tìm thấy nhiều - Mỗi lồi xạ khuẩn có khác cách lựa chọn phương pháp nghiên cứu nhìn chung theo quy trình định ... Hiện tượng kháng kháng sinh xuất Công nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh Xạ khuẩn có tiềm lớn nên lựa chọn phân lập kháng sinh ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự... màng sinh chất - Ức chế trình sinh tổng hợp protein - Ức chế tổng hợp axit nucleic - Ức chế trao đổi chất ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Kháng sinh có nguồn. .. loại xạ khuẩn - Hình dạng bào tử tương đối ổn định ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xa khuẩn Đặc tính chung chất kháng sinh