LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN

LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN CÁCH LỰA CHỌN DUNG MÔI I. Dung môi chiết tách Do cấu tạo hóa học cả cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ. Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước. Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên). Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA -  - Bài tiểu luận:LỰA CHỌN DUNG MƠI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN Sinh viên thực hiện: CÁCH LỰA CHỌN DUNG MƠI I Dung mơi chiết tách Do cấu tạo hóa học cỏ sinh khối thường chất liệu đại phân tử tương đối trơ, khơng hòa tan dung mơi hữu cơ, việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa chiết lấy khảo sát chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ Thơng thường người ta muốn nghiên cứu hợp chất tự nhiên có tính dầu có mức độ phân cực khác nhau, nhiên, nghiên cứu hợp chất tự nhiên có tính nước Điều thực cách chiết hợp chất có dung mơi có tính phân cực tăng dần chiết lần lấy tất loại hợp chất cách sử dụng dung mơi vạn methanol (có thể chiết hầu hết loại hợp chất tự nhiên) Nguyên tắc tổng quát lựa chọn dung mơi quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất khỏi mẫu cây, điều tùy thuộc vào đặc tính chất biến dưỡng thứ cấp có mà người khảo sát mong muốn tách cô lập (một vài hợp chất glycoside bền với nhiệt độ nhạy với pH môi trường…) Vì hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên khơng thể có quy trình tổng qt áp dụng chung cho tất nhóm, trước tiến hành thực nghiệm cần phải thu thập đầy đủ tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp chọn quy trình thích hợp Muốn chiết hợp chất khỏi cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp cách ngâm dầm, máy chiết Soxhlet… Sau chiết, phần bã sinh khối lại lọc bỏ, dung môi qua lọc thu hồi máy cô quay chân khơng nhiệt độ thấp khoảng 30-40 oC thực nhiệt độ cao làm hư hại vài hợp chất bền nhiệt Cần ý quan sát q trình quay có tủa, lọc lấy tủa Nếu tủa tan nước muối vơ (vì sử dụng ethanol để chiết bột cây, ethanol hòa tan ln loại muối vơ có cây), tủa không tan nước tan dung môi hữu hợp chất hữu cơ, tinh chế, thu hợp chất tinh khiết Đây vài trường hợp đặc biệt hợp chất có hàm lượng cao Nhắc hợp chất cho kết tủa q trình quay dung dịch dung dịch nước chứa nhiều hợp chất Thu hồi dung mơi cho cao chiết thơ, cao dạng khô, dạng dẻo sệt dạng dầu sệt tùy thuộc vào tính chất cấu tử có cao Cao cần loại bỏ hết dung mơi sót lại để tránh phản ứng phụ có Thực hành cách cân lọ chứa cao, lọ đun cách thủy khoảng thời gian, sau cân lại, hai lần cân thấy lọ có trọng lượng st sốt dung mơi đuổi hết khỏi cao Không nên tồn trữ hợp chất dung mơi hữu vài loại hợp chất có thay đổi khơng mong muốn cấu trúc hóa học 1 Lựa chọn dung mơi để chiết tách Chọn dung mơi phải có tính trung tính , khơng độc, khơng q dễ cháy, hòa tan hợp chất khảo sát, sau chiết tách xong dung mơi loại bỏ dễ dàng Cần tránh dung môi độc benzene dễ cháy có nhiệt độ sơi thấp dietyl eter, cacbon tetraclorur,… Các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo tham số Snyder lực dung môi Tên dung môi Pentan Cyclohexane Carbon tetraclorur Toluenee Dietyl eter Chloroform Diclorometan Tetrahydrofuran 2-Butanon Aceton 1,4-Dioxan Etyl acetat Dietylamin Acetonitrile 2-Propanol Ethanol Methanol Nước Eo (Al2O3) 0,04 0,18 0,29 0,38 0,40 0,42 0,45 0,51 0,56 0,56 0,58 0,63 0,65 0,82 0,88 0,95 1,00 Nhiệt độ sôi (oC) 36 69 77 111 35 62 40 66 80 56 107 77 115 82 82 78 64 100 Độ nhớt (mN.S.m-2) 0,24 0,98 0,97 0,59 0,25 0,57 0,44 0,55 0,32 0,32 1,44 0,45 0,33 0,37 2,50 1,20 0,59 1,0 Bước sóng hấp thu UV (nm) 210 210 265 286 218 245 235 220 330 330 215 255 275 190 210 210 210 - Các dung mơi có độ phân cực tăng dần tùy theo số điện môi độ nhớt Tên dung môi Chỉ số phân cực Chỉ số chiết suất (20oC) Nhiệt độ sôi (oC) Pentan Hexane Heptan Cyclohexane CCl4 Toluene 0,0 0,0 0,0 0,2 1,6 2,4 1,358 1,375 1,357 1,426 1,466 1,496 36 69 98 81 77 111 Hằng Độ nhớt số điện (mN.S.m-2) môi ε (25oC) 1,90 2,0 2,2 2,38 0,23 0,33 0,39 1,00 0,97 0,59 Bước sóng hấp thu UV 200 200 200 200 263 285 Độ tan nước (% w/w) 0,004 0,001 0,0003 0,01 0,08 0,51 Xylen 2,5 1,500 139 0,61 290 0,018 Benzene 2,7 1,501 80 2,3 0,65 280 0,18 Dietyl eter 2,8 1,353 35 4,34 0,32 220 6,89 Diclorometan 3,1 1,424 41 8,9 0,44 235 1,6 Isopropanol 3,9 1,377 82 18,3 2,30 210 100 n-Butanol 3,9 1,399 118 2,98 215 7,81 Tetrahydrofuran 4,0 1,407 65 7,58 0,55 215 100 n-Propanol 4,0 1,384 92 20,1 2,27 210 100 Butyl acetat 4,0 1,394 125 0,73 254 0,43 Chloroform 4,1 1,446 61 4,87 0,57 245 0,81 Etyl acetat 4,4 1,372 77 6,0 0,45 260 8,7 Metyl etyl ceton 4,7 1,379 80 0,45 329 24 Dioxan 4,8 1,422 101 2,2 1,54 215 100 Aceton 5,1 1,359 56 20,7 0,32 330 100 Methanol 5,1 1,329 65 33,6 0,6 205 100 Ethanol 5,2 1,360 78 24,3 1,2 210 100 Acetonitrile 5,8 1,344 82 37,5 0,37 190 100 Acid acetic 6,2 1,372 118 6,2 1,26 230 100 Dimetylformamid 6,4 1,431 155 0,92 368 100 Dimetylsulfoxid 7,2 1,478 189 4,7 2,00 268 100 Nước 9,0 1,333 100 78,5 1,0 200 100 Người ta thường sử dụng dung mơi khơng hòa tan nước hydrocacbon (hexane, toluene), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl), chloroform, clorur metylen Các loại dung mơi tương đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối khác so với nước Có thể xếp độ phân cực dung môi dựa vào E o, tham số Snyder lực dung môi Tham số dựa lượng hấp thu pha động dung môi pha tĩnh alumina Cũng xếp độ phân cực dung môi theo số điện môi, độ nhớt,… Một số điều cần biết sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất - Các dung môi cần chưng cất lại tồn trữ chai lọ thủy tinh dung môi thường hay chứa số tạp bẩn mà thường gặp chất dẻo hóa Các chất làm dẻo thường gặp dialkyl ptalat, tri-n-butyl acetyl citrate, trin-butyl phosphate,… chúng lẫn vào dung môi thường chứa thùng làm nhựa dẻo - Methanol chloroform thường chứa tạp chất di(2-etylhexyl) ptalat chất thường bị nhầm lẫn hợp chất tự nhiên có chứa cỏ khảo sát hợp chất có số hoạt tính sinh học Sở dĩ lập di(2-etylhexyl) ptalat trước sử dụng lượng lớn dung môi methanol, chloroform trình ngâm chiết cỏ ban đầu, sau dung dịch chiết đuổi dung môi khiến cho lượng chất làm dẻo diện cách đáng kể cao chiết - Chloroform, diclorometan tạo phản ứng với vài loại alkaloid brucin, strychnine, ephedrine,… để tạo thành alkaloid dạng muối thứ cấp vài hợp chất giả khác Tương tự vết HCl gây phân hủy, khử nước, đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu - Sử dụng methanol để chiết lập số hợp chất giả tạo Khi chiết nóng Trechonaetes laciniata với dung mơi methanol thay lập hợp chất trechonolyd A lập trechonolyd B (do trechonolyd A metyl hóa đun nóng methanol với diện vết acid) - Dietyl eter sử dụng để chiết có nhiệt độ sơi thấp dễ gây cháy, độc, gây mê cho người sử dụng có khuynh hướng tạo thành peroxide dễ gây nổ Peroxide hoạt tính, oxi hóa hợp chất có mang nhiều nối đơi liên hợp carotenoid Loại bỏ peroxide khỏi dietyl eter cách lắc với FeSO chưng cất lại - Aceton tạo dẫn xuất acetonid hợp chất chiết có chứa nhóm cis-1,2-diol diện mơi trường acid - Chiết dung môi điều chỉnh thành môi trường acid mơi trường kiềm chiết hợp chất đặc trưng: anthocyanin chiết khỏi nguyên liệu tươi ban đầu dung dịch methanol có chứa 1% acid clohidric Các alkaloid chiết dung dịch acid kiềm Chiết môi trường acid kiềm thủy giải hợp chất glycoside (môi trường acid cắt đứt glycoside nối acetal làm phần đường) cắt đứt nối ester (môi trường kiềm)hoặc tạora chuyển vị - Sau chiết, dung môi thu hồi máy cô chân không nhiệt độ 3040oC, chưng cất nhiệt độ cao làm hư hại số hợp chất bền nhiệt Lựa chọn quy trình để chiết tách hợp chất khỏi mẫu a Chiết hợp chất hữu trọng lượng phân tử nhỏ, có tính thân dầu - Trong hướng tổng hợp, sau thực phản ứng xong, dù có qua số bước xử lý, sản phẩm thu hỗn hợp, thường gặp hỗn hợp có ba hợp chất, phải sử dụng phương pháp sắc ký khác để tách riêng hợp chất Quad trình theo dõi sản phẩm thu từ việc sắc ký tương đối dễ dàng dự đốn cấu trúc hóa học hợp chất - Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc lập chất phức tạp khơng biết khảo sát có chứa hợp chất với cấu trúc hóa học Biết cỏ cần khảo sát dung dịch lên men vi sinh, có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại khơng phân cực đến loại phân cực, muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp lên cao thô ban đầu khó đạt kết mong muốn Vì người ta thường chuẩn bị loạt loại cao chiết có tính phân cực tăng dần, loại cao chiết chứa tương đối hợp chất, giúp cho q trình lập hợp chất tinh chất dễ dàng Nhìn chung lập hợp chất tinh chất để xác định cấu trúc hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học nhiều thời gian Muốn có loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa nguyên tắc chung “ chất giống hòa tan nhau”: dung mơi khơng phân cực hòa tan tốt hợp chất khơng phân cực, dung mơi có tính phân cực trung bình hòa tan tốt hợp chất có tính phân cực trung bình dung mơi phân cực mạnh hòa tan tốt hợp chất phân cực Dung môi thông dụng Sử dụng Khả hòa tan Nhóm chức hóa học thường gặp phòng thí nghiệm hợp chất hữu Dung Eter dầu hỏa AlcanNhóm mơi HexaneeAlcen, alcinchức có BenzeneHợp chất thơm có tính TolueneEtertính phân Diclorometan Aldehyd, cetonphân cực Chloroform Ester, amid cực tăng Etyl acetat Hydroxy, amintăng dần EthanolAcid carboxylycdần Methanol Butanol Nước Minh họa khái qt việc dung mơi có độ phân cực khác hòa tan nhiệt độ phòng hợp chất có độ phân cực tương ứng (chỉ phù hợp với hợp chất đơn chức) * Nhận xét : + Nếu dung môi gia nhiệt khả hòa tan tăng thêm hòa tan hợp chất có độ phân cực mạnh + Hình minh họa khả hòa tan dung mơi nhóm chức hóa học Trong đó, hợp chất thiên nhiên thường có hai hay nhiều nhóm chức hóa học có tính phân cực khác biệt nhau, gây khó khăn việc lựa chọn dung mơi thích hợp để hòa tan chất cần khảo sát + Dung mơi khơng có tính chọn lọc cao + Q trình sử dụng dung mơi để hòa tan hợp chất, chiết lấy chất trình áp dụng phương pháp chiết rắn – lỏng với nhiều kỹ thuật thực nghiệm khác : từ nguyên liệu cỏ dung dịch lên men vi sinh vật, có nhiều kỹ thuật để có loại cao chiết khác Sơ đồ 1: Sơ đồ tổng quát điều chế loại cao có độ phân cực khác từ nguyên liệu ban đầu, với mục đích lập hợp chất có tính dầu Bột - Chiết kiệt với eter dầu hỏa - Lọc, thu hồi dung mơi Cao eter dầu hỏa Bột lại - Chiết kiệt với chloroform - Lọc, thu hồi dung môi Cao chloroform - Chiết kiệt với etyl acetat Bột lại - Lọc, thu hồi dung mơi Cao etyl acetat - Lọc, thu hồi dung môi -Chiết với nước dung mơi - Chiết Bột kiệtcây vớicòn methanol lại Cao methanol Bột lại thu hồi - Lọc, dung môi Đầu tiên bột chiết kiệt với eter dầu hỏa Dung dịch chiết gộp chung lại, thu hồi dung mơi có cao eter dầu hỏa chứa loại hợp chất có bỏ tính khơng phân cực Bột lại chiết tiếp Cao với nước chloroform,Bột thucòn hồilạidung mơi, thu cao chloroform chứa loại hợp chất có tính phân cực trung bình Tiếp theo, bột chiết với etyl acetat thu cao etyl acetat chứa loại hợp chất có tính phân cực Cuối bột chiết với methanol butanol thu cao methanol (hoặc butanol) chứa loại hợp chất có tính phân cực mạnh - Trong cao eter dầu hỏa cao hexane, cao dietyl eter : có hydrocacbon béo thơm, thành phần tinh dầu, sterol thực vật, chất màu thực vật caroten,… - Trong cao chloroform cao etyl acetat : có sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, aglycon hợp chất glycoside bị thủy giải, monoglycosid, số alkaloid loại base yếu - Trong cao methanol cao nước : có chất màu thực vật clorophyl, glycosid, alkaloid dạng muối tứ cấp, kết hợp với acid hữu cơ, acid hữu cơ, muối amin, tanin, hydrat cacbon có trọng lượng phân tử nhỏ monosacarid, olygosacarid, số polysacarid pectin, chất nhầy, chất gôm,…, protein thực vật, muối vô NaCl, KCl, CaCl2… Trong loại hợp chất thiên nhiên nào, thí dụ alkaloid, steroid, flavonoid, … có hợp chất có tính phân cực loại hợp chất có tính phân cực mạnh tùy vào việc hợp chất có mang nhiều nhóm có tính phân cực khơng phân cực - Sơ đồ quy trình điều chế loại cao có độ phân cực khác Trong thực tế, phòng thí nghiệm có kinh phí hạn chế, muốn nghiên cứu thành phần hóa học hợp chất có cây, người ta thường sử dụng dung môi vạn ethanol methanol để chiết kiệt hết hợp chất có bột Sau đuổi dung môi, thu cao alcol thô Từ cao ethanol thô chứa tất loại hợp chất hữu có cây, sử dụng kỹ thuật chiết rắn – lỏng chiết lỏng – lỏng với loại dung môi có tính phân cực khác để điều chế loại cao có độ phân cực khác Nếu chủ đích muốn nghiên cứu chất béo tốt nên sử dụng eter dầu hỏa hexane b Chiết hợp chất hữu trọng lượng phân tử nhỏ, có tính nước Khảo sát kết công bố Chemical Abstracts việc cô lập hợp chất hữu tự nhiên cho thấy có khoảng 95% hợp chất loại hợp chất có tính thân dầu Việc cho thấy thiên nhiên số lượng hợp chất có tính thân dầu nhiều hợp chất có tính nước điều cho thấy việc cô lập hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ, có tính nước khó khăn nhiều Sơ đồ : Sơ đồ tổng quát cô lập hợp chất có tính thân nước – trọng lượng phân tử nhỏ (tươi đông lạnh nitơ lỏng) Phẩm vật sinh học chân không -Chiết kiệt với nước dung dịch đệm hoặcMeOH - Lọc, thu hồi dung môi chân không đông cô chân không Dung dịch đậm đặc Siêu lọc sắc ký gel Phân đoạn chứa hợp chất có trọng lượng phânPhân tử nhỏ đoạn chứa hợp chất đại phân tử - Loại muối (nếu chiết dung dịch đệm) - Chiết pha rắn (nhựa XAD, C18, polyamid,…) - Hoặc chiết với dung môi phân cực (butanol, alcol amyl,…) Hợp chất có tính phân cực trung bình Sắc ký với môi trường phân cực (Sephadex LH-20,…) Trong phòng thí nghiệm, muốn chiết hợp chất có tính nước, người ta nghĩ dung môi phù hợp để chiết hợp chất khỏi nguyên liệu ban đầu nước điều theo nguyên tắc “các chất giống hoà tan nhau” Tuy nhiên, thực tế nhiều trường hợp sử dụng dung môi nước để chiết phẩm vật sinh học tươi phương pháp ngâm dầm thất bại, chiết hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ - có tính nước khỏi ngun liệu thực vật, chiết với nước phương pháp giống với cách dân gian nấu cỏ để có nước thuốc sắc, uống để chữa bệnh - Một số khó khăn chiết dung mơi nước: + Nước có nhiệt độ sơi cao, áp suất lại nhỏ nên sau chiết, khó đuổi nước khỏi dung dịch chiết Muốn đuổi nước mà bảo đảm chất lượng sản phẩm tốt nên sử dụng kỹ thuật đông cô chân không + Nước chiết hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ - có tính nước hợp chất diện cỏ trạng thái bảo vệ Sự bảo vệ đa dạng: hợp chất bám dính vào màng tế bào, trữ bên tế bào thực vật, che chắn bên ngồi ngun vật liệu có tính dầu,… Có thể khắc phục khó khăn nêu cách sử dụng riêng lẻ kết hợp kỹ thuật sau: sử dụng chậu siêu âm, đun nóng, đơng khô chân không, cho tiêu hủy enzyme Điều khơng xảy chiết hợp chất có tính thân dầu dung mơi hữu có khả phá hủy màng tế bào thực vật + Dung dịch nước chiết môi trường tốt cho phát triển vi sinh vật: sau thời gian tồn trữ dung dịch nước bị lên mốc Muốn tránh điều phải giữ dung dịch chiết phòng lạnh cho thêm hoạt chất kháng nấm mốc vào dung dịch +Sự chiết nước chiết số enzyme peptidase, glycosidase, sulfatase, oxydase,… Q trình chiết nước làm hoạt hóa enzyme hợp chất cần khảo sát lại nhạy cảm với loại enzyme enzyme phát huy tác dụng làm cắt đứt nối, hệ sản phẩm thu nhận khơng giống ngun thủy Trong phòng thí nghiệm, muốn chiết hợp chất có tính nước, người ta thường chọn số dung mơi hữu có tính phân cực ethanol, methanol hỗn hợp methanol – nước ethanol – nước,… dung mơi khơng phải dung mơi tối ưu để hòa tan hợp chất mong muốn chiết Các dung môi lựa chọn chúng dễ chưng cất thu hồi so với nước Trong đa số trường hợp, muốn chiết (hoặc tách cao chiết thô thành phân đoạn khác nhau) hợp chất hữu trọng lượng phân tử nhỏ - có tính nước người ta thường sử dụng dung dịch đệm Tuy vậy, việc sử dụng dung dịch đệm có nhược điểm sau: + Muốn chiết tốt chất cần khảo sát, phải tìm cho khoảng pH nồng độ thích hợp dung dịch đệm + Việc đuổi dung dịch đệm khỏi dung dịch để thu cao chiết khơ gặp nhiều khó khăn Để khắc phục việc này, sử dụng số loại dung dịch đệm có khả bay hơi, loại kỹ thuật đông cô chân không nhờ máy cô quay chân không, dễ dàng mà cần phải rửa nhiều lần với nước để loại hoàn toàn chất dung dịch đệm Một số dung dịch đệm có khả bay Dung dịch đệm Amonium bicarbonate Amonium acetat Pyridin : acid acetic (16,1 : 278,5) pH 5,0 – 7,0 7,0 – 8,0 3,1 Pyridin : acid acetic (161,2 : 143,2) 5,0 8,0 Pyridin : acid acetic : α-picolin (11,8 : 0,1 : 28,2) Pyridin : acid acetic : 2,4,5-collydine (10 : 0,4 : 10) 8,3 Pyridin : acid acetic : N-ethylmorpholine (7,5 : 0,1-0,5 : 12,5) 9,3 II Dung môi phân lập Sơ lược sắc ký Sắc ký trình tách cấu tử hỗn hợp dựa vào việc cấu tử phân bố khác pha tĩnh pha động Pha tĩnh cột nhồi (sắc ký cột), mà pha động dung môi hữu di chuyển ngang qua, pha tĩnh lớp mỏng (sắc ký mỏng) chất hấp phụ tráng lên phẳng vật liệu thủy tinh, nhơm, lúc pha động hút thấm lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn Trong sắc ký phân bố pha tĩnh lớp chất lỏng thật mỏng hấp thụ lên bề mặt chất mang rắn, trơ, pha động chất lỏng (sắc ký phân bố lỏnglỏng) chất khí (sắc ký khí) Trong hai trường hợp, tách tùy thuộc nhiều vào phân bố dung dịch chất hai pha Trên thực tế, q trình phức tạp có tác động qua lại việc cấu tử hấp thụ lên chất mang việc tách cấu tử suốt trình sắc ký Trong sắc ký hấp phụ pha động thường chất lỏng pha rắn chất hấp phụ rắn, nhuyễn; việc tách dựa vào hấp phụ có chọn lọc số hợp chất hỗn hợp lên bề mặt chất rắn (sắc ký rắn-lỏng: dùng resin trao đổi ion để tách hợp chất có tính axit bazo aminoaxit aminophenol) Ngồi có sắc ký lọc gel, việc tách hợp chất dựa vào khác biệt kích thước hợp chất Trong kỹ thuật này, pha tĩnh hạt gel có dạng hình cầu, có lỗ rỗng với kích thước quy định (nhà sản xuất có đủ cỡ để lựa chọn cho phù hợp với chất cần tách) Các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ chui vào lỗ rỗng hạt gel giữ lại hạt gel, nghĩa giữ lại cột; hợp chất có khối lượng phân tử lớn nên chui vào lỗ rỗng hạt gel bị đuôỉ khỏi cột sắc ký trước tiên Kỹ thuật áp dụng cho hợp chất có khối lượng phân tử lớn protein, peptit, enzym, hormon, Sắc ký cột Sắc ký cột phương pháp đại, tinh vi để tách cấu tử hóa học khỏi hỗn hợp chúng Nếu lựa chọn điều kiện, người ta tách hầu hết chất hỗn hợp * Lựa chọn dung môi giải ly Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu chất sắc ký Nếu mẫu chất dạng dung dịch, thí dụ dung dịch trích ly từ cỏ, phải làm bay dung dịch đến khơ áp suất thấp hòa tan mẫu chất trở lại với lượng tối thiểu dung mơi loại phân cực Dung dịch đậm đặc tạo thành dãy băng sắc mỏng cột giúp trình tách ly hiệu Thông thường, dùng dung môi phân cực tan mẫu chọn làm dung môi để nạp chất hấp phụ vào cột dĩ nhiên dung môi q trình giải ly Thử nghiệm chọn dung mơi giải ly thích hợp: với mẫu chất chưa có tài liệu tham khảo, phải lựa chọn chất hấp phụ dung môi giải ly Muốn vậy, phải nhờ kỹ thuật sắc ký mỏng với alumin silycagel, khơng tách tốt phải tìm loại chất hấp phụ khác Thiết lập loạt thử nghiệm với bình triển khai sắc ký mỏng bình chứa dung mơi với độ phân cực tăng dần: hexane, benzene, chloroform, ete etylyc, etyl acetat, aceton, methanol Các bảng mỏng có chấm mẫu chất nhúng vào bình chứa dung môi khác chuẩn bị Ghi nhận độ di động cấu tử mẫu: Nếu dung môi khiến cho tất cấu tử nằm lại chỗ mức xuất phát di chuyển hết lên mức tiền tuyến dung mơi dung mơi khơng phù hợp Nếu qua q trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung môi vừa làm nêu không cho vết gọn, rõ, sắc nét cần triển khai hệ thống gồm hỗn hợp dung mơi, thí dụ hỗn hợp toluenee-methanol, hexaneetyl axetat,… Cần hiểu kết phân tích sắc ký mỏng tốt, đẹp sắc ký cột Toluenee loại dung mơi có độ phân cực trung bình áp dụng để tách nhiều loại hợp chất hữu khác Nếu mẫu nguyên liệu hydrocacbon nên dùng hexane, ete dầu hỏa, benzene, toluenee Các hỗn hợp ete dầu hỏa-toluene, hexane-toluene, ete dầu hỏa-ete etylyc, hexane-ete etylyc,… có độ phân cực trung bình thường thích hợp để tách nhiều loại hợp chất thông dụng khác Các mẫu nguyên liệu có tính phân cực nên dùng etyl acetat, aceton, methanol, ethanol Dung môi dùng để giải ly phải dung môi tinh khiết, không tinh khiết phải chưng cất lại trước sử dụng, đặc biệt dung môi hydrocacbon loại dễ cho nhiều cặn loại dung môi khác Các dung môi thường dùng để sắc ký cột trình bày theo thứ tự tăng dần độ phân cực mà khả dung môi có nhóm chức phân cực sau: Ete dầu hỏa, hexane, xiclohexane, cacbon tetraclorua, benzene, toluene, điclometan, chloroform, ete etylyc, etyl acetat, aceton, priding, propanol, ethanol, nước, axit acetic Thông thường, nên bắt đầu dung môi không phân cực để loại cách tương đối hợp chất không phân cực khỏi cột kế dung mơi giải ly tăng dần độ phân cực để đuổi hợp chất có tính phân cực hơn, phải thay đổi từ từ cách cho thêm vào lần vài phần trăm lượng dung mơi có tính phân cực vào dung mơi giải ly Thí dụ giải ly với hexane, sau muốn đổi sang toluene phải thêm từ từ theo tỉ lệ 99:1 (nghĩa 99 ml hexane ml toluenee); 98:2; 95:5; 90:10; 70:30; 50:50; 10:90; 0:100 Nếu cho thêm vào vội vã, đột ngột làm gãy cột alumin hay silycagel trộn với dung môi tạo nhiệt, nhiệt khiến cho dung môi bốc cách cục bộ, nơi sinh tạo bọt khí làm nứt gãy cột, cột gãy khả tách cột Thông thường hợp chất không phân cực di chuyển nhanh giải ly khỏi cột trước; hợp chất phân cực di chuyển chậm hơn, lưu ý khối lượng phân tử có lyên quan đến thứ tự chất giải ly: hợp chất khơng phân cực có khối lượng phân tử lớn di chuyển chậm hợp chất khơng phân cực có khối lượng phân tử nhỏ Thứ tự tương đối hợp chất giải ly khỏi cột là: Loại chất giải ly Mức độ giải ly Thứ tự giải ly khỏi cột Ankan Giải ly sớm (với dung Anken, ankin môi không phân cực) Xicloankan, xicloanken Hydrocacbon thơm(aren) Xeton Anđehit Este Giải ly chậm (cần dung Ancol, thiol môi phân cực) Amin Phenol, axit cacboxylic Cần hiểu thêm dùng chất hấp phụ alumin hay silycagel, mơi trường có điều kiện acid kiềm với hoạt tính cao, dung mơi aceton cho phản ứng andol hóa để tạo thành ancol đixeton Còn dùng dung mơi etyl acetat có thêm ancol khác để làm dung mơi có hỗn hợp este trao đổi este Khi dùng dung mơi có dạng hoạt động cao piridin, methanol, nước, acid acetic,… chúng hòa tan giải ly số chất hấp phụ, … Sắc ký mỏng Sắc ký mỏng kỹ thuật cần sử dụng lượng nhỏ mẫu chất (10 -7 gram) để tách nhanh định tính hỗn hợp chất Giống sắc ký cột, sắc ký mỏng kỹ thuật phân bố rắn-lỏng, pha lỏng di động cho lên lớp mỏng chất hấp phụ, chất tráng phủ lên kính, bảng nhôm hay miếng plastic Do chất hấp phụ tráng thành lớp mỏng nên có tên mỏng * Lựa chọn dung môi Chọn dung môi triển khai tùy thuộc vào mẫu cần tách ly Với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến loại phân cực Có cách để xác định nhanh dung mơi phù hợp với mẫu: - Chấm dung dịchmẫu thành nhiều chấm bằng, lên mỏng, vết chấm cách cm Dùng vi quản để đưa dung mơi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, vết mẫu giọt dung môi loại khác Sau chấm, dung mơi lan tỏa tạo thành vòng tròn Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa dung mơi Quan sát vòng tròn đồng tâm: dung mơi làm mẫu lan lúc với tiền tuyến dung mơi dung mơi q phân cực, dung mơi mà mẫu nằm chỗ không đủ phân cực - Hoặc để dễ quan sát nên thiết lập loạt thử nghiệm với bình triển khai sắc ký mỏng bình chứa dung môi với độ phân cực tăng dần: hexane, benzene, chloroform, ete etylyc, etyl acetat, aceton, methanol Chuẩn bị mỏng có chấm mẫu chất nhúng vào bình chuẩn bị Ghi nhận độ di động cấu tử mẫu: + Nếu dung môi khiến cho tất cấu tử nằm lại chỗ mức xuất phát dung mơi chưa đủ phân cực: dung môi không phù hợp + Nếu dung mơi làm cho tất cấu tử di chuyển hết lên mức tiền tuyến dung môi phân cực: dung môi không phù hợp + Nếu dung mơi làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác cách gọn, rõ, sắc nét vị trí vết nằm khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài sắc ký dung mơi phù hợp + Nếu qua trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung mơi cho vết gọn, rõ, sắc nét cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung mơi, thí dụ toluene-methanol hexane-etyl acetat… Dung mơi tách tốt sắc ký mỏng thích hợp cho sắc ký cột Sắc ký gel Sắc ký gel Mould D.L phát triển từ năm 1954 để tách hợp chất khơng mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử chúng Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng phủđầy dung môi dùng làm pha động Các loại gel Sephadex, loại gel có độ nối mạng cao G-10, G-15 trương nở nước dung môi hữu như: dimetylformamid (DMF), dimetylsulfoxid (DMSO), etylen glycol, methanol-nước,… nên gel thường sử dụng để tách hợp chất tự nhiên thuộc loại hợp chất tan nước carbohydrat, peptid nhỏ Tùy vào dung môi giải ly, sắc ký gel tách hợp chất theo hai kỹ thuật sắc ký khác nhau: + Khi giải ly cột đơn dung môi,gel Sephadex tách hợp chất kỹ thuật sắc ký gel qua hợp chất tách nhờ vào khác biệt trọng lượng phân tử + Khi giải ly cột gel với hỗn hợp dung môi, gel Sephadex tách hợp chất kỹ thuật sắc ký phân chia, qua hợp chất tách riêng tùy vào lực hợp chất hai pha lỏng cột Khi sử dụng hỗn hợp hai dung môi (tốt dung môi phân cực dung