XÁC ĐỊNH HELICOBACTER PYLORI TRONG MẢNH SINH THIẾT DẠ DÀY HÀNH tá TRÀNG VÀ PHÁT HIỆN đột BIẾN KHÁNG CLARITHROMYCIN BẰNG REAL TIME PCR TẠI BỆNH VIỆN đa KHOA TỈNH bắc GIANG

pylori, hiện nay y học có thể sử dụng nhiều kỹ thuật, trong đó có hai nhóm kỹ thuật chính: Các kỹ thuật có sử dụng thủ thuậtxâm lấn, dựa vào nội soi dạ dày, lấy mảnh sinh thiết cho

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loét dạ dày tá tràng (LDDTT) là bệnh rất phổ biến và đã được y họcbiết đến từ rất lâu Có rất nhiều giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh Tuyvậy, đến năm 1983, qua nhiều nghiên cứu, Marshall và Warren mới chứng

minh được vai trò gây bệnh của Helicobacter pylori (H pylori) trong LDDTT, từ đó, có rất nhiều công trình nghiên cứu về H pylori ra đời, quan

điểm điều trị LDDTT và kết quả điều trị đã thay đổi rất nhiều Với sự pháttriển của kỹ thuật nội soi tiêu hóa, hiện nay, để chẩn đoán và điều trị LDDTTđồng nghĩa với việc nội soi xác định tổn thương và xét nghiệm xác định tình

trạng nhiễm H pylori [1].

H pylori là vi khuẩn với các đặc điểm: bắt màu Gram (-); hình xoắn,

hơi cong; sinh enzym urease ngoại bào rất mạnh; đặc biệt, rất khó nuôi cấy,độ nhạy của kỹ thuật nuôi cấy thấp (50%), thời gian trả kết quả nuôi cấy vàkháng sinh đồ chậm (7 - 14 ngày)

Để xác định nhiễm H pylori, hiện nay y học có thể sử dụng nhiều kỹ

thuật, trong đó có hai nhóm kỹ thuật chính: Các kỹ thuật có sử dụng thủ thuậtxâm lấn, dựa vào nội soi dạ dày, lấy mảnh sinh thiết cho các kỹ thuật như(test urease, mô bệnh học, nhuộm soi, nuôi cấy, các kỹ thuật PCR ) Thứhai là các kỹ thuật không xâm lấn như (test huyết thanh IgM, định lượng IgG,

test hơi thở, test tìm H pylori trong nước tiểu và trong phân ) Mỗi kỹ thuật này đều có giá trị riêng trong xác định nhiễm H pylori [1].

Real-time PCR phát hiện H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày dựa

vào xác định những đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn, là kỹ thuật hiện đại, cóđộ nhạy và đặc hiệu cao (từ 95 – 100%), thời gian trả kết quả nhanh, bệnhphẩm không đòi hỏi phải bảo quản đặc biệt Ngoài ra, còn phát hiện đượcmột số đột biến liên quan đến kháng kháng sinh của vi khuẩn [1]

Do các đặc điểm về bệnh LDDTT và H pylori như trên, hiện nay, điều

trị LDDTT được hướng dẫn sử dụng theo các phác đồ, bản chất là phối hợp

kháng sinh diệt H pylori Trong các phác đồ điều trị LDDTT và diệt H pylori, clarithromycin là kháng sinh chủ yếu và được sử dụng Clarithro-

mycin là thuốc gắn vào peptydyl transferase thuộc vùng domain V và VI của

23S rRNA H pylori, làm ngừng tổng hợp protein vi khuẩn H pylori kháng

lại clarithromycin bằng nhiều cơ chế, trong đó cơ chế chính là đột biến thaythế một số nucleotid ở gen 23S rRNA làm giảm ái lực gắn củaclarithromycin

Hiện nay, H pylori đã kháng lại clarithromycin rất nhiều, tỷ lệ kháng

thuốc ở các khu vực và ở các thời điểm không đều nhau: Trung Quốc (65,4%

- 2009); Mỹ và các nước Châu Âu (> 20% - 2010); Ba Lan, Cameroon (gần50% - 2010); Việt Nam (> 20% - 2009 - 2012), có những khu vực tại Việt

Nam có > 50% chủng H pylori kháng clarithromycin [2].

Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang là bệnh viện tuyến cuối cùng củangành y tế tỉnh Bắc Giang Tại đây, các bệnh nhân VLDDTT được chỉ địnhnội soi chẩn đoán Khoa Vi sinh có các trang thiết bị đáp ứng nhu cầu về xétnghiệm trực tiếp, nuôi cấy, phân lập cũng như real-time PCR Tuy nhiên,

việc áp dụng real-time PCR trong xác định H pylori trên lâm sàng còn rất

hạn chế Các bác sỹ thường chỉ định nhuộm soi và test urease cho xác định vi

khuẩn H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày và kê đơn theo các phác đồ điều trị Hơn nữa, việc nuôi cấy và làm kháng sinh đồ với H pylori gặp nhiều

khó khăn do thời gian chờ kết quả dài và độ nhạy thấp

Hiện nay, tại Bắc Giang chưa có công trình nghiên cứu nào đánh giá

về H pylori kháng kháng sinh, đặc biệt là kháng clarithromycin

Từ những thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:

1 Xác định H pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân loét dạ dày tá tràng bằng real-time PCR tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang.

2 Xác định tỷ lệ H pylori có đột biến kháng clarithromycin bằng kỹ thuật real-time PCR.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm của vi khuẩn H pylori

1.1.1 Vài nét về lịch sử nghiên cứu.

Các bệnh về dạ dày tá tràng đã được nghi ngờ có liên quan đến nhiễmkhuẩn từ rất lâu Tuy vậy, đến năm 1983, hai tác giả là Marshall và Warren

bằng nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh là vi khuẩn H pylori là

nguyên nhân chính liên quan đến các bệnh như viêm loét dạ dày tá tràng, ungthư dạ dày, viêm dạ dày trào ngược, rối loạn tiêu hóa dạ dày… và đã đượcgiải Nobel y học năm 2005 [1]

1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn H pylori

1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc, tính chất bắt màu của vi khuẩn H pylori.

H pylori có hình xoắn, hơi cong, kích thước 0,3-1 x 1,5-5 µm.

H pylori có thể chuyển dạng hình cầu khi gặp một số điều kiện không

thuận lợi hoặc sau khi dùng một số kháng sinh Morozov đã gặp vi khuẩnchuyển dạng hình cầu ở bệnh nhân được điều trị metronidazol và omeprazolở ngày thứ 3 - 7 Khi ở dạng hình cầu, các hoạt động chuyển hóa của vikhuẩn giảm mạnh, không sinh urease, vi khuẩn có thể chuyển sang dạng hoạt

động khi có điều kiện thích hợp Goodwin gọi đây là “thể ngủ” của H pylori,

dạng này giúp vi khuẩn tồn tại lâu hơn ở môi trường không thuận lợi [1],[3]

H pylori có 5 - 7 lông ở một cực của tế bào, các lông vi khuẩn có thể

nhuộm bằng phương pháp Kodaka (nhuộm âm với 1% acid phosphotungstic).Khi cắt ngang một lông, Susumo Ito (1965) nhận thấy trong vỏ bọc của sợilông có 15 sợi tách biệt nhau, mỗi sợi kích thước 30 nm, dài 2 - 3 µm

Tính chất bắt màu của vi khuẩn tùy thuộc phương pháp nhuộm:Nhuộm Gram, vi khuẩn có màu Gram (-), nhuộm HE bắt màu tím đỏ, nhuộmGiemsa hoặc Diff-Quik cho màu xanh thẫm, nhuộm Warthin-starry vi khuẩnbắt màu đen đậm, nhuộm huỳnh quang vi khuẩn bắt màu da cam [1],[3]

1.1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học.

- Các tính chất sinh vật hóa học chung của H pylori:

Bảng 1.1: Một số tính chất sinh vật hóa học của H pylori [4].

Westblot và Majewski thấy một số chủng H pylori đột biến khiến vi

khuẩn không sinh catalase

Mendz và CS nghiên cứu về chuyển hóa pyruvate và cho thấy, H.

pylori có chuỗi chuyển hóa của vi khuẩn kỵ khí, nhưng thực tế H pylori vẫn

cần oxy

H pylori có con đường chuyển hóa kiểu Entner - Doudonoff, giống

cách chuyển hóa ở các sinh vật cổ xưa

H pyloricó vòng chuyển hóa urea, cách chuyển hóa này chủ yếu ở các

tế bào có nhân điển hình, ít gặp ở các vi khuẩn

Schafer (Đức) đã xác định một chức năng khác biệt của H pylori là

vận chuyển ion do men type P vận chuyển ion sắt và 2 clone khác vậnchuyển ion Cu2+ và Ni2+

1.1.2.3 Đặc điểm bộ gen.

- Bộ gen của các chủng H pylori tương đối đồng nhất, khoảng từ 1,6 –

1,72 Mb (Taylor, Chang và Easton), với tỷ lệ G + C từ 35 đến 40% Gần như

tất cả các chủng H pylori phân lập được đều có hai plasmid pHPM180 (3,5 kb) và pHel1 (2,9 kb Chúng được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn E coli Còn một plasmid hiếm gặp hơn chỉ có ở một số chủng H pylori là pHPK225

(1,5 kb) có nguồn gốc từ vi khuẩn Gram (+) [5]

- Bộ gen của H pylori có sự đa dạng rất lớn về trình tự giữa các chủng.

