XÁC ĐỊNH HELICOBACTER PYLORI TRONG MẢNH SINH THIẾT DẠ DÀY HÀNH tá TRÀNG VÀ PHÁT HIỆN đột BIẾN KHÁNG CLARITHROMYCIN BẰNG REAL TIME PCR TẠI BỆNH VIỆN đa KHOA TỈNH bắc GIANG

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dày tá tràng (LDDTT) bệnh phổ biến y học biết đến từ lâu Có nhiều giả thuyết nguyên nhân gây bệnh Tuy vậy, đến năm 1983, qua nhiều nghiên cứu, Marshall Warren chứng minh vai trò gây bệnh Helicobacter pylori (H pylori) LDDTT, từ đó, có nhiều cơng trình nghiên cứu H pylori đời, quan điểm điều trị LDDTT kết điều trị thay đổi nhiều Với sự phát triển ky thuật nội soi tiêu hóa, nay, để chẩn đốn điều trị LDDTT đồng nghĩa với việc nội soi xác định tổn thương xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm H pylori [1] H pylori vi khuẩn với đặc điểm: bắt màu Gram (-); hình xoắn, cong; sinh enzym urease ngoại bào mạnh; đặc biệt, khó nuôi cấy, độ nhạy ky thuật nuôi cấy thấp (50%), thời gian trả kết nuôi cấy kháng sinh đồ chậm (7 - 14 ngày) Để xác định nhiễm H pylori, y học sử dụng nhiều ky thuật, có hai nhóm ky thuật chính: Các ky thuật có sử dụng thủ thuật xâm lấn, dựa vào nội soi dày, lấy mảnh sinh thiết cho ky thuật (test urease, mô bệnh học, nhuộm soi, nuôi cấy, ky thuật PCR ) Thứ hai ky thuật không xâm lấn (test huyết IgM, định lượng IgG, test thở, test tìm H pylori nước tiểu phân ) Mỡi ky thuật có giá trị riêng xác định nhiễm H pylori [1] Real-time PCR phát H pylori mảnh sinh thiết dày dựa vào xác định đoạn gen đặc hiệu vi kh̉n, ky thuật đại, có đợ nhạy đặc hiệu cao (từ 95 – 100%), thời gian trả kết nhanh, bệnh phẩm khơng địi hỏi phải bảo quản đặc biệt Ngồi ra, cịn phát một số đột biến liên quan đến kháng kháng sinh vi khuẩn [1] Do đặc điểm bệnh LDDTT H pylori trên, nay, điều trị LDDTT hướng dẫn sử dụng theo phác đồ, chất phối hợp kháng sinh diệt H pylori Trong phác đồ điều trị LDDTT diệt H pylori, clarithromycin kháng sinh chủ yếu sử dụng Clarithromycin thuốc gắn vào peptydyl transferase thuộc vùