PHÂN LẬP CHẤT KHÁNG SINH CHỮA BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN. VÍ DỤ CỤ THỂ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CINEREORUBER SUBP. (HT28)

MỤC LỤC I) Đặt vấn đề 3 II) Đại cương về xạ khuẩn 4 III) Đại cương về chất kháng sinh 8 IV) Sơ lược quy trình phân lập chất kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces cinereoruber subp. 17 V) Kết luận 29 VI) Tài liệu tham khảo 29 I) Đặt vấn đề Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh hoàng đối với con người, chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin – chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941, penicillin mới chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên chất kháng sinh bắt đầu. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC - - BÀI BÁO CÁO PHÂN LẬP CHẤT KHÁNG SINH CHỮA BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN VÍ DỤ CỤ THỂ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CINEREORUBER SUBP (HT28) Lớp : 14CHD GVHD : Nhóm SV: - Đà Nẵng, 11/2017– MỤC LỤC BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC Họ tên Trần Thị Đức Ý Trần Nguyễn Xuân Trinh Võ Thị Phương An Võ Thị Phương Thảo Nguyễn Mai Yến Nhiệm vụ Tìm tài liệu, tổng hợp word Tìm tài liệu, powerpoint Tìm tài liệu, powerpoint Tìm tài liệu, powerpoint Tìm tài liệu, powerpoint Nhận xét: Trong trình làm việc, thành viên tích cực tìm tài liệu nộp với thời hạn giao Sau tìm tài liệu, nhóm họp bàn để tìm đề tài cuối Các thành viên nhóm tự tổng hợp kiến thức tìm hiểu nội dung phần phân cơng cho người tổng hợp word Sau hoàn thành word, nhóm đọc lại đưa ưu, khuyết điểm để chỉnh sửa tiếp tục hoàn thiện powerpoint I) Đặt vấn đề Từ xa xưa, bệnh nhiễm khuẩn nỗi kinh hồng người, điều thúc nhà khoa học giới phải tìm chất có khả phòng chống điều trị bệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, Alexander Fleming phát penicillin – chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium phải 10 năm sau, năm 1941, penicillin thức sử dụng y học cứu sống bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, từ kỷ nguyên chất kháng sinh bắt đầu Đây thành tựu vĩ đại nhân loại kỷ XX Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sử dụng số chất đặc hiệu để chữa trị số loại bệnh không mang lại hiệu mong muốn Số lượng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Chính vậy, việc tìm chất kháng sinh thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Chất kháng sinh (antibiotic) chất có nguồn gốc thiên nhiên sản phẩm cải biến chúng đường hóa học Chúng có khả tác dụng chọn lọc phát triển vi sinh vật, tế bào ung thư nồng độ thấp Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ kháng sinh mà y học loại bỏ bệnh nhiễm trùng Hiện với phát triển cơng nghệ thơng tin cơng nghệ sinh học coi ngành hàng đầu giới Trong phải kể đến cơng nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh phục vụ đời sống người có phát triển vượt bậc.Từ phương pháp sinh tổng hợp bán tổng hợp cơng nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò Cho đến phát 17.000 chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp, có 12% chất kháng sinh tổng số có đủ tiêu chuẩn sử dụng y học, số lại dùng lĩnh vực chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật…Trong số vi sinh vật có khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nhóm có tiềm lớn chiếm tới 80% số chất kháng sinh mô tả Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh Streptomyces chi xạ khuẩn gồm nhiều lồi có khả tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc điểm kháng khuẩn Do có tiềm lớn nên xạ khuẩn lựa chọn để phân lập chất kháng sinh, phục vụ cho đời sống y học II) 1) Đại cương xạ khuẩn Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Theo hệ thống phân loại xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn gram dương xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn chuẩn (Eubacteria) siêu giới nhân sơ (Procaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, Actinomycetales, bao gồm 10 bộ, 35 họ, 110 chi 1000 lồi, có 478 lồi cơng bố thuộc chi Streptomyces 500 lồi thuộc tất chi lại xếp nhóm xạ khuẩn Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên đất, nước, hợp chất hữu có sẵn, chí chất mà vi khuẩn nấm không phát triển Nhưng chủ yếu phân bố nhiều đất Xạ khuẩn có vai trò quan trọng tự nhiên, chúng tham gia vào trình phân hủy, chuyển hóa chất đất Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố : độ ẩm, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Đất giàu hữu cơ, khoáng lớp bề mặt có nhiều mùn thường có nhiều xạ khuẩn Xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tốt 25-28 0C, độ ẩm thích hợp xạ khuẩn khoảng 40-55%, pH trung tính kiềm yếu, axit yếu, giới hạn pH khoảng 6,8-7,5 Ở nơi có pHaxit kiềm thường có xạ khuẩn, đặc biệt nơi kiềm xạ khuẩn Theo Waksman, gam đất có khoảng 29.000-2.400.000 CFU (là đơn vị hình thành lạc khuẩn (Colony forming unit), tham số đánh giá số lượng tế bào vi khuẩn nấm hữu hiệu mẫu định) xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số vi sinh vật Một đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh Theo nhiều nghiên cứu cho thấy khoảng 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả chủ yếu thuộc chi Streptomyces Trong y học để điều trị bệnh nhiễm trùng 2) Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 2.1) Khuẩn ty Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển giống hệ sợi nấm Đường kính khuẩn ty thay đổi khoảng 0,2-1,0 μm đến 2-3 μm Khuẩn ty xạ khuẩn phân nhánh, khơng có vách ngăn không bị đứt đoạn Màu sắc khuẩn ty phong phú, gặp màu: trắng, vàng, nâu, đỏ, lục, lam, tím Khi ni cấy mơi trường đặc, khuẩn ty xạ khuẩn phát triển thành hai loại: - - Một loại cắm sâu vào môi trường để lấy nước thức ăn gọi khuẩn ty chất (substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) có chức sinh sản Người ta gọi khuẩn ty khí sinh khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp loại khuẩn ty bắt đầu phát triển từ bào tử nảy mầm Khuẩn ty khí sinh thường có dạng vơi, lơng tơ hay bột mịn với nhiều màu sắc hình dạng khác nhau, có loại màu lục, nâu, trắng, đen Ở đa số xạ khuẩn, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm, loại vi sinh có tên gọi xạ khuẩn Một số xạ khuẩn sợi khí sinh mà có sợi chất, làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn khó tách cấy truyền Loại có sợi khí sinh ngược lại, dễ tách tồn khuẩn lạc khỏi môi trường Khuẩn ty 2.2) Khuẩn lạc Tập hợp nhóm xạ khuẩn riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc Khuẩn lạc xạ khuẩn đặc biệt, không trơn ướt khuẩn lạc vi khuẩn nấm men mà thường chắc, xù xì có dạng thơ ráp, dạng phấn vơi, khơng suốt, có nếp tỏa theo hình phóng xạ Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loại xạ khuẩn tùy điều kiện nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình từ 0,5-2mm Khuẩn lạc có lớp: lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản phẩm trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu tích lũy sinh khối tế bào xạ khuẩn hay tiết môi trường lên men Khuẩn lạc 2.3) Cấu tạo xạ khuẩn Tế bào xạ khuẩn có cấu tạo tương tự tế bào vi khuẩn Dưới kính hiển vi điện tử thấy rõ thành phần tế bào: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, chất nhân hạt dự trữ Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20nm Thành phần chủ yếu peptidoglycan tạo nên lớp vách tế bào tương đối vững giúp trì khuẩn ty bảo vệ tế bào Đây thành phần quan trọng để phân biệt với vi khuẩn Gram (-) Thành tế bào có cấu tạo gồm lớp, lớp ngồi dày từ 60-120Å, lớp rắn dày khoảng 50Å, lớp dày khoảng 50Å.Thành tế bào cho phép chất kháng sinh, axit amin, nhiều hợp chất khác kể hợp chất có kích thước lớn protein, dextran qua cách dễ dàng Bên cạnh thành tế bào cho phép chất dinh dưỡng từ mơi trường ngồi thẩm thấu có chọn lọc qua màng Bên ngồi thành tế bào có lớp vỏ nhày (capsule) cấu tạo từ polisaccharid thường mỏng, số xạ khuẩn lớp vỏ nhày tạo thành trình hình thành bào tử Màng sinh chất có độ dày từ 7-9 nm cấu tạo lớp photpholipid, chiếm khoảng 30-40% khối lượng protein nằm phía trong, phía ngồi hay xun qua màng chiếm 60-70% khối lượng Mỗi phân tử photpholipid chứa đầu điện tích phân cực (đầu photphat) khơng tích điện, khơng phân cực (đầu hidrocacbon) Đầu phân cực tan nước nằm phía Đầu photphat gọi đầu ưa nước đầu hidrocacbon gọi đầu kị nước Các photpholipid màng làm màng hóa lỏng cho phép protein di động tự Sự hóa lỏng động học cần thiết cho chức màng Cách xếp photpholipid protein gọi mơ hình khảm lỏng Tế bào chất xạ khuẩn có chứa số thành phần chủ yếu meroxom, thể nhân, vật thể ẩn nhập gồm hạt poliphotphat polisaccharid Nhân tế bào xạ khuẩn khơng có cấu trúc điển hình, NST khơng có màng Khi non, tồn tế bào có NST sau thành hạt rải rác toàn hệ khuẩn ty 2.4) Sự hình thành bào tử xạ khuẩn Xạ khuẩn sinh sản cách hình thành bào tử Bào tử hình thành sợi khuẩn ty khí sinh chun hóa gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử xạ khuẩn có nhiều loại hình dáng kích thước khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng Cuống sinh bào tử xạ khuẩn đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Hình dạng bào tử xạ khuẩn khác nhau, gặp dạng hình tròn, hình ovan, hình que, hình trụ Trên cuống sinh bào tử thường mang từ 30-100 bào tử có nhiều hơn, mang 1-2 bào tử Bào tử xạ khuẩn Chuỗi bào tử cuống sinh bào tử dạng xoắn Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lơng Nhìn chung lồi, hình dạng bào tử xạ khuẩn tương đối ổn định Vì xem đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn III) Đại cương chất kháng sinh 1) Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh Chất kháng sinh theo khái niệm cũ sản phẩm vi sinh mà nồng độ thấp (μm/ml) ức chế tiêu diệt vi sinh vật khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc ) cách chọn lọc Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” kháng lại, “bios” sống Tuy nhiên, thuật ngữ khơng phản ánh tính chất chất kháng sinh Đã có nhiều định nghĩa khác chất kháng sinh Theo Waksman, chất kháng sinh chất hóa học vi sinh vật sinh ra, có khả ức chế phân hủy tế bào vi khuẩn vi sinh vật khác Ngày nay, chất kháng sinh coi chất đặc hiệu sinh vật sinh trình sống mà nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt vi sinh vật khác cách có chọn lọc Tuy nhiên, việc sử dụng hợp chất quinolon – hợp chất hóa học khơng có nguồn gốc từ vi sinh vật để điều trị bệnh nhiễm khuẩn định nghĩa chất kháng sinh y học đại Các chất kháng sinh không bao gồm chất có nguồn gốc từ vi sinh vật mà bao gồm chất kháng sinh bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần Năm 1928, Alexander Fleming (1881-1955) phát penicillin – chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium có khả ức chế phát triển tụ cầu vàng – Staphylococcus aureus Nhưng phải 10 năm sau, vào năm 1940, nhóm nhà khoa học chiết tách thành công chế phẩm Penicillin Kể từ đó, Penicillin thức dùng làm thuốc chữa bệnh cho người, đẩy lùi nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm Đây thành tự vĩ đại kỷ XX Cùng với việc phát Penicillin, thập kỉ 40, 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc việc khám phá hàng loạt chất kháng sinh có giá trị y học Streptomycin (Waksman, 1940), Cloramphenicol (Erhlich, 1947), Chlotetraxyclin (Dugar, 1948) Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày đẩy mạnh Nhiều Trung tâm nghiên cứu khoa học y học, dược phẩm nông nghiệp nhiều nước giới liên tục phát hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng thực tiễn Năm 1945 phát 30 chất kháng sinh, năm 1949 số 150 chất kháng sinh, năm 1953 xấp xỉ 450 chất kháng sinh, năm 1980 có 5.500 chất đến số lượng chất kháng sinh phát lên tới 17.000 chất khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp Tuy nhiên số có 1-2% chất kháng sinh dùng y học 10 dung môi thường sử dụng để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối có hiệu - Chiết tách chất kháng sinh từ dịch lọc Các chất kháng sinh có trọng lượng phân tử thấp thường hòa tan nước dung mơi hữu Để chiết tách có hiệu cần phải lựa chọn loại dung mơi hòa tan chất kháng sinh bổ sung số chất như: axit oleic, axit palmitic… vào dịch lọc để làm tăng khả hòa tan chất kháng sinh Dung mơi có chứa chất kháng sinh cô điều kiện chân không nhiệt độ thấp 60 0C để loại bỏ dung môi Chất kháng sinh thô nhận từ dịch lọc hay sinh khối làm hóa học cách cô đặc loại bỏ tạp chất Các chất kháng sinh thường bị hoạt tính điều kiện nhiệt độ cao, axit kiềm cao, chiết tách tinh phải sử dụng điều kiện thích hợp cho chất kháng sinh giữ hoạt tính • Phương pháp để tinh chất kháng sinh: Phương pháp chiết rút: làm kháng sinh nhiều lần chiết dung mơi, sau kết tủa tinh chế Phương pháp hấp thụ trao đổi ion: dựa chất hóa học chất kháng sinh axit, kiềm hợp chất vơ định hình hấp thụ nhựa trao đổi ion mang điện tích dương hay âm, dạng cationit hay anionit cột, sau sử dụng dung dịch để thổi kháng sinh khỏi nhựa ion Dung dịch kháng sinh nhận có độ Phương pháp kết tủa: dựa chất hóa học chất kháng sinh hữu hay vô để kết tủa Chất kết tủa nhận cách lọc hay ly tâm Sấy khô nhận chất kháng sinh dạng bột tinh • Tinh chế chất kháng sinh: Để chất kháng sinh có độ tinh khiết cao cần sử dụng phương pháp kết tinh Đây phương pháp quan trọng để 19 tinh chế hợp chất dạng rắn Sự kết tinh thực cách giảm nhiệt độ hay thay đổi hệ dung môi Dung môi chứa vệt chất kháng sinh cuối q trình kết tinh loại bỏ cách chân khơng Ngồi dùng phương pháp: sắc ký hấp phụ, sắc ký mỏng hay sắc ký lỏng cao áp phương pháp tinh chế chất kháng sinh có hiệu IV) 1) Sơ lược quy trình phân lập chất kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces cinereoruber subp Một vài nét chủng HT28 Chủng HT28 chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh có hoạt tính cao, phân lập từ đất Thái Nguyên Chủng HT28 có tên khoa học Streptomyces cineveoruber subp HT28 nghiên cứu số đặc điểm sinh học Chủng có hoạt tính kháng sinh cao, đặc biệt có khả kháng số chủng Pseudomonas aeruginosa gây bệnh người - Đặc điểm hình thái: Cuống bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử nhẵn, lượng bào tử chuỗi 20-45 Độ phóng đại 1000 lần 20 Độ phóng đại 15000 lần - Đặc điểm ni cấy: Có khả sinh trưởng tốt môi trường Gause Trên mơi trường hệ khuẩn ty khí sinh hình thành sớm hơn, màu sắc rõ ràng có màu xám, khơng có khả sinh sắc tố hòa tan HT28 có khả hình thành sắc tố melanin - Đặc điểm sinh lí, sinh hóa: Có khả sinh enzyme ngoại bào: amylase, cellulose protease Là chủng ưa mặn (chịu nồng độ muối tối đa 5%), sinh trưởng nhiệt độ từ 20-40 0C; sinh trưởng tốt 25-350C Sinh trưởng tốt mơi trường trung tính axit (6,5-7), pH thích hợp cho trình sinh tổng hợp chất kháng sinh pH trung tính 2) Vật liệu nghiên 2.1) Xạ khuẩn cứu Chủng xạ khuẩn Streptomyces cineveoruber subp (HT28) Đây chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu, chúng bảo quản giữ giống môi trường Gause 2.2) Vi sinh vật kiểm định Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 Chủng bảo quản giữ giống mơi trường MPA 3) Hóa chất, dụng 3.1) Hóa chất cụ thiết bị, thí nghiệm 21 Các loại dung môi hữu : axeton, n-butanol, iso-butanol, etyl axetat, n-propanol, methanol, ethanol, axit axetic, benzen, chloroform… - Các loại muối : NaCl, KNO3, CaCO3, K2HPO4, MgSO4… - Các loại cao : cao thịt, pepton, cao nấm men… - Các loại hóa chất khác: tinh bột, thạch, casein… 3.2) Dụng cụ - Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Nồi khử trùng - Lò vi sóng Sharp - Dụng cụ thủy tinh - Máy li tâm Hettich - Hộp cấy vô trùng - Máy lắc - Máy cất nước lần 3.3) Môi trường nghiên cứu (g/l) • Mơi trường Gause 1: - Tinh bột tan: 20 - NaCl: 0,5 - KNO3: - MgSO4.7H2O: 0,5 - K2HPO4: 0,5 - FeSO4: 0,01 - Thạch: 20 - Nước máy vừa đủ lít - pH = 6,8 – • Mơi trường MPA: - Cao thịt: - NaCl: - Pepton: 10 - Thạch: 20 - Nước máy vừa đủ lít - pH=7 • Môi trường A-4 - Glucose: 10 - Bột đâu tương: 10 - NaCl: - CaCO3: - Nước máy vừa đủ lít - pH=7 • Mơi trường A-4H: - 22 - Glucose: 15 - Bột đậu tương: 15 - NaCl: - CaCO3: - Nước máy vừa đủ lít - pH=7 • Mơi trường Gause 2: - Cao thịt: - Pepton: - NaCl: - Glucose: 10 - Thạch: 20 - Nước máy vừa đủ lít - pH= 7-7,4 3.4) Các phương pháp nghiên 3.4.1) Phương pháp giữ giống cứu Chủng xạ khuẩn HT28 nuôi môi trường thạch nghiêng (môi trường Gause 1) Sau 5-7 ngày nuôi cấy, kiểm tra ống giống, loại bỏ ống bị nhiễm, sau bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 3-50C Cấy chuyển giống định kì tháng lần Trước sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch để hoạt hóa giống Giải thích: Cấy chuyển giống định kì tháng lần trước sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch để hoạt hóa giống chất kháng sinh sản phẩm thứ cấp, trình bảo quản cấy truyền nhiều lần, chủng thường bị thối hóa, dẫn đến làm giảm hoạt tính hồn tồn khả hình thành kháng sinh 3.4.2) Phương pháp lên men xạ khuẩn kháng sinh Xạ khuẩn lên men môi trường là: A-4; A-4H; Gause 1; Gause Sau 96 nuôi máy 220 vòng/phút nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh dịch lên men phương pháp đục lỗ để chọn môi trường phù hợp cho nghiên cứu Giải thích: Mơi trường lên men đóng vai trò quan trọng cơng nghệ sản xuất chất kháng sinh Một môi trường lên men tốt phải đảm bảo cho chủng sinh trưởng tốt, đồng thời cho 23 hiệu suất kháng sinh cao Để tổng hợp chất kháng sinh, xạ khuẩn cần thiết phải có nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, nguyên tố khoáng, chất sinh trưởng Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng nguồn dinh dưỡng khác chủng giống nhiều trường hợp dư thừa glucose hay amon mơi trường dẫn đến làm ức chế q trình tổng hợp chất kháng sinh Để lựa chọn môi trường lên men tốt nhất, nên tiến hành khảo sát nhiều môi trường khác nhau, cụ thể môi trường dựa vào phương pháp đục lỗ để chọn môi trường lên men tốt 3.4.3) Phương pháp xác định - Phương pháp khối thạch hoạt tính kháng sinh Đây phương pháp để sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh Xạ khuẩn ni cấy mơi trường Gause sau 5-7 ngày, xạ khuẩn mọc tốt dùng khoan nút chai khoan thỏi thạch đặt vào đĩa petri cấy sẵn vi sinh vật kiểm định Sau đặt vào tủ lạnh 40C 4-5 để chất kháng sinh kịp thời khuếch tán nuôi nhiệt độ ấm 28-30 0C Đọc kết sau 24 vi khuẩn, ngày nấm kiểm định Hoạt tính kháng sinh xác định theo kích thước vòng vơ khuẩn: D-d (mm) D đường kính vòng tròn vơ khuẩn, d đường kính thỏi thạch Vòng tròn vơ khuẩn lớn chứng tỏ hoạt lực chất kháng sinh mạnh Các vi khuẩn kiểm định nuôi cấy mơi trường MPA Giải thích: Phương pháp thực nhằm xác định xạ khuẩn loại mơi trường khác có hoạt tính kháng sinh mạnh hay yếu, từ chọn xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh Dựa vào cách quan sát kích thước vòng tròn vơ khuẩn: vòng tròn vơ khuẩn lớn chứng tỏ hoạt lực chất kháng sinh mạnh - Phương pháp đục lỗ Đây phương pháp thử hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn dung dịch 24 Xạ khuẩn nuôi cấy mơi trường lên men thích hợp máy lắc 220 vòng/phút nhiệt độ 28-30 0C, sau 120 lấy đem li tâm 5000 vòng/10 phút để thu dịch kháng sinh thô Dùng khoan nút chai khoan lỗ bề mặt thạch cấy vi khuẩn hộp petri, nhỏ vào lỗ thạch 0,1 ml dịch nuôi cấy cần thử Các bước phương pháp khối thạch Giải thích: Phải thử hoạt tính kháng sinh chất kháng sinh sản phẩm thứ cấp, trình bảo quản cấy truyền nhiều lần, chủng giống thường bị thối hóa, dẫn đến làm giảm hoạt tính hồn tồn khả hình thành kháng sinh Chủng xạ khuẩn HT28 giữ ống thạch nghiêng môi trường Gause trước tiến hành nghiên cứu cần kiểm tra lại hoạt tính kháng sinh chúng theo phương pháp đục lỗ Nếu chủng giữ hoạt tính tương đối ổn định đặc điểm cần có chủng xạ khuẩn lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Vì chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh nên cần tiến hành lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho chủng Mơi trường lên men đóng vai trò quan trọng công nghệ sản xuất chất kháng sinh Một môi trường lên men tốt phải bảo đảm cho chủng sinh trưởng tốt đồng thời cho hiệu suất kháng sinh cao Sử dụng môi trường để lên men, xem hoạt tính mạnh mơi trường Phương pháp chiết tách chất kháng sinh dung môi hữu Chiết chất kháng sinh từ sinh khối 3.4.4) - Sau lên men 5-7 ngày, dịch nuôi cấy sinh khối tách riêng Phần sinh khối tách loại dung môi khác với tỉ lệ chiết 1:1 theo đơn vị thể tích/thể tích Hỗn hợp dung mơi : sinh khối lắc 30 phút nhiệt độ phòng, sau ly tâm loại sinh khối Cuối dung môi chiết thử hoạt tính kháng sinh vi sinh vật kiểm định phương pháp đục lỗ thạch 25 Giải thích: Khả hòa tan chất kháng sinh loại dung môi khác Đây đặc tính cần ý để thu nhận kháng sinh Để xác định dung mơi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh, chủng HT28 lên men mơi trường thích hợp nhất, sau 5-7 ngày ly tâm thu sinh khối tiến hành chiết dung môi hữu Sử dụng dung mơi thơng dụng, có tính hòa tan tốt đặc biệt độc: etyl axetat, axeton, methanol, n-propanol, iso-butanol, ethanol…để chiết rút chất kháng sinh từ sinh khối xác định hoạt tính kháng sinh dịch chiết phương pháp đục lỗ Lựa chọn dung mơi thích hợp để tách chiết chất kháng sinh có hoạt lực mạnh từ sinh khối - Chiết chất kháng sinh từ dịch ngoại bào Dịch lên men sau loại sinh khối tách loại dung môi hữu khác n-butanol, iso-butanol, benzene, chloroform, etyl axetat; tỷ lệ dịch chiết dung môi 1:1 theo đơn vị thể tích/thể tích Hỗn hợp dịch lên men dung mơi lắc nhiệt độ phòng 30 phút Sau lắc, đem ly tâm thu dịch ngoại bào Một đặc tính chất kháng sinh cần quan tâm khả hòa tan chất kháng sinh dung môi phụ thuộc nhiều vào pH, để xác định pH cho hiệu tách chiết chất kháng sinh cao nhất, tiến hành khảo sát chọn pH thích hợp Tùy vào chất kháng sinh hòa tan tốt dung môi môi trường axit hay bazo mà chọn môi trường chiết tách chất kháng sinh từ dịch ngoại bào chủng HT28 để đạt hiệu cao.Sau thử hoạt tính kháng sinh dung mơi chiết vi sinh vật kiểm định phương pháp đục lỗ thạch Giải thích: Chất kháng sinh tích lũy sinh khối tiết môi trường xung quanh Nhưng có trường hợp, chất kháng sinh vừa nằm sinh khối, vừa nằm mơi trường Vì để kiểm tra chất kháng sinh HT28 có dịch ngoại bào hay nằm sinh khối, tiếp tục chiết tách chất kháng sinh từ dịch ngoại bào 26 Phương pháp xác định số tính chất chất kháng sinh Khả bền pH chất kháng sinh 3.4.5) - Xạ khuẩn nuôi môi trường lên men thích hợp sau 5-7 ngày tiến hành ly tâm thu dịch lên men Dịch lên men chỉnh pH theo pH 3,4,5,6,7,8,9 NaOH 0,5M CH3COOH 0,4M giữ nhiệt độ phòng 10 phút Sau chỉnh tiếp dịch lên men có mức pH pH = tiến hành thử hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ thạch Giải thích: Khả bền pH chất kháng sinh đặc điểm cần ý có ý nghĩa cơng nghệ tách chiết ứng dụng chất kháng sinh Chủng có khoảng bền pH cao thuận lợi công nghệ thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng thời mở rộng khả ứng dụng HT28 nhiều chất kháng sinh có độ mẫn cảm cao với axit bazo bị khả kháng khuẩn môi trường axit bazo Khả bền vững chất kháng sinh với pH khác phụ thuộc vào chất hóa học lại kháng sinh - Khả bền với nhiệt độ chất kháng sinh: Dịch nuôi cấy sau lọc đun cách thủy 40 0C, 600C, 800C, 1000C kéo dài 20, 40, 60 phút, sau để nguội xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ Giải thích: Khả bền với nhiệt chất kháng sinh đặc điểm cần nghiên cứu để phục vụ cho công nghệ tách chiết tinh chế chất kháng sinh có hiệu cao Việc xác định khả bền với nhiệt phục vụ cho việc lựa chọn nhiệt độ chiết tách, sử dụng bảo quản chất kháng sinh để bảo đảm hoạt lực 3.4.6) Kết thu thực nghiệm Chủng xạ khuẩn HT28 ban đầu giữ ống thạch nghiêng môi trường Gause 27 Giống HT28 giữ môi trường Gause Kiểm tra hoạt tính kháng sinh HT28 mơi trường Gause trước sử dụng Tóm tắt tiêu khảo sát kết đạt được: Chỉ tiêu Hiện tượng Kết luận Môi trường lên Gause 1: dịch lên men Môi trường lên men mơi trường men tốt có vòng tròn vơ khuẩn Gause lớn, đường kính vòng vơ khuẩn 22,2mm; lớn môi trường khảo sát 28 Hoạt tính kháng sinh chủng HT28 môi trường lên men 1- A-4 2- A-4H 3- Gause 4- Gause Tách chiết chất Dịch chiết ethanol kháng sinh từ sinh cho hoạt lực mạnh khối với vòng tròn vơ khuẩn có đường kính 19,6mm Điều thuận lợi kinh tế để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối tế bào ethanol vừa rẻ tiền lại khơng độc hại Hoạt tính kháng sinh dịch chiết từ sinh khối 1- etyl axetat 2- axeton 29 Chất kháng sinh chủng HT28 nằm sinh khối dịch ngoại bào Do vậy, để thu nhận chất kháng sinh chủng cần phải tách chiết sinh khối dịch ngoại bào methanol n-propanol iso-butanol ethanol Tách chiết chất Tại pH = dịch chiết kháng sinh từ dịch dung môi ngoại bào cho hoạt lực cao nhất, điều chứng tỏ khả hòa tan chất kháng sinh dung môi tốt mơi trường axit Tuy nhiên khả hòa tan chất kháng sinh loại dung môi khác isobutanol dung môi tách chiết tốt với vòng tròn vơ khuẩn có kích thước 24,9mm, hiệu suất chiết khoảng 90,2% 3456- Hoạt tính kháng sinh dịch chiết ngoại bào chiết pH=3 1- n-butanol 2- iso-butanol 3- benzene 4- chloroform 5- etyl axetat Khả bền Dung dịch kháng sinh Chất kháng sinh chất kháng sinh chủng HT28 có khả 30 pH Khả nhiệt kháng sinh giữ hoạt tính bền vững trong dải pH từ đến pH thời gian 10 phút hoạt tính khơng thay đổi mức pH Khả bền dịch kháng sinh pH bền Hoạt tính kháng sinh có chất thay đổi rõ rệt xử lý mức nhiệt độ khác Ở 400C 20 phút đầu hoạt tính kháng sinh khơng thay đổi thay đổi Tuy nhiên tăng mức nhiệt độ thời gian xử lý hoạt tính kháng sinh giảm rõ rệt Ở 1000C kéo dài 60 phút, hoạt tính kháng sinh khoảng 26% so với đối chứng 31 Chất kháng sinh tổng hợp từ chủng HT28 thuộc loại bền với nhiệt độ, nên tách chiết sử dụng bảo quản chất kháng sinh nhiệt độ không 500C để bảo đảm hoạt lực kháng sinh Hoạt tính kháng sinh dịch lọc xử lý nhiệt độ khác vòng 60 phút 3.4.7) Phương pháp xử lí số liệu Kết nghiên cứu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm excel Đây phần mềm lập trình sẵn hàm sử dụng dựa cơng thức tốn thống kê có cơng thức: - Giá trị trung bình (Xtb) Xtb=i - Độ lệch chuẩn (ϭ) Ϭ= - Sai số m m=± V) Kết luận Ngày chất kháng sinh phân lập từ xạ khuẩn tìm thấy nhiều Mỗi lồi xạ khuẩn có khác việc chọn môi trường lên men, dung mơi, độ pH… thích hợp việc phân lập chất kháng sinh xạ khuẩn tuân theo quy trình định 32 VI) Tài liệu tham khảo 1) http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-nghien-cuu-tachchiet-va-tim-hieu-tinh-chat-cua-chat-khang-sinh-co-nguongoc-tu-mot-so-chung-xa-khuan-phan-lap-o-38869/ 2) https://vicare.vn/benh/nhiem-truc-khuan-pseudomonas2453/ 3) https://vi.wikipedia.org/wiki/Murein 4) http://luanan.nlv.gov.vn/luanan? a=d&d=TTjGGSeseOBG1986.1.7&e= -vi-20 imgtxIN 5) http://thuocbietduoc.edu.vn/xa-khuan/ 6) http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-nghien-cuu-hoat-tinhsinh-hoc-cua-mot-so-chung-xa-khuan-phan-lap-o-nui-phaodai-tu-thai-nguyen-1944/ 7) http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-phan-lap-va-nghien-cuuve-chung-streptomyces-4016-24639/ 8) http://phubinhlab.com/tin-tuc/phuong-phap-caytruyen.html 9) http://lrc.tnu.edu.vn/upload/collection/brief/32802_238201 2145929115119.pdf 33 ... khác chất kháng sinh Theo Waksman, chất kháng sinh chất hóa học vi sinh vật sinh ra, có khả ức chế phân hủy tế bào vi khuẩn vi sinh vật khác Ngày nay, chất kháng sinh coi chất đặc hiệu sinh vật sinh. .. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một đặc điểm quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh Trong số 8000 chất kháng sinh biết giới, có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn Hầu hết chất. .. lược quy trình phân lập chất kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces cinereoruber subp Một vài nét chủng HT28 Chủng HT28 chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh có hoạt tính cao, phân lập từ đất Thái Nguyên