Hiện nay, toàn bộ cấu trúc bộ gen của 2 chủng H pylori là HP 26695 được

phân lập ở Anh vào năm 1987 và HP 199 được phân lập ở Mỹ vào năm 1994

đã được nghiên cứu xong Cấu trúc bộ gen của chúng gồm một nhiễm sắcthể dạng vòng có kích cỡ 1,64 - 1,67 Mb; 90,8 - 91% là các vùng mã hóa.Nhiễm sắc thể chủ yếu chứa các gen tham gia vào sự tổng hợp men urease,

yếu tố độc tế bào vacA, kháng nguyên cagA và lông Bộ gen H pylori

chủng 26695 bao gồm 1587 gen, trong khi chủng J99 chỉ có 1491 gen Mặcdù bộ gen của chủng 26695 lớn hơn J99 tới 24kb nhưng tỷ lệ G + C đều bằng39% và có một số đặc điểm chung bao gồm cả chiều dài trung bình của cáctrình tự mã hóa, mật độ mã hóa và các codon khởi đầu Cả hai bộ gen đều cóhai bản sao các gen 16S, 23S, 5S rRNA nhưng chủng 26695 có thêm mộtbản sao 5S rRNA [5]

- Đa số các chủng phân lập ở Đông Á có gen cagA và các allen gây độc tế bào của gen vacA Trong khi đó, 50% số chủng ở Châu Âu và Mỹ có

các gen này Sự khác biệt này có thể do nguồn gốc địa lý của các chủng hoặcsự chọn lọc khác nhau của các chủng theo đặc điểm của cơ thể vật chủ

- Tính đa dạng di truyền có thể là sự thích nghi của H pylori đáp ứng

lại điều kiện môi trường ở dạ dày tá tràng của cơ thể vật chủ Cơ chế tạo nêntính đa dạng di truyền xảy ra theo con đường thông thường bằng sự sắp xếplại DNA và việc thêm vào hoặc bỏ đi các trình tự lạ Các chủng đột biếnthường có thành phần G + C khác biệt và mang các gen độc lực Sự đa dạng

cũng thấy ở mức độ điều hòa và biểu hiện gen dẫn đến sự đa dạng về kiểuhình Ví dụ như sự đa dạng kiểu hình của các enzyme sinh tổng hợplipopolysaccharid (LPS) [5].

- Kích cỡ bộ gen của H pylori nhỏ hơn của các vi khuẩn khác Tuy

vậy, trình tự của bộ gen rất khác nhau ở các chủng, ngay cả trong dạ dày của

một bệnh nhân, trình tự gen của các chủng H pylori cũng có thể khác nhau.

- Các gen chính của H pylori đã được xác định gồm:

Gen tổng hợp enzym urease: có khoảng 9 gen ký hiệu từ A - I, trong

đó A, B là gen cấu trúc, F, G, H là gen hoạt hóa

Gen sinh độc tố tế bào: cagA, vacA: sinh protein gây độc vật chủ Tất cả các chủng H pylori đều mang gen vacA mã hóa protein vacA

với các mức độ đa hình khác nhau [1]

+ Một số nghiên cứu về dịch tễ học bộ gen của H pylori như sau:

- Peek và CS (1998) phát hiện gen iceA của H pylori, thấy một trong hai alen là iceA1 có liên quan đến loét đường tiêu hóa và sự gia tăng nồng độ

IL-8 ở màng nhầy niêm mạc dạ dày sau sự bám dính của vi khuẩn [6]

Van Doorn và CS (1998) khảo sát tại Hà Lan, kết quả là iceA1 chiếm 56,4%, iceA2 chiếm 26,6%, của 94 trường hợp Tác giả kết luận, kiểu gen

iceA độc lập với cagA và vacA, nhưng vacA s1, cagA và iceA1 đều giữ vai

trò quan trọng bệnh sinh loét đường tiêu hóa [7]

Yamaoka và CS (1999) nghiên cứu trên 424 chủng H pylori phân lập

từ bốn nước Colombia, Mỹ, Hàn Quốc và Nhật Kết quả là các kiểu gen phân

bố khác nhau theo khu vực địa lý Kiểu gen cagA+ iceA1 vacAs1c-m1 chiếm ưu thế ở Nhật và Hàn Quốc, kiểu gen cagA+ iceA2 vacAs1b-m1 chiếm ưu thế ở Mỹ, kiểu cagA+ iceA2 vacAs1a-m1 chiếm ưu thế ở

Comlobia [8]

Van Doorn và CS (2000) công bố cấu trúc locus iceA của H pylori.

Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp Northern Blots và RT-PCR để phân

tích sự phiên mã của iceA1 và các gen liền kề hpyIM và cysE Kết quả cho

thấy, iceA1 không mã hóa một protein có chức năng Sự phiên mã của hpyIM

(gen mã hóa CATG-methyltransferase) phụ thuộc vào sự phiên mã của

iceA1 Tác giả cho rằng, iceA1có thể gây độc thông qua điều hòa phiên mã hpyIM Đồng thời, Van Doorn và CS dùng real-time RT-PCR xác định mức

độ biểu hiện các gen của H pylori trong cơ thể Từ đó tìm hiểu mối liên quan

của các gen này với quá trình sinh viêm ở dạ dày Các kết quả cho thấy, mức

độ phiên mã của iceA1, iceA2 và 16S rRNA độc lập Mức độ biểu hiện của

iceA1 liên quan đáng kể với sự gia tăng nồng độ IL-8, thu hút bạch cầu đoạn

và phản ứng viêm tại lớp màng nhầy niêm mạc dạ dày [7]

Ito và CS (2000) công bố các trình tự đầy đủ của gen iceA1 từ 25 chủng H pylori khác nhau Các chủng vi khuẩn này phân lập được từ hai

nhóm bệnh nhân viêm và loét dạ dày tại Nhật [9]

Kidd và CS (2001) công bố kết quả khảo sát các kiểu gen iceA của H.

pylori ở Nam Phi Tác giả sử dụng PCR kết hợp giải trình tự để xác định kiểu

gen iceA của H pylori ở hai nhóm bệnh nhân ung thư và loét dạ dày tá tràng Kết quả là, iceA1 liên quan đến ung thư dạ dày, trong đó kiểu vacA s1/iceA1

chiếm tỷ lệ cao [10]

Xu và Blaser (2001) chứng minh promotor trình tự DNA khởi động

phiên mã của gen hpyIM giữa hai chủng H pylori, gen iceA1 và iceA2 khác nhau Chủng có gen iceA1, hpyIM có hai promotor hoạt động độc lập Chủng

có gen iceA2, hpyIM có một promotor khác Mức độ phiên mã của gen này ở chủng có gen iceA1cao hơn ở chủng có iceA2 Trình tự của hpyIM bảo tồn cao nhưng sự biểu hiện của phức hợp iceA1-hpyIM hệ thống restriction- modification (R-M) rất đa dạng giữa các chủng H pylori Hoạt động R-M

trình tự chuyên biệt CATG gây độc cho vật chủ và giữ vai trò quan trọngtrong quá trình tồn tại và phát triển của vi khuẩn trong vật chủ [11]

1.1.2.4 Nuôi cấy.

H pylori là vi khuẩn khó mọc trên các điều kiện khí trường bình

thường, các tác giả nuôi cấy thành công khi sử dụng điều kiện vi hiếu khí vớinồng độ các khí: N2: O2: CO2 là 85:5:10 [1],[3],[4],[12]

Nhiệt độ môi trường thích hợp nhất cho H pylori là 370C, nó có thểphát triển được từ 34 - 370C

pH môi trường thích hợp nhất từ 7 - 8, vi khuẩn có thể phát triển đượcở pH từ 5,5 – 8,5

Môi trường nuôi cấy cần có các yếu tố giàu dinh dưỡng cho phát triển,một số yếu tố phụ gia cần thiết, một số yếu tố ức chế vi khuẩn khác gồm một

số kháng sinh không nhạy với H pylori

Đặc điểm nuôi cấy: H pylori khó mọc và chậm trên các môi trường

nuôi cấy, thường sau 48 - 72 giờ mọc thành khuẩn lạc nhỏ khoảng 1mm

Độ ẩm môi trường cũng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi

khuẩn H pylori, theo một số nghiên cứu cho thấy độ ẩm cần thiết cho vi

khuẩn phát triển là 85% [90]

Bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm nuôi cấy là vấn đề quan trọng cho sự

thành công của kỹ thuật nuôi cấy H pylori [1],[4].

1.1.2.5 Các yếu tố độc lực.

+ Enzym urease.

- Enzym urease được H pylori tổng hợp dưới sự điều hòa của gen ure

A, B và C, là một protein có trọng lượng phân tử 550 kDa

- Một số đặc điểm của enzym urease:

Vị trí hoạt động đòi hỏi có gắn yếu tố nikel với urease của jack Bean

và một vài loại vi khuẩn khác, tuy vậy việc hoạt hóa in vitro có thể sử dụngđược mangan và cobalt

Trọng lượng phân tử: 480 hoặc 545 kDa (với urease Jack Bean), có

840 amino acid cho mỗi phân tử trong đó 90 là cystein

pH hoạt động tốt nhất: 7,4

Nhiệt độ hoạt động mạnh nhất: 600C.

Hoạt động đặc hiệu: thủy phân urea

Yếu tố ức chế: các kim loại nặng (Pb-, Pb2+)

Hầu hết các urease của vi khuẩn khác là hoạt động nội tế bào, ngoại trừ

urease của H pylori là hoạt động ngoại tế bào [13].

+ Các gen phụ của H pylori: có 5 gen là:

- Ure E - I tham gia hoạt hóa apoenzyme bằng thu nhận ion Ni+

- Gen urel của H pylori mã hóa cho một protein màng để tạo một lỗ

cho urea ở màng bào tương, lỗ này mở ra khi có pH acid, do vậy urea được

vận chuyển dễ dàng trong môi trường có pH acid, vì vậy gen urel có thể coi như đầu dò độ acid của H pylori.

+ Tính di động của vi khuẩn:

H pylori di động nhờ 5 - 7 lông ở một cực của vi khuẩn, lông giúp vi

khuẩn quần cư trên niêm mạc và chui sâu vào các tuyến của dạ dày, lẩn tránhtác dụng của acid dịch vị

+ Yếu tố bám dính:

H pylori bám vào niêm mạc dạ dày nhờ các yếu tố bám dính và các

receptor trên tế bào niêm mạc Một số gen liên quan đến bám dính như sau:

- Gen babA (Hp 1243) và receptor là kháng nguyên Leb

- Gen babB (Hp 0896).

- Gen alpA (Hp 0912) và alpB (Hp 0913) khi bị bất hoạt làm giảm tính

bám dính

- Gen sabA (Hp 0725) và receptor là thụ thể Lex

Các gen quy định tính bám dính của H pylori thuộc nhóm 32 gen mã

hóa protein màng ngoài, tùy vào mức dộ tổng hợp ra các protein mà chúnglàm thay đổi các thành phần trên bề mặt tế bào vi khuẩn

+ Một số enzym sinh học:

- Enzym SOD (Superoxide dismutase) tách các ion superxyd thành cáchydro, peroxyd, oxy

- Enzym catalase giáng hóa hydrogen peroxyd thành nước và oxy,

enzym này không có hoạt tính peroxydase, nó giống urease, cần cho H.

pylori tồn tại khi tiếp xúc với các tế bào thực bào.

- Enzym Ahp (Alkalinhydroperoxyd).

- Gần đây, mới phát hiện enzym argininase của H pylori, đây là enzym

trong chu trình urea hiếm có ở các vi khuẩn khác Enzym này có thể điều

chỉnh các tế bào chủ trong sản xuất ra NO, có tác dụng bảo vệ H pylori

chống lại NO của các đại thực bào sản xuất ra

Các enzym và một số đặc tính trên có tác dụng bảo vệ H pylori chống

lại hệ thống bảo vệ của cơ thể bị nhiễm vi khuẩn

+ Độc tố cagA:

CagA (Cytotocin associated gen A) là protein có trọng lượng phân tử

120 - 140 kDa, do kết quả biểu hiện của gen cagA Gen cagA nằm trên chuỗi DNA của H pylori, tại vùng tiểu đảo tạo cơ chế gây bệnh PAI (Pathogenicity island) Có 7/31 gen của hệ thống cagPAI mã hóa các protein tương tự trong

hệ thống tiết typ IV Tiểu đảo PAI mã hóa cho bộ máy tiết vận chuyểnprotein cagA vào trong tế bào khi vi khuẩn tiếp xúc với tế bào biểu mô hoặcđại thực bào

Một số nghiên cứu ở châu Âu cho thấy, 60% các chủng phân lập được

là có cagA(+) và các thể bệnh viêm loét và ung thư dạ dày thường liên quanđến các chủng có cagA(+) [1]

Một số nghiên cứu khác cho thấy, ở bệnh nhân loét tá tràng, 80 - 100%

các chủng H pylori phân lập được có cagA(+) Trong khi đó, ở bệnh nhân

viêm dạ dày chỉ có 40 - 60% các chủng có cagA(+) Ở các bệnh nhân nhiễm

H pylori có cagA(+), thường thấy có dị sản ruột, viêm mạn teo và ung thư dạ

dày, các yếu tố viêm như IL-1α, IL-1β, IL-8 tăng cao hơn ở người nhiễm cácchủng cagA(-)[14],[15],[16], [17], [18]

Nghiên cứu đa trung tâm tại Pháp (2001) cho thấy, 652 bệnh nhân

được nội soi, sinh thiết và làm các xét nghiệm Những người có H pylori với

cagA(+) thường có tổn thương mô bệnh học rất nặng như viêm dạ dày hoạtđộng, teo niêm mạc hang vị và thân vị, dị sản ruột cao hơn người nhiễm

H pylori có cagA(-) [18],[19], [20].

+ Yếu tố vacA:

VacA (Vacuolating cytotocin) là một protein độc tố gây rỗng tế bào

được tổng hợp bởi gen vacA.

Trọng lượng phân tử protein vacA khoảng 124 kDa, gồm peptid tínhiệu 3 kDa, độc tố tiết ra 88.2 kDa, đoạn carboxyl cuối cùng không tiết ra 33kDa Tác động của vacA đã được thực nghiệm và chứng minh như sau:

- Trên invitro:

Gây rỗng bằng giết chết tế bào

Giảm điện trở tế bào, tăng tính thấm với các ion Fe3+, Ni2+ và các chấtchuyển hóa nhỏ, tạo điều kiện cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn

Tạo lỗ để vận chuyển anion trong lớp lipid và trên các màng plasmic

- Trên invivo:

Vai trò trên invivo của vacA còn một số chưa thống nhất nhưng có

nhiều ý kiến cho rằng phụ thuộc vào từng typ H pylori Có typ H pylori sinh

nhiều protein vacA có độc lực mạnh gây bệnh với nhiều typ tế bào

Cấu trúc gen vacA hiện nay được giải mã gồm hai vùng:

Vùng tín hiệu s (signal) có phần s1, s2, trong đó s1 chia ra s1a - c.Vùng giữa (middle): 2 typ: m1, m2, trong đó m1 chia m1a, m1b

Altherton cho rằng: các chủng s1m1 sinh nhiều protein vacA có độclực mạnh, chủng s2m2 không sinh độc tố, chủng s1m2 là kiểu trung gian [1],[21]

+ Các protein tiền viêm của H pylori.

Protein oipA (outer inflamatory protein), HP-NAP (H pylori

neutrophil activating protein) có khả năng hoạt hóa bạch cầu đơn nhân, các tếbào viêm

+ LPS và kháng nguyên Lewis:

LPS (Lipopolysacarid) là kháng nguyên thân O của H pylori.

Người ta phân ra 2 loại LPS trên H pylori là R-LPS (rough LPS) có

trọng lượng phân tử thấp và S-LPS (smooth LPS) là thể mềm có trọng lượngphân tử cao S-LPS có một chuỗi oligosacarid ở một đầu khác nhau tùychủng phân lập được

+ Các yếu tố độc lực khác:

- Các protein sốc nhiệt

- IceA (include by contact with epithelium):

1.1.3 Phân loại Helicobacter.

Hiện nay Helicobacter được xếp vào một họ riêng là họ

Helicobacteraceae Việc phân loại các Helicobacter dựa vào kích thước bộ

gen (1,67 – 1,72 Mb) và lượng nucleotid G+C, sự giống nhau của các đoạnRNA của riboxom 16S Có trên 15 loài được tìm thấy trên người và động vậttrong đó có 8 loài ở dạ dày, 6 loài ở ruột, 1 loài ở gan

Các Helicobacter quần cư ở dạ dày người thường gặp 2 loài:

H pylori: Chiếm tỷ lệ lớn nhất, liên quan đến các bệnh lý DDTT Các

H pylori được chia 4 typ dựa vào độc tố cagA, vacA [1],[20], [23].

H heimannii: do nhà khoa học Đức Heilmann phát hiện ra, trước kia vi

khuẩn có tên là Gastrospirilium hominis, cũng có hình xoắn, dài gấp 3 lần so với H pylori, có 12 lông ở đầu, chủ yếu chúng quần cư ở vùng tế bào thành niêm mạc dạ dày Vai trò gây bệnh của H heimanii chưa được biết rõ, một số

tác giả cho rằng chúng cũng gây viêm dạ dày nhưng nhanh chóng bị loại khỏi

dạ dày [1],[3],[23],[24]

1.1.4 Khả năng gây bệnh của H pylori.

+ Loét dạ dày - tá tràng.

Các LDDTT thường là kết quả của VDD mạn có nhiễm H pylori.

Nhiều nghiên cứu và theo dõi cho thấy: Không có trường hợp LDDTTnào nếu không có viêm teo niêm mạc dạ dày trước đó Mức độ và độ lan rộngcủa VDD ảnh hưởng đến vị trí ưu tiên của ổ loét ở dạ dày hay tá tràng, nguy

cơ tương đối của loét tăng gấp 10 lần nếu có viêm teo Tỷ lệ LDDTT chiếm1/5 các trường hợp có viêm teo niêm mạc

Trên 90% LTT có nhiễm H pylori, nếu diệt H pylori, tỷ lệ liền sẹo

cao, thời gian liền sẹo nhanh hơn rõ rệt, tỷ lệ tái phát giảm nhiều

Tỷ lệ nhiễm H pylori trong LDD mạn tính thấp hơn trong loét tá tràng

(chiếm 70 - 80%) tùy thời kỳ điều tra và phương pháp xét nghiệm (Sobala,Axon - 1992; Tạ Long - 1997; Nguyễn Duy Thắng - 2003) [1]

+ Rối loạn tiêu hóa chức năng

Rối loạn tiêu hóa chức năng là các rối loạn vận động dạ dày, ruột dothần kinh chi phối, sự suy giảm chức năng tiết acid [1],[17],[22]

+ Viêm dạ dày cấp

Có nhiều nguyên nhân dẫn tới viêm dạ dày cấp, nếu do H pylori

thường kèm theo thiểu toan kéo dài và dễ diễn biến thành viêm dạ dày mạn

nếu không tiệt trừ H pylori [1],[17],[22].

+ Viêm dạ dày mạn

Có một số yếu tố là nguyên nhân hoặc điều kiện thuận lợi của viêm dạ

dày mạn, tuy vậy nguyên nhân do H pylori chiếm 90% các trường hợp Các trường hợp viêm dạ dày mạn phục hồi sau điều trị diệt H pylori đã chứng minh vai trò H pylori trong cơ chế bệnh sinh của viêm dạ dày mạn [1],[22].

+ Ung thư dạ dày

Năm 1984, tổ chức nghiên cứu về ung thư (IARC) và Tổ chức y tế Thế

giới (WHO) đã xếp H pylori vào nhóm I các tác nhân gây ung thư, nó có liên

quan đến ung thư dạ dày cả thể ruột và thể lan tỏa [1],[17],[22]

+ U tế bào lympho niêm mạc dạ dày (u MALT)

Có nhiều nghiên cứu chứng minh liên quan của nhiễm H pylori và u

+ Các bệnh ngoài đường tiêu hóa

Có thể gặp một số bệnh ngoài đường tiêu hóa đã được chứng minh có

liên quan đến nhiễm H pylori như:

Viêm quanh gan do H pylori.

Thiếu máu thiếu sắt mạn tính không do giun móc

Bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim

Bệnh tự miễn: Hội chứng Sjogren, ban dạng thấp, ban xuất huyết dogiảm tiểu cầu

Ngoài da: mề đay mạn tính, trứng cá, xơ cứng bì [1], [17],[22],[30]

1.1.5 Xác định tổn thương LDD-HTT qua nội soi.

+ Loét dạ dày: Ổ loét là sự phá hủy tại một vị trí ở thành dạ dày hay tátràng sâu tới lớp cơ niêm hoặc hơn nữa, đường kính ổ loét thường > 5 mm[1],[90]

- Nội soi thấy ổ loét tròn hay bầu dục, đôi khi có hình dài, hẹp, bờ đều,phù nề và có các nếp quy tụ

- Vị trí ổ loét có thể ở thân vị phía bờ cong lớn, bờ cong nhỏ, hang vị,tiền môn vị… [1]

+ Loét HTT:

- Nội soi dạ dày tá tràng thấy có ổ loét đáy phủ fibrin màu xám, bờ phù

nề, xung quanh xung huyết, hình dạng ổ loét có thể tròn hoặc nham nhở hìnhsao hoặc như một rãnh nứt sâu…các dạng hay gặp trong loét hành tá tràng:

Ổ loét tròn, kích thước 5 – 20 mm

Loét bờ không đều, hình sao hoặc tam giác.

Loét Salami: trông như miếng súc sích, có nhiều loét nhỏ trên niêmmạc phù nề hoặc tấy đỏ

Ổ loét dài, hẹp: dạng nứt rãnh sâu ở đỉnh nếp niêm mạc tá tràng phù

nề, dài 1 – 2 mm, rộng 1 – 2 mm

Ổ loét thành sẹo: có thể lõm như hình chậu hoặc sẹo dài hẹp trên nềnbiểu mô đang tái tạo hoặc sẹo ở giữa có các nếp niêm mạc quy tụ hoặc sẹolàm co kéo và biến dạng hành tá tràng [1]

1.2 Các phương pháp xét nghiệm xác định nhiễm H pylori hiện nay 1.2.1 Các test có sử dụng thủ thuật xâm lấn.

1.2.1.1 Nội soi dạ dày, lấy mảnh sinh thiết cho xét nghiệm.

Đánh giá tổn thương tại dạ dày trong khi nội soi, các tổn thương dạ dày

do H pylori là những vết trợt mạn tính ở hang vị, viêm dạng cục nhỏ nổi lên

trên bề mặt niêm mạc dạ dày kèm những ban nhỏ ở vùng hang vị Tuy vậy,giá trị dự báo riêng của nội soi không cao và không chắc chắn, chỉ có giá trị

định hướng cho các nhà nội soi trong chẩn đoán nhiễm H pylori, cần kết hợp

với các phương pháp xét nghiệm xác định vi khuẩn

Các mảnh sinh thiết để xét nghiệm xác định H pylori được lấy khi nội

soi dạ dày, vị trí lấy các mảnh sinh thiết là: hang vị và thân vị, không sinhthiết trên tổ chức bệnh lý Số lượng mảnh sinh thiết tùy chỉ định các xétnghiệm, thường lấy 2 - 4 mảnh cho làm 1 - 3 kỹ thuật [1],[4],[26]

1.2.1.2 Test urease.

H pylori có lượng enzym urease cao gấp hàng trăm lần các vi khuẩn

đường ruột khác, do vậy người ta dùng đặc tính này để áp dụng xác định sự

có mặt của vi khuẩn trong bệnh phẩm

Test urease nhanh (RUT - Rapid urease test) được công bố vào năm

1986, đầu tiên có tên CLO test (Campylobacter like organism test) do tên đầu tiên của vi khuẩn H pylori là Campylobacter like organism.

Có nhiều loại test urease với các tên thương phẩm khác nhau tùy theonước và hãng sản xuất, hiện nay theo khuyến cáo của Hội Tiêu hóa ViệtNam, tại các nơi bệnh viện tuyến tỉnh và Trung ương, khoa Vi sinh có thể tựpha chế test urease theo công thức chung có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tựnhư các test thương phẩm

Nguyên lý của test urease: Khi đặt mảnh sinh thiết vào test, nếu trongmảnh sinh thiết có urease thì nó sẽ thủy phân urea thành amoniac và CO2,amoniac trong môi trường có nhiều nước sẽ tạo các gốc amoni (NH4+) sẽ làmtăng độ pH của môi trường, làm cho chất chỉ thị màu đỏ phenol từ khôngmàu trong môi trường trung tính sang màu đỏ cánh sen ở môi trường kiềm,

có thể thấy sự chuyển màu này bằng mắt thường

H heimannii cũng dương tính với test urease.

Test urease được khuyến cáo dùng rộng rãi tại các phòng nội soi dạdày tá tràng, độ nhạy và đặc hiệu tùy từng cơ sở, tuy vậy giá trị của chung là:độ nhạy: 89 - 95%, độ đặc hiệu: 90 - 98% [1],[22],[28],[31],[32]

1.2.1.3 Xét nghiệm mô bệnh học.

+ Vị trí lấy mảnh sinh thiết và vận chuyển bệnh phẩm

Theo hướng dẫn lấy mẫu của Sydney system: lấy 2 mảnh sinh thiết ởhang vị, 2 mảnh ở thân vị

Bệnh phẩm lấy xong được ngâm trong dung dịch formaldehyd 10% để

cố định, để trong nhiệt độ phòng và gửi tới phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh

Bệnh phẩm cố định bằng formaldehyd để được < 1 tuần Không cố

định bằng dung dịch Bauin, vì làm thay đổi hình dạng H pylori.

+ Các kỹ thuật nhuộm của chuyên nghành giải phẫu bệnh học:

Các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày được cố định, đúc parafin và cắttheo phương pháp thông thường, độ dày lát cắt từ 4 - 6 µm

Tiêu bản có thể nhuộm bằng các kỹ thuật khác nhau tùy điều kiện củatừng cơ sở Giải phẫu bệnh và sự quen dùng của người đọc tiêu bản

- Nhuộm HE (Hematoxilin - Eozin) có độ nhạy thấp hơn các kỹ thuậtkhác nhưng có thể xác định được tổn thương niêm mạc dạ dày, được ứngdụng rộng rãi tại nhiều nước, cần lưu ý là mảnh sinh thiết để xét nghiệm tìm

H pylori chỉ lấy ở hang vị và thân vị, không lấy tại vị trí ổ loét nên việc quan

tâm về tế bào học ở đây chỉ là thứ yếu

- Nhuộm bạc Warthin starry: cho hình ảnh H pylori dễ nhận biết, có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tuy vậy kỹ thuật thực hiện phức tạp và tốn kém,đôi khi có hình ảnh giả tạo, kỹ thuật này chưa được phổ biến

- Nhuộm Giemsa: là kỹ thuật đơn giản, dễ làm, không tốn kém, độ

nhạy và đặc hiệu tương tự nhuộm Warthin starry, được dùng rộng rãi

- Nhuộm Gram: cho phép phát hiện được vi khuẩn, tuy vậy với các tiêubản cắt và đúc nến thì nhuộm Gram khó thực hiện và khi đọc tiêu bản cũngkhó phát hiện vi khuẩn [33]

- Nhuộm Acridin Orange: nhuộm màu huỳnh quang có gắn chất đặchiệu với DNA của vi khuẩn, soi tìm vi khuẩn dưới kính hiển vi huỳnh quang,

nếu có H pylori sẽ thấy vi khuẩn bắt màu da cam ánh vàng Kỹ thuật này có

độ nhạy 89%, đặc hiệu 87% Tuy vậy kỹ thuật ít thực hiện vì phức tạp, phảithực hiện tại cơ sở có kính hiển vi huỳnh quang [34],[35],[36],[37]

- Nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể đánh dấu: có độ nhạy và đặc

hiệu cao (độ nhạy 95%, đặc hiệu 100%), nhưng khó thực hiện, đắt tiền [1]

+ Cách đánh giá tiêu bản:

Hình dạng điển hình của H pylori có dạng cong hoặc xoắn, dài 2,5

-4 µm, rộng 0,5 µm Vi khuẩn H pylori được nhìn thấy bám vào niêm mạc dạ

dày hoặc ở tự do trong dịch ở lòng ống tuyến, thậm chí chúng có thể ở cảkhoảng gian bào, rất ít các vi khuẩn được nhìn thấy nằm trong tế bào, một số

vi khuẩn có thể được nhìn thấy vượt qua màng đáy niêm mạc dạ dày hoặctrong hạch lympho

- Để đánh giá mức độ nhiễm H pylori, có thể bán định lượng bằng các dấu (+), có nhiều quan điểm về đánh giá mật độ H pylori khi soi kính hiển

vi, hiện nay có một số cách phân loại như sau:

Theo Hệ thống Sydney 1996 (Dixon et al):[18],[38],[39],[40]

Nặng (+++): >20 vi khuẩn/1 ống tuyến

Vừa (++): 10- 20 vi khuẩn/ ít nhất 1 ống tuyến

Nhẹ (+): <10 vi khuẩn/ 1 ống tuyến

Theo Tokunaga và CS (2000)[41]

Độ 0: Không thấy vi khuẩn

Độ 1 (+): 1 – 9 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 2 (+): 10 – 29 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 3 (+): 30 – 99 vi khuẩn/1 vi trường

Độ 4 (+): ≥ 100 vi khuẩn/1 vi trường

1.2.1.4 Nhuộm soi vi khuẩn.

Một số tác giả đề xuất kỹ thuật áp mảnh sinh thiết lên lam kính hoặctrong khi nội soi thì dùng bàn chải để chải toàn bộ niêm mạc dạ dày vùnghang vị, sau đó phết lam, để khô tự nhiên rồi cố định bằng cồn - ether sau đónhuộm Gram, huỳnh quang hoặc Giemsa

Đây là kỹ thuật thực hiện nhanh, rẻ tiền, dễ làm Tuy nhiên độ nhạy vàđộ đặc hiệu phụ thuộc vào kinh nghiệm người đọc, tùy từng kỹ thuật và một

số yếu tố ảnh hưởng khác [1],[32],[42],[43],[44]

1.2.1.5 Nuôi cấy vi khuẩn.

+ Yêu cầu khí trường

H pylori là vi khuẩn khó mọc trên các điều kiện khí trường bình

thường, các tác giả nuôi cấy thành công khi sử dụng điều kiện vi hiếu khí vớinồng độ các khí: N2: O2: CO2 là 85: 5: 10 [3],[4]

Hiện nay có một số hãng sản xuất các thiết bị tạo khí trường để nuôi

cấy H pylori như túi Aerocal C, túi Genbag microaerobic

H pylori có thể mọc được trong bình nến, có đủ độ ẩm, tuy vậy nó

mọc chậm và khuẩn lạc nhỏ hơn so với điều kiện tiêu chuẩn [12]

+ Nhiệt độ, pH môi trường

Nhiệt độ thích hợp nhất cho H pylori phát triển là 370C, nó có thể pháttriển được từ 34 - 370C

pH thích hợp nhất: 7 - 8, có thể phát triển được ở pH từ 5,5 – 8,5

+ Môi trường nuôi cấy:

Yêu cầu môi trường nuôi cấy H pylori cần có các điều kiện sau:

- Các yếu tố giàu dinh dưỡng: Các thành phần trong thạch dinh dưỡngnhư thạch máu, thạch Columbia, thạch não tim, Thayer martin

- Một số yếu tố phụ gia cần thiết: máu người 7% hoặc máu ngựa 7%hoặc máu cừu 7% cùng với một số vitamin

- Một số yếu tố ức chế vi khuẩn khác và nấm

+ Đặc điểm nuôi cấy:

- H pylori rất khó mọc và mọc chậm trên các môi trường nuôi cấy Trên các môi trường nuôi cấy, sau 48 - 72 giờ, H pylori mọc thành khuẩn lạc

nhỏ khoảng 1mm, màu trong hoặc xám nhạt, đôi khi có tan máu

- Độ nhạy của kỹ thuật nuôi cấy H pylori phụ thuộc vào điều kiện bảo

quản mẫu, môi trường nuôi cấy, khí trường, nhiệt độ Nếu các điều kiện trên

thích hợp thì có thể phát hiện được H pylori trong bệnh phẩm ở nồng độ > 5

CFU/ mg bệnh phẩm [1] Tỷ lệ nuôi cấy thành công 50 - 70% [4]

1.2.1.6 Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử.

Cho phép nghiên cứu các siêu cấu trúc của vi khuẩn, các thay đổi siêucấu trúc tế bào bị nhiễm vi khuẩn, vị trí cư trú của vi khuẩn

Nhược điểm kỹ thuật hiển vi điện tử là: độ nhạy thấp vì các lát cắt rấtmỏng không đủ đại diện, chỉ thực hiện được ở các labo có kính hiển vi điện

tử, máy siêu cắt và các hóa chất chuyên dùng, đòi hỏi có các kỹ thuật viênchyên sâu, giá thành xét nghiệm cao, không thể thực hiện thường quy trong

vi sinh lâm sàng [1],[3]

1.2.2 Các test không sử dụng thủ thuật xâm lấn.

1.2.2.1 Các test huyết thanh.

+ Xét nghiệm huyết thanh định tính:

- Xác định lượng kháng thể IgG kháng H pylori ở ngưỡng nào đó

được cho là dương tính (được quy chuẩn chung) trong máu người bệnh

- Đây là xét nghiệm đơn giản, dễ sử dụng, có thể lấy máu đầu ngón tayhoặc huyết thanh bệnh nhân, có thể thực hiện tại phòng khám

- Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm khoảng 95%, tuy nhiên nó

không đặc hiệu cho tình trạng đang bị nhiễm H pylori và không dùng để

đánh giá hiệu quả của liệu pháp kháng sinh vì kháng thể tồn tại lâu trong cơ

thể sau khi đã tiệt trừ được H pylori.

- Một số test tìm kháng thể trong nước bọt, độ nhạy 66 - 82% [45].+ Xét nghiệm định lượng kháng thể:

- Kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong giai đoạn cấp của nhiễm khuẩn.Kháng thể IgG tồn tại lâu trong máu, chỉ giảm đáng kể sau liệu pháp

tiệt trừ H pylori thành công sau 6 tháng, sau khoảng 12 tháng thì giảm gần hoàn toàn, tuy vậy nếu có tái nhiễm H pylori trở lại thì nó lại tăng cao.

- Các xét nghiệm định lượng kháng thể chủ yếu dùng trong điều tradịch tễ, ít dùng trong chẩn đoán lâm sàng do sự tồn tại của kháng thể rất lâu

- Hiện nay chủ yếu dùng kỹ thuật ELISA định lượng các kháng thểtrong máu bệnh nhân, tuy vậy cần xác định giá trị ngưỡng của lượng khángthể ở người bình thường Giá trị ngưỡng này có thể khác nhau tùy vùng địa lý

và lứa tuổi [1],[28],[48]

Một số tác giả sử dụng kỹ thuật Western blot phát hiện kháng thể IgGtrong máu hoặc trong nước bọt có độ nhạy khá cao [49],[50]

Kỹ thuật hóa miễn dịch khô cũng được dùng để xác định kháng thể

kháng H pylori, độ nhạy > 90% [1].

+ Tìm kháng thể trong nước bọt và nước tiểu

Một số nghiên cứu tìm kháng thể IgA trong nước bọt và nước tiểu

Có thể tìm kháng thể đặc hiệu kháng H pylori trong nước tiểu, theo

một số tác giả, có độ nhạy cao (nhạy 95,9%; đặc hiệu 90%), phục vụ tốt chođiều tra dịch tễ [51]

1.2.2.2 Test hơi thở.

Test hơi thở được Graham và CS công bố năm 1997, sử dung carbonđánh dấu là C13 hoặc C14 trong dung dịch urea

+ Nguyên lý: sử dụng dung dịch urea có C13 cho bệnh nhân uống vào

dạ dày, H pylori có men urease sẽ phân hủy nhanh urea thành amoni và CO2,khí CO2 có C13 đánh dấu được hấp thu vào máu và đào thải qua phổi, thu lấyphần khí đó và đo trên máy quang phổ kế để phát hiện C13 được thải ra, nếu

có mặt carbon đánh dấu trong khí thở ra thì gián tiếp đánh giá sự có mặt của

H pylori trong dạ dày người bệnh.

+ Độ nhạy và đặc hiệu: 90 – 98% [1],[22],[28],[35],[52],[53]

1.2.2.3 Test tìm H pylori trong phân.

H pylori quần cư tại dạ dày của người, vì vậy nó có thể được đào thải

qua phân, tuy vậy trong phân có hệ thống các vi khuẩn chí rất phức tạp, vì

vậy việc tìm H pylori trong phân đòi hỏi phải có quy trình xét nghiệm hợp lý

và công nghệ cao thì xét nghiệm mới có giá trị chẩn đoán

Tại Nhật, người ta sản xuất test tìm kháng nguyên vi khuẩn H pylori

trong phân, theo một số báo cáo có độ nhạy 89%, có thể sử dụng để xác định

nhiễm H pylori cho trẻ em khi không nội soi dạ dày được.

Có thể thực hiện test bằng kỹ thuật PCR phát hiện H pylori trong

phân, tuy vậy độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này theo nhiều nghiên cứu

có kết quả rất khác nhau [1],[54],[55]

1.3 Các kỹ thuật real-time PCR xác định H pylori.

1.3.1 Giới thiệu chung về real-time PCR

1.3.1.1 Nguyên lý kỹ thuật.

Là một cải biên của kỹ thuật PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerasecủa Taq DNA polymerase do Holland và CS công bố năm 1991 Là kỹ thuậtnhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành nhiều bản sao dựa vào chu kìnhiệt và kết quả khuếch đại trong ống được hiển thị cùng lúc với phản ứng

khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được qua thiết bị đọctín hiệu huỳnh quang chuyên biệt Trong phản ứng real-time PCR, thường sửdụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạchđôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen .) hoặc tác nhân dùngđánh dấu mẫu dò đặc hiệu (Taqman, Beacon ) [57],[58],[59].

1.3.1.2 Real-time PCR dùng màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA.

- Các thuốc nhuộm huỳnh quang thường dùng: Ethydium bromide,SYBR green, EVA green, LCG green…

- Nguyên lý: khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại PCR,chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tube phảnứng không phát huỳnh quang hoặc phát rất yếu khi có nguồn sáng kích thích.Khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại PCR, màu huỳnh quang chèntập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại, khi chiếu ánh sángkích thích nó sẽ phát màu mạnh hơn và ghi nhận được qua CCD camera

Hiện nay, có nhiều cải tiến về các màu huỳnh quang chèn làm khảnăng phát huỳnh quang cao hơn và không bị ức chế phản ứng Các chấthuỳnh quang này được gọi là các thuốc nhuộm huỳnh quang phân giải cao(HRM – high resolution melting dye) Có nhiều loại HRM dùng cho các loạimáy real-time PCR của các hãng sản xuất khác nhau (EVA green, BEBO,BOXTO dùng cho máy real-time PCR thông dụng, CYTO9, LC green chỉdùng cho máy của Roche…)

Các thuốc nhuộm huỳnh quang HRM cho kết quả đỉnh chảy cao và rõràng, chỉ cần phân tích trong khoảng nhiệt độ hẹp, cho phép dùng multiplexreal-time PCR, cường độ huỳnh quang mạnh, có thể dùng tốt cho chạy đamồi, phát hiện các SNP, định typ vi sinh vật [57],[59]

Hình 1: Real-time PCR dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EvaGreen [59].

1.3.1.3 Real-time PCR dùng các đầu dò đánh dấu huỳnh quang (probe).

+ Đầu dò đánh dấu huỳnh quang (probe): là những đoạn nucleotide mạch đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệutrên DNA đích Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong tube phảnứng, sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếchđại, do đó, khi có nguồn sáng kích thích thì nó sẽ phát huỳnh quang và ghinhận được qua thiết bị CCD camera Có nhiều loại probe dùng làm đầu dònhư Taqman, Beacon, các probe lai…

oligo-+ Đầu dò Taqman (Taqman probe):

Taqman probe là những oligonucleotid có trình tự bổ sung với trình tựđặc hiệu trên DNA đích, kích thước từ 24 – 30 base, đầu 5’ có gắn chấthuỳnh quang gọi là reporter, đầu 3’ gắn chất hấp phụ tương ứng gọi làquencher

Nguyên lý hoạt động của Taqman probe: khi chưa có sản phẩm khuếchđại đặc hiệu từ DNA đích thì các Taqman probe còn nguyên vẹn, do đó, chấthuỳnh quang phát ra từ đầu 5’ bị quencher ở đầu 3’ hấp phụ làm cho tubephản ứng không phát được huỳnh quang Khi bắt đầu có sản phẩm khuếchđại đặc hiệu thì Taqman probe bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm ở giaiđoạn nhiệt độ bắt cặp, khi đó enzym Taq polymerase hoạt động cắt bỏ để kéodài mồi tổng hợp lên sợi bổ sung Do đó, các reporter bị cắt rời xa cácquencher và phát được tín hiệu huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích

Có thể ghi nhận được cường độ các tín hiệu này trên CCD camera

Reporter: là chất gắn vào đầu 5’ của Taqman probe, có khả năng pháthuỳnh quang khi có ánh sáng kích thích Có nhiều loại hóa chất dùng làmreporter với độ dài sóng kích thích khác nhau như FAM, TAMRA, TET…

Quencher: là các chất có khả năng hấp phụ được ánh sáng huỳnhquang phát ra từ reporter Có hai loại là quencher phát huỳnh quang vàquencher phát nhiệt Quencher phát huỳnh quang khi hấp phụ huỳnh quang

từ reporter sẽ chuyển năng lượng hấp phụ được thành ánh sáng nhưng không

ghi nhận được trên CCD camera, tuy vậy cần lưu ý vấn đề trùng sóng vớireporter khi dùng quencher loại này Quencher phát nhiệt có tác dụng chuyểnnăng lượng hấp phụ thành nhiệt, loại này hay được dùng, đặc biệt cho thiết

kế multiplex real-time PCR do không lo vấn đề trùng bước sóng với reporter

Thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe: cần lưu ý một sốđiểm: nhiệt độ nóng chảy của mồi 55 – 600C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảycủa Taqman probe 5 – 100C Kích cỡ sản phẩm khuếch đại từ 75 – 150 bps,tuy vậy, còn phụ thuộc vào độ đặc hiệu của độ dài đích

Thiết kế Taqman probe: nên để độ dài không quá 30 base Tỷ lệ GCchiếm 30 – 80%, C nhiều hơn G Đầu 5’ gắn reporter không là G

Chương trình luân nhiệt real-time PCR dùng Taqman probe: nên chạy

2 giai đoạn nhiệt: biến tính ở 94 – 950C trong 15 – 30 giây Vừa bắt cặp vàkéo dài chuỗi ở 600C trong 30 – 60 giây

Kỹ thuật này thể hiện tính ưu việt và chính xác vì nó chỉ cho phép địnhlượng các đoạn DNA có gắn đặc hiệu, có thể đọc được kết quả khi có cả cácsản phẩm khuếch đại không đặc hiệu và có thể dùng thử nghiệm đa mồi, tuyvậy đây là kỹ thuật còn đắt tiền

Ưu điểm đầu dò Taqman: chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi có sự laiđặc hiệu giữa đầu dò và đích Đầu dò có thể được đánh dấu với các chất phátmàu khác nhau trong cùng một phản ứng, do vậy có thể thực hiện đượcmultiplex PCR Không phải xử lý số liệu sau khi thực hiện PCR, dễ thực hiệnphản ứng

Nhược điểm đầu dò Taqman: với mỗi thử nghiệm khác nhau phải thiết

kế kích cỡ probe khác nhau [57],[58],[59]

Hình 2: Kỹ thuật real-time PCR với mẫu dò Taqman

Denature – biến tính; Anneal – bắt cặp; Extend – kéo dài chuỗi [59]

+ Đầu dò phân tử Beacon (Beacon probe):

Phân tử Beacon là probe có kích thước 25 – 40 base, đầu 5’ gắnreporter, đầu 3’ gắn quencher Ở giữa probe là trình tự bổ sung đặc hiệu trênsợi DNA đích, hai đầu có trình tự bổ sung nhau 5 – 6 base làm cho probe gắnhai đầu với nhau như cái kẹp tóc

Hình 3: Kỹ thuật real-time với mẫu dò beacon.

1 - Mô phỏng probe Beacon; 2 – Probe Beacon gắn vào DNA đích [59].

+ Các probe lai (Hybridization probe):

Nguyên tắc của kỹ thuật là dùng 2 probe, probe lai 1 có đầu 3’ gắn chấtphát huỳnh quang D (donor), probe lai 2 gắn có đầu 5’ gắn chất phát huỳnhquang A (acceptor) và một gốc phosphat ở đầu 3’ Hai probe được thiết kế

sao cho khi bắt cặp trên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 1 chỉ cách đầu 5’của probe lai 2 từ 3 – 5 base Phải chọn chất D và A sao cho có cùng độ dàisóng kích thích, CCD camera sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang từ A,còn từ D bị các kính lọc chặn lại.

Real-time PCR dùng các probe lai có thể ứng dụng để định danh sinh vật,định lượng tác nhân đích, xác định genotyp hay các sai khác nucleotid (SNP)

Hình 4: Hoạt động của probe lai

R1 – Chất phát huỳnh quang D của probe lai 1; R2 – Chất nhận huỳnh quang [59].

+ Kỹ thuật real-time PCR có thể còn được sử dụng với nhiều loạiprobe khác tùy mục đích của người sử dụng như: Eclise probe, Scorpionprimer, các sản phẩm khuếch đại tự phát quang… [57],[58],[59]

1.3.2 Một số nghiên cứu xác định H pylori sử dụng real-time PCR.

+ Trên thế giới: một số nghiên cứu bắt đầu sử dụng real-time PCR xác

định H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày từ năm 2002 [4].

- Năm 2002, Qiang He và CS sử dụng real-time PCR cho phát hiện và

định lượng H pylori mảnh sinh thiết dạ dày Kết quả kỹ thuật này phát hiện

H pylori có độ nhạy cao hơn, có thể phát hiện được 103 vi khuẩn trong một

lần thử Tác giả sử dụng đoạn mồi của gen ureC có độ dài 30 bp [4].

- Gurtner và CS (2004) [80], dùng cặp mồi của gen ureA có độ dài 77

bp cho xác định H pylori trong mảnh sinh thiết và trong phân Kết quả của tác giả thấy độ nhạy kỹ thuật real-time PCR xác định H pylori trong mảnh

sinh thiết là 100%, trong phân là 98% Độ đặc hiệu của hai kỹ thuật là 98%

- Tankovic và CS (2007) [81], thực hiện real-time PCR xác định H.

pylori và phát hiện đột biến kháng clarithromycin dựa trên đoạn gen 23S

rRNA Tác giả thấy kỹ thuật real-time PCR phát hiện H pylori trong mảnh

sinh thiết dạ dày có độ nhạy 98,2% và độ đặc hiệu 97,5% cao hơn kỹ thuật

mô bệnh học (p < 0,001)

- Mergraud và CS (2007) [4] phân tích việc sử dụng các đoạn gen đặc

hiệu sử dụng cho xác định H pylori: mẫu vi khuẩn sử dụng có thể là trong

mảnh sinh thiết đã được đúc nến, chủng vi khuẩn nuôi cấy, bệnh phẩm quệt

amidal, dịch dạ dày hoặc thậm chí cả phân có thể phát hiện được H pylori.

Tác giả đã chỉ ra các gen được nghiên cứu như sau: [4]

Bảng 1.2: Các gen của H pylori, năm nghiên cứu, kỹ thuật dùng nghiên cứu.

Giải trình tự ngẫu nhiên 1991 203

+ Tại Việt Nam, một số báo cáo về sử dụng kỹ thuật real-time PCR

cho xác định H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày như:

- Trần Thiện Trung (năm 2013) [98], sử dụng multiplex real-time PCR

với các đoạn của gen cagA và vacA cho xác định H pylori trong mảnh sinh

thiết dạ dày, so sánh kết quả với test huyết thanh và test urease thấy: mức phùhợp của PCR và test huyết thanh là 93,0% (Kappa = 0,8)

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến điểm sử dụng real-time PCR.

+ Kỹ thuật phát hiện SNP (single nucleotid polymorphism) dùng màuhuỳnh quang chèn:

- Phải dùng các màu HRM (high resolution melting dye) và thực hiệnchương trình phân tích HRM khi kết thúc chương trình luân nhiệt

Các màu chèn HRM không ức chế phản ứng PCR, cường độ pháthuỳnh quang rất mạnh (đến 250 lần so với dạng tự do trong dung dịch) Dovậy, khi phân tích đường cong chảy chỉ cần ở dải nhiệt hẹp (trong khoảng

50C) Kết quả biểu đồ đỉnh chảy đủ độ phân giải để phân biệt sự khác biệtmức nucleotide của sản phẩm khuếch đại trong tube phản ứng

- Allele Specific real-time PCR:

Đây là kỹ thuật real-time PCR được tối ưu hóa primer và các điều kiệnphản ứng cho phát hiện các đột biến điểm đặc trưng cho alen (các trạng tháikhác nhau của cùng một gen)

Để phát hiện đột biến điểm cần tìm ra nhiệt độ lai khắc nghiệt sao chosự khác biệt của một nucleotid tại đầu 3’ tận cùng của primer so với khuônDNA cũng đủ cho sự bắt cặp và khuếch đại của primer không thể xảy ra Dựatrên tín hiệu phát huỳnh quang phân biệt chủng đột biến và chủng hoang dại

Khi thiết kế primer để phát hiện đột biến điểm, cần quan tâm tớinucleotid cuối cùng ở đầu 3’OH Sự sai khác của những nucleotid này so vớiDNA khuôn làm primer không thể khuếch đại Do hoạt động của enzyme Taqpolymerase hoạt động bổ sung nucleotid theo hướng từ đầu 5’ đến đầu 3’ Dovậy, nó lắp nucleotid vào đầu 3’ tận cùng đến hoàn thành quá trình khuếchđại Sự sai khác một trong ba nucleotid cuối cùng ở đầu 3’ của primer so vớiDNA khuôn sẽ ức chế quá trình này Do đặc điểm này, người ta thiết kế

primer và tối ưu hóa phản ứng real-time PCR sao cho phân biệt được các đột

biến điểm

Hình 5: Mồi bắt cặp với đột biến [57]

ASP – mồi đặc hiệu cho alen; LST – Probe TaqMan đặc hiệu cho locus;

LSP – mồi đặc hiệu cho locus.

Trong thiết kế một mồi bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và cómột lỗi ở nucleotid thứ nhất tính từ đầu 3 ‘OH khi bắt cặp với trình tự hoang

dại, đôi khi vẫn có thể kéo dài ở chủng không đột biến với tỉ lệ thấp hơn Đểkhắc phục tình trạng trên, có thể gia tăng nhiệt độ bắt cặp của mồi để sảnphẩm đặc hiệu hơn hoặc sử dụng mẫu dò bắt cặp với đột biến điểm.

Hình 6: Mẫu dò bắt cặp với đột biến [59].

V – màu VIC; F – Màu FAM; Q – Quencher.

+ Kỹ thuật dùng probe phát hiện các sai khác ở mức nucleotid:

- Real-time PCR dùng Taqman probe: để phát hiện được các SNP, phảithiết kế các Taqman probe mang các chất huỳnh quang R khác nhau bắt cặptrên cùng vị trí của sản phẩm khuếch đại Các probe này có trình tự tươngứng với các trình tự SNP Trong giai đoạn bắt cặp, probe nào có trình tựtương thích nhất với trình tự đích sẽ được bắt cặp và sau đó enzym Taqpolymerase thủy giải Do vậy, bộ phận thu tín hiệu sẽ ghi nhận được

Hình 7: Cơ chế xác định khác biệt alen dùng Taqman probe [59].

R1 – đầu phát của probe1; Q1 – đầu dập của probe1;

R2 – đầu phát của probe2; Q2 – đầu dập của probe2.

- Kỹ thuật MGB Taqman real-time PCR (real-time PCR với mẫu dòTaqman được gắn MGB - dihydrocyclopyrroloindol tripeptid minor groovebinder): Taqman MGB probe thường được dùng trong các thử nghiệm phân

biệt các alen, đặc biệt, khi dùng Taqman probe có số nucleotid trên 30 MộtTaqman MGB probe có hai phần:

Phần dập (quencher) ở đầu 3’: dụng cụ đo lường tín hiệu huỳnh quang

có thể đo chính xác hơn vì đầu dập không phát tín hiệu

Phần MGB gắn đầu 3’: làm tăng nhiệt độ nóng chảy của đầu dò, chophép dùng được các đầu dò ngắn hơn Do vậy, Taqman MGB probe thể hiệnđược sự khác biệt mạnh hơn giá trị nhiệt độ nóng chảy giữa các probe khônggắn MGB, kết quả sẽ chính xác hơn trong phân biệt các alen [57],[59]

Hình 8: Cấu trúc và hoạt động của MGB Taqman probe [59].

ASP – primer đặc hiệu cho alen ASB – MGB đặc hiệu cho alen

LST – Taqman probe đặc hiệu cho locus LSP – primer đặc hiệu cho locus.

- Real-time PCR dùng đầu dò lai phát hiện các SNP: kỹ thuật này ưuđiểm hơn Taqman probe trong phát hiện genotyp, đặc biệt, các genotyp khácbiệt cả trình tự đặc trưng và các khác biệt dòng hay các đột biến trong quátrình phát triển Thiết kế probe lai cho genotyp dễ dàng hơn Taqman probe

1.3.4 Một số nghiên cứu xác định đột biến điểm của H pylori sử dụng real-time PCR.

+ Nhiều tác giả nghiên cứu thành công việc sử dụng các primer đặc

hiệu cho H pylori và phát hiện các đột biến điểm đề kháng clarithromycin

của vi khuẩn này ứng dụng trên máy real-time PCR chạy trên cùng một lần

- Oleanstro và CS (2003) xác định H pylori và đột biến điểm của 23S

rRNA kháng clarithromycin sử dụng mồi HPYA và HPYS từ Ngân hàng gen(U27270) Thực hiện phản ứng trên máy real-time PCR và sử dụng phươngpháp phân tích đường cong chảy (melting curve analysis) của đoạn 267 bp23S rRNA gen phát hiện các chủng đột biến A2142C, A2142G, A2143G cho

kết quả phát hiện đồng nhất với phương pháp PCR hạn chế chiều dài cácđoạn đa hình (RFLP – restriction fragment length polymorphism) [79].

1.4 Các phác đồ diệt H pylori và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn 1.4.1 Các phác đồ điều trị diệt H pylori.

Bảng 1.3: Các phác đồ diệt H pylori.

Tên phác đồ dùng (ngày) Thời gian Cách dùng

5 ngày PPI + C + TiPhác đồ 4 thuốc không có Bismuth 10 PPI + A + C + M/Ti

Giải thích chữ viết tắt:

PPI: ức chế bơm proton (proton pump inhibitor).

1.4.2 Khả năng kháng clarithromycin của H pylori.

- Đề kháng clarithromycin của H pylori có thể do đột biến gen của vi

khuẩn, do cơ chế bơm ngược, giảm tính thấm của màng Theo CLSI (2013):MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của clarithromycin với các vi khuẩn khó mọc

là 4 - 16 mg/ lit, với khoảng thay đổi rất rộng (2 - 256 mg/ lit) Do tỷ lệ H.

pylori kháng clarithromycin rất cao, một số tác giả qua các nghiên cứu cho

thấy MIC của clarithromycin với H pylori là 16 - 64 mg/ lit [56],[110]

- Đột biến của H pylori tại vùng domain V của 23S rRNA là cơ chế

kháng tiên phát với clarithromycin của vi khuẩn

- Một số vị trí đột biến tại 23S rRNA của H pylori được nhiều nhà

khoa học nghiên cứu là các đột biến thay thế nucleotid Các vị trí đột biến

làm tăng cao MIC của clarithromycin với H pylori bao gồm (A2142G,

A2142C, A2143G, A2144G) làm cho nồng độ MIC của thuốc tăng (> 64 mg/

lit) Một số đột biến khác tại các nucleotid gần đó cũng ảnh hưởng tới tăng

nồng độ MIC của clarithromycin với H pylori nhưng thấp hơn 64 mg/lit như

(A2115G, G2141A, A2142T, T2717C, T2182C), do các vị trí này ít gắn vớipeptidyl transferase [106],[110]

- Tại Việt Nam, một số vị trí đột biến được các tác giả đề cập đến như:23S rRNA A2142G và A2143G (Ngô Tất Trung - 2012); 23S rRNAA2143G, A2143T, T2182C (Nguyễn Đức Toàn - 2012)

- H pylori có 2 gen 23S rRNA, đột biến thể xảy ra ở cả hai (đột biến

đồng hợp tử - homogenous mutation) hoặc có thể xảy ra ở một gen (đột biến

dị hợp tử - hetero mutation) Các đột biến dị hợp tử cũng có làm tăng nồng độ

MIC của H pylori với clarithromycin, tuy vậy, nó tăng MIC không cao bằng

đột biến đồng hợp tử và dễ chuyển sang trạng thái đột biến đồng hợp tử Sự

chuyển đổi dễ dàng chứng tỏ khả năng tái tổ hợp đồng hợp của DNA của H.

pylori xảy ra mạnh [106],[110].

+ Cơ chế của các đột biến kháng clarithromycin của H pylori:

- H pylori có kích cỡ bộ gen nhỏ hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, tuy vậy, tần suất đột biến gen của H pylori cao hơn các vi khuẩn khác rất

nhiều Hiện nay, chưa thấy có nhiều nghiên cứu giải thích các cơ chế này của

H pylori do đây là vi khuẩn mới được tìm hiểu

Một số giả thuyết về tỷ lệ đột biến cao của H pylori như sau:

- Do đảo đoạn trong phân tử DNA của H pylori.

- Do chuyển đoạn giữa các gen trong cùng phân tử DNA

- Do đột biến các nucleotid trong gen, hay gặp ở các nucleotid thứ 3của cặp nucleotid

- Do trao đổi các tranposon của H pylori với các vi khuẩn khác cùng

quần cư với nó

- DNA của H pylori có thể tự biến đổi do tác động của men methylase

nội nhân Các quá trình oxy hóa dư lượng nucleotid bởi các chất H2O2, cácgốc superoxid, gốc OH - có thể dẫn đến sự thay thế nucleotid của H pylori

- Đột biến thay thế nucleotid do hiện tượng tautomerism của các

nucle-otid trong H pylori (hiện tượng các nuclenucle-otid ở trạng thái dễ bị thay thế).

- Các cơ chế phân tử của đột biến kháng clarithromycin của H pylori

là rất phức tạp Hiện nay đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu

+ Tỷ lệ kháng clarithromycin nguyên phát của H pylori trên thế giới

còn thấp (từ 0 – 14%), tuy vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu ghi nhận có sựgia tăng sự kháng thuốc ở nhiều nước và vùng lãnh thổ Tình trạng khángclarithromycin trung bình khoảng 20%, tại Mỹ: 7-11%, Pháp: 43%, Hà Nội(2001) 0%, TP Hồ Chí Minh (2001): 20% [18] Tại các tỉnh miền Trung –Tây Nguyên (2012): 42,9% [16] Tại Pháp (2004): 23 – 41,6% [65],[66]

+ Dịch tễ học tỷ lệ các kiểu đột biến kháng clarithromycin

H pylori kháng clarithromycin liên quan đến đột biến AG trong

vùng bảo tồn domain V trên gen 23S rRNA tại vị trí 2143G và 2144G Vị trí

đột biến này có liên quan đến đột biến AG trên vùng 23S rRNA của E coli

tại vị trí 2058 và 2059 Trong khi đó, 93% đột biến kháng thuốc được phânlập là do đột biến AG và 7% là do đột biến AC tại vị trí 2143 [80], [82],[83],[85]

- Tỷ lệ các kiểu đột biến tại 23S rRNA của H pylori kháng

clarithro-mycin khác nhau tùy từng vùng, từng thời điểm thống kê, phương phápnghiên cứu điều tra

Gerrits tổng hợp các tài liệu đến năm 2004 thấy tỷ lệ một số kiểu độtbiến tại các khu vực như sau [110]:

Bảng 1.4 Tỷ lệ các kiểu đột biến kháng clarithromycin

Vùng địa lý Tỷ lệ đột biến tại 23S rRNA

+ Các nghiên cứu trên thế giới:

- Năm 1997, James Versalovic và CS nghiên cứu về H pylori kháng

clarithromycin gây ra do một số đột biến trên gene 23S rRNA Trong

nghiên cứu này, các tác giả thấy 91,5% kháng clarithromycin của H.pylori

gây ra bởi đột biến A2143G (tên trước đây là A2058G) Nghiên cứu cũngcho thấy đột biến A2143G thường gặp khi test bằng MIC vượt trên ngưỡng

64mg/ lit và là một trong những đột biến chính kháng clarithromycin của H.

pylori [78].

- Oleastro và CS thực hiện năm 2003 cho thấy việc diệt H pylori thất

bại là do vi khuẩn này kháng với clarithromycin Việc kháng này chủ yếu gây

ra bởi những đột biến điểm trên 2 vị trí của gen 23S rRNA (A2142C,A2142G và A2143G) Các tác giả sử dụng kỹ thuật real-time PCR phát hiệnđồng thời cả 3 đột biến này với probe huỳnh quang [79]

- Các nghiên cứu của Lascol (2003), Gurtner (2004) sử dụng real-time

PCR với các đoạn mồi đặc hiệu của 23S rRNA cho xác định H pylori và

phân tích đường cong chảy các đoạn dò đột biến xác định kháng

clarithro-mycin của H pylori độ nhạy và đặc hiệu 100% [80].

- Kim và CS (2002) dùng kỹ thuật RFLP – PCR (restriction fragmentlength polymorphism – PCR) phát hiện đột biến 2143 trên vùng gen 23SrRNA của vi khuẩn Enzyme được sử dụng là BbsI và BsaI

- Liu và CS (2007) nghiên cứu tần suất đột biến 23S rRNA A2143G

của H pylori trên các bệnh nhân không có tiền sử dùng clarithromycin ở

Trung Quốc cho thấy đột biến A2143G dẫn đến sự kháng clarithromycin Đểphát hiện kháng clarithromycin, tác giả thu 307 mẫu bệnh phẩm và thực hiệnkiểm tra trên DNA bằng các kỹ thuật PCR, ELISA và test hơi thở (UBT),trong đó kỹ thuật PCR có thể phát hiện đột biến điểm trên gen 23S rRNA

- Nhóm các nhà khoa học ở châu Âu (2007) nghiên cứu sử dụng

real-time PCR để phát hiện đột biến kháng clarithromycin của H pylori trên 518 mẫu bệnh phẩm (đã được chẩn đoán nhiễm H pylori trước đó), đưa ra kết

luận rằng real-time PCR cho hiệu quả đáng tin cậy về độ nhạy và độ đặc

hiệu, đây có thể sẽ là kỹ thuật thường quy để chẩn đoán H pylori [81].

Raymond và CS (2004), nghiên cứu về các điểm đột biến gen của

những chủng H pylori được phân lập kháng clarithromycin ở trẻ em Pháp.

Kháng clarithromycin tại các điểm đột biến gen được đánh giá bằng kỹ thuậtPCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism) và RAPD DNA(random amplifide polymorphism) trên 50 trường hợp thu thập từ giữa năm

1993 - 2004 tại Pháp Kết quả kháng clarithromycin được ghi nhận trong

23% (50/217) trường hợp tại 2 điểm đột biến gen 23S rRNA của H pylori là

A2143G và A2142G, trong đó điểm đột biến A2143G chiếm ưu thế trongkháng clarithromycin ở trẻ em Pháp, có 2 trường hợp có 2 điểm đột biến ở 2clone khác nhau trong cùng một mẫu sinh thiết Như vậy, theo các tác giả, tỷ

lệ kháng clarithromycin ở trẻ em Pháp từ 1993-1996 tăng lên theo thời gian

từ 18,6% tới 41,6% ở giai đoạn 2001-2004 [81],[82]

Một nghiên cứu tại Malaysia (2009) cho thấy tỷ lệ đột biến đề kháng

clarithromycin của H pylori rất thấp (4/187) chủng phân lập được, trong đó

đột biến chủ yếu là A2142G và A2143G [83]

- Tại Ý (2011), một nghiên cứu đa trung tâm về đề kháng

clarithro-mycin của H pylori được thực hiện bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng đầu

dò Taqman cho kết quả tỷ lệ H pylori có đột biến đề kháng với

clarithro-mycin là 9,9%, các kiểu đột biến gồm: A2143G: 52.0%; A2142G: 34.6%;A2142G + A2143G: 11.6% trong các trường hợp có đột biến [84].

- Tại Tây Ban Nha (2012) [27], một nghiên cứu so sánh giữa kỹ thuậtreal-time PCR sử dụng Taqman probe phát hiện các đột biến điểm khángclarithromycin so sánh kết quả với kỹ thuật E-test cho thấy: 10/41 trường hợpthử E-test có kết quả nhạy cảm nhưng xét nghiệm PCR thấy có đột biếnkháng thuốc; 7/47 ca thử E-test có đề kháng clarithromycin nhưng khôngphát hiện đột biến kháng thuốc Như vậy có thể ngoài cơ chế chính khángclarithromycin do đột biến tại các điểm của 23S rRNA còn có thể do một số

cơ chế khác làm cho H pylori trở nên nhạy cảm hay đề kháng Kết quả này

cũng tương tự nghiên cứu của Agudo và CS năm 2010 tại New York [107]

+ Một số nghiên cứu tại Việt Nam:

Tại Việt Nam, H pylori có thể được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác

nhau Nghiên cứu về đề kháng clarithromycin bằng các kỹ thuật real-timePCR mới được triển khai gần đây

- Nguyễn Đức Toàn và CS (2011) sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen

trực tiếp với các chủng H pylori lấy từ bệnh nhân bị loét tá tràng thấy: có 3

dạng đột biến tại 2 vị trí: A2143G (26,7%); A2143T (6,7%); T2182C(80,0%); không thấy có đột biến tại vị trí 2142; tỷ lệ có 2 đột biến kết hợp là:A2143G + T2182C (13,3%); A2143T + T2182C (6,7%) Nghiên cứu nàykhác với kết quả của nhiều tác giả trong và ngoài nước là tỷ lệ đột biếnT2182C rất cao [86]

- Ngô Tất Trung và CS (2011), sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu haihướng có tích hợp hệ thống khuếch đại đột biến chịu nhiệt (ARMS –Amplification refractory mutation system), với bộ mồi xác định các đột biếntại mỗi vị trí A2142G/C và A2143G với 4 primer, xác định đồng thời sự có

mặt của vi khuẩn H pylori và các đột biến tại 23S rRNA tại A2142G và

A2143G kháng clarithromycin [87]

1.5 Thông tin sơ lược về địa điểm tổ chức nghiên cứu.

Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang là bệnh viện đa khoa tuyến cuốicùng của ngành y tế tỉnh Bắc Giang Có 650 giường bệnh nội trú, 32 khoaphòng, thực hiện khám chữa bệnh cho nhân dân trong tỉnh và các vùng lâncận của các tỉnh khác

Hàng tháng, tại khoa khám bệnh khám cho 1000 - 1500 bệnh nhân cócác dấu hiệu bệnh dạ dày tá tràng, chỉ định nội soi chẩn đoán 900 - 1000trường hợp có liên quan đến dạ dày tá tràng

Hiện tại, Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang có đầy đủ đội ngũ cán bộ,trang thiết bị, máy phục vụ cho việc khám, chẩn đoán, điều trị cho bệnh nhânmắc các bệnh về dạ dày tá tràng và các bệnh tiêu hóa khác

Do số lượng bệnh nhân mắc loét DD-HTT đến khám và điều trị tạiBệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang với số lượng lớn hàng tháng, nhu cầu về

xét nghiệm H pylori và đặc biệt cho việc xác định khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn này để giúp cho định hướng sử dụng kháng sinh diệt khuẩn là rấtlớn Hiện nay, tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang chưa có nghiên cứu về

xét nghiệm xác định vi khuẩn H pylori, đặc biệt là nghiên cứu về khả năng kháng clarithromycin (là kháng sinh có trong nhiều phác đồ điều trị diệt H.

pylori) Đây là những lý do để nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu.

2.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu.

- Nghiên cứu được tiến hành tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang

- Thời gian nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 5/ 2014

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu.

2.1.2.1 Đối tượng nghiên cứu.

Gồm những bệnh nhân loét dạ dày hoặc loét hành tá tràng được pháthiện qua nội soi tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang

2.1.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.

Lấy mẫu toàn bộ (trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 5/ 2014) với các bệnh nhân có đủ các tiêu chuẩn sau:

- Có loét dạ dày hoặc loét hành tá tràng: Xác định qua nội soi

- Lấy một mảnh sinh thiết tại hang vị qua nội soi cho nghiên cứu

- Mảnh sinh thiết được xử lý theo quy trình kỹ thuật của real-time PCR

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ.

- Mảnh sinh thiết không đảm bảo tiêu chuẩn (vị trí lấy, kích cỡ)

- Bệnh nhân bỏ nghiên cứu

- Loét tâm vị dạ dày hoặc LDDTT cấp do ngộ độc hóa chất

- Ung thư dạ dày thể loét

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu.

2.1.3.1 Các thiết bị, máy của phòng Nội soi dạ dày tá tràng – Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang.

- Máy nội soi: Pentax EPK-P và EPK150C

- Kìm sinh thiết: kèm theo máy lấy mảnh sinh thiết kích cỡ 2 mm3

2.1.3.2 Các thiết bị, máy và sinh phẩm của khoa Vi sinh – bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang.

- Máy, sinh phẩm cho xét nghiệm PCR:

Máy xét nghiệm real-time PCR MX3005P ( Agilent – Stratagene)

Tủ an toàn sinh học Biosafety cabinet class 2B (Essco)

Bộ test real-time PCR xác định H pylori (LightPower iVAHPL rPCRPlus Kit - tiêu chuẩn WHO-GMP, ISO 9001-2008), công ty Việt Á cung cấp

Sử dụng đoạn mồi 115 bp từ đoạn gen 16S rRNA

Bảng 2.1: Mô tả đặc tính mồi kit real-time PCR xác định H pylori

Tên

mồi Trình tự (5' - 3')

Chiều dài (bp)

Self Dimer ΔGG (kcal/mole)

-Hairpin ΔGG (kcal.mole-1)

Chiều dài sản phẩm (bp)

16F

ATTACTGACGCTG

115 16HpR

NKA2142C-TQPCR mix: probe 2142A – FAM, 2143C – HEX

NKA2142G-TQPCR mix: probe 2142A – FAM, 2142G – HEX

NKA2143G-TQPCR mix: probe 2143A – FAM, 2143G – HEX

NKT2182C-TQPCR mix: probe 2182T – FAM, 2182C – HEX

NKChứng (+): A2142C, A2142G, A2143G, T2182C

Chứng âm: TEX1

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu.

Nghiên cứu ngang, tiến cứu