mơi có tính phân cực), gel Sephadex có lực mạnh với dung mơi có tính phân cực mạnh hơn, đưa đến hệ tạo thành hai pha: pha động lỏng pha tĩnh lỏng Các nghiên cứu cho thấy ngâm gel vào lượng thừa butanol bão hòa nước, gel hút dung mơi nước để trương nở đến mức độ Như thế, bên hạt gel nước bão hòa butanol bên ngồi hạt gel butanol bão hòa nước, sắc ký sắc ký phân chia, hợp chất phân bố với phân bố với nồng độ khác hai pha lỏng Bảng: Điều kiện thực nghiệm sắc ký phân chia áp dụng với gel Sephadex Hợp chất lập Loại gel Kích Hệ dụng môi giải ly (v.v) thước cột (cm) Các hormone peptid G-25 4,5×65 AcOH băng: pyridine: nước (55:15:30) Loại muối khỏi G-25 4,5×55 AcOH băng: pyridine: nước peptid (60:15:25) Các oxytocin G-25 2,2×115 n-Butanol: Benzen: pyridine: 1% AcOH (6:2:1:9) Các đường, đường G-25 5-10 ml n-Butanol: AcOH: nước (62:15:25) amin Các amino acid G-25 1,5×80 n-Butanol: AcOH: nước (4:1:1) Các hợp chất loại G-25 2,2×120 n-Butanol: n-propanol: AcOH 0,2N oxytocin (2:1:3) Các protein bị thủy G-25 2,0×120 n-Butanol: n-propanol: (AcOH 3% + giải phần pyridine 3%) (2:1:3) Các dipepetid G-50 1,5×100 Pyridine: nước (1:1) Các loại peptid G-75 3,5×40 Phenol: AcOH băng: nước (1:1:1) Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Máy HPLC thường sử dụng hỗn hợp dung mơi, có nghiên cứu sử dụng bốn loại dung môi, trường hợp này, cần có thêm thiết bị phụ trợ thích hợp có bán sẵn Tỉ lệ dung môi hỗn hợp điều khiển Máy bơm hút hai dung môi hai bình, đưa vào hộp phối trộn Có hai kiểu sử dụng pha động việc giải ly: giải ly đơn nồng độ (isocratic elution) giải ly nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution) *Giải ly đơn nồng độ:với pha động lựa chọn (một dung môi hỗn hợp hai dung môi với tỉ lệ xác định) sử dụng suốt trình sắc ký cột Muốn thay đổi qua loại pha động khác, phải ngưng q trình sắc ký, thay bình chứa dung mơi, cho pha động hoạt động trở lại *Giải ly nồng độ tăng dần tuyến tính: q trình sắc ký, tính phân cực pha động thiết kế để tăng dần lên từ từ đặn, tương tự sắc ký khí, nhiệt độ cột phân tích chỉnh tăng dần lên Trong sắc ký lỏng, tính phân cực pha động giữ vai trò quan trọng việc tách chất Việc điều chỉnh pha động để có tính phân cực tăng dần tuyến tính thực máy trộn dung môi, điều khiển hệ điều hành máy Dung mơi dùng cho HPLC nước, loại dung dịch đệm (pha nước), methanol, acetonitril hỗn hợp loại Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung mơi sử dụng phải suốt bước sóng mà đầu dò UV hoạt động để phát mẫu chất Tất dung mơi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC, khơng có lẫn bụi bẩn, trước gắn vào máy HPLC, dung môi phải khử không khí Có thể khử khí cách cho luồng khí helium xục mạnh vào bình với vận tốc 300 ml/phút vài phút, bong bóng khí helium đuổi bọt khơng khí khỏi bình Dung mơi bão hòa khí helium khơng làm ảnh hưởng đến q trình sắc ký Cũng khử khí cách đặt bình, mở nắp, vào bồn siêu âm cho máy hoạt động 5-10 phút Bảng: Một số dung mơi tính chất chúng Tên dung môi Nhiệt độ sôi (0C) 36 69 77 111 35 62 40 66 80 56 107 77 115 82 82 78 64 100 Độ nhớt (mN.S.m-2) 0,24 0,98 0,97 0,59 0,25 0,57 0,44 0,55 0,32 0,32 1,44 0,45 0,33 0,37 2,50 1,20 0,59 1,0 Bước sóng hấp thu UV (nm) 210 210 265 286 218 245 235 220 330 330 215 255 275 190 210 210 210 Pentan Cyclohexane Tetraclorur carbon Toluene Dietyl eter Chloroform Diclorometan Tetrahydrofuran 2-Butanon Aceton 1,4-Dioxan Etyl acetat Dietylamin Acetonitril 2-Propanol Ethanol Methanol Nước Sắc ký khí Cơ sở để tách sắc ký khí phân bố mẫu thử hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động khí thấm qua tồn bề mặt tĩnh Nếu pha tĩnh rắn gọi sắc ký khí-rắn Chất rắn nhồi cột thường silicagel, rây phân tử than hoạt tính Q trình chủ yếu hấp phụ Nếu pha tĩnh lỏng, ta có sắc ký khí-lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt chất rắn trơ, gọi chất mang, tạo nên lớp phim mỏng Cơ sở cho tách phân bố mẫu ngồi lớp phim mỏng Khí mang gọi khí vectơ Trong sắc ký khí, khí mang đóng vai trò pha động để vận chuyển thành phần mẫu phân tích xuyên ngang cột sắc ký đến phận phát tín hiệu Việc lựa chọn khí mang giữ vai trò quan trọng việc tách hỗn hợp mẫu chất phận ghi nhận tín hiệu hoạt động hiệu Khí mang phải có tính trơ: khơng tác dụng với nguyên liệu nhồi cột sắc ký với mẫu phân tích Khí mang hydrogen, helium giúp tách mẫu tốt loại khí có trọng lượng phân tử lớn hơn, thí dụ nitrogen, dioxide carbon, argon Bảng: Độ nhớt độ dẫn nhiệt số khí thường sử dụng làm khí mang Khí mang Trọng lượng Độ nhớt Độ dẫn nhiệt -1 phân tử (àp) (cal.s cm-2.0C-1.cm-1)ì10-6 CO2 44 189 42 Ar 40 269 44 O2 32 256 66 N2 28 219 64 He 228 369 H2 108 459 Metan 16 86 Ethanol 46 35 Các tạp chất khí mang khơng khí, nước, vết loại khí hydrocarbon tác dụng với mẫu chất, làm hư hại cột sắc ký, làm ảnh hưởng đến phận phát tín hiệu, Thí dụ, nước thường giữ lại cột lâu so với hợp chất khác giải ly khỏi cột thành mũi tròn bầu, thấp, làm ảnh hưởng đến mức zero đường Khí mang cung cấp bình khí áp suất cao, lên đến 3000 psi (20,7 MPa) Khí mang phải có độ tinh khiết 99,999% Khi mở bình, khí bay ra, ngang qua phận điều chỉnh lưu lượng, đồng hồ đo áp suất Cần nên cho khí mang ngang qua hệ thống phòng bị để loại bỏ tạp chất Hệ thống gồm chuỗi bình có chứa hạt rây phân tử 5Ǻ để giữ nước, than hoạt tính để giữ hydrocacbon, silicagel để giúp pha động không chứa oxygen Trong thực nghiệm, thường sử dụng khí mang nitrogen cho cột nhồi PLOT helium hydrogen cho cột vi quản WCOT Khí nitrogen thường sử dụng với cột nhồi, với tốc độ dòng khí 30-50 ml/phút III Dung môi kết tinh Kết cuối trình chiết xuất, phân lập tinh chế phải thu tinh thể nguyên chất, ngoại trừ hợp chất lỏng Các bước trình kết tinh bao gồm việc chọn dung mơi, hòa tan nóng lọc, để kết tinh lạnh, gạn tinh thể khỏi dung dịch mẹ làm khô tinh thể Trong bước việc chọn dung mơi thích hợp có tầm quan trọng định kết kết tinh Chọn dung môi để kết tinh theo quy tắc sau đây: + Một dung môi tốt để kết tinh hợp chất hòa tan nhiều hợp chất nhiệt độ sơi tan nhiệt độ thường Một dung môi sử dụng độ hòa tan nhiệt độ sơi phải gấp lần độ hòa tan nhiệt độ thường + Nếu khơng tìm dung mơi thích hợp áp dụng cách phối hợp dung mơi Trong hai dung mơi dung mơi có khả hòa tan nhiều hợp chất kết tinh nhiệt độ sơi dung mơi ngược lại, khơng hòa tan Hai dung mơi hỗn hợp phải thành dung dịch suốt, đồng + Thơng thường chất rắn dễ hòa tan dung mơi có cấu trúc hóa học tương tự Ví dụ: Các este dễ hòa tan cồn EtOAc Các hydrocacbon dễ tan benzene, ete dầu, hexane Các hợp chất có nhiều nhóm OH, glycozit dễ tan dung môi pha nước MeOH, EtOH hỗn hợp dung mơi có nước + Có thể tách tinh thể dễ dàng, dễ bay khỏi tinh thể làm khô hay rửa + Thơng thường chất dễ tan nước khó tan dung mơi hữu ngược lại + Dung mơi khơng tương tác hóa học với chất cần tinh chế nhiệt độ thường nhiệt độ sơi, khơng hay hòa tan chất phụ + Dung mơi kết tinh tốt phải có độ sôi tương đối cao Khoảng cách độ sôi với nhiệt độ thường xa có nhiều thời gian để hình thành tinh thể Nhưng khơng nên cao q khó bốc q trình kết tinh, đồng thời nhiệt độ cao gây phân hủy chất kết tinh Nói chung nhiệt độ sơi dung mơi vòng 600-800 thích hợp + Trên thực tế để kết tinh hợp chất tự nhiên, MeOH hỗn hợp MeOH với dung mơi khác (ví dụ: aceton, H 2O) sử dụng nhiều Vì cần chọn hệ dung mơi kết tinh trước hết nên thăm dò MeOH hỗn hợp MeOH với dung môi khác Việc chọn dung môi để phối hợp với MeOH tùy thuộc vào tính hòa tan hợp chất Ví dụ: để kết tinh Flavon ta phối hợp MeOH với H2O để làm dung môi kết tinh Vì Flavon tan nhiều MeOH tan H2O Để kết tinh saponin dùng hỗn hợp MeOH Aceton * Một số hệ dung môi kết tinh thường dùng: MeOH―H2O EtOAc EtOH―H2O Isopropyl ete MeOH Ete―EtOAc EtOH Aceton―EtOAc MeOH―EtOAc Benzen―EtOAc MeOH―AcetonHexane―EtOAc EtOH―Aceton Ete―Aceton ... chiết lập số hợp chất giả tạo Khi chiết nóng Trechonaetes laciniata với dung mơi methanol thay lập hợp chất trechonolyd A lập trechonolyd B (do trechonolyd A metyl hóa đun nóng methanol với diện... hết chất hỗn hợp * Lựa chọn dung mơi giải ly Lựa chọn dung mơi hòa tan mẫu chất sắc ký Nếu mẫu chất dạng dung dịch, thí dụ dung dịch trích ly từ cỏ, phải làm bay dung dịch đến khơ áp suất thấp... ethanol Dung môi dùng để giải ly phải dung môi tinh khiết, không tinh khiết phải chưng cất lại trước sử dụng, đặc biệt dung môi hydrocacbon loại dễ cho nhiều cặn loại dung môi khác Các dung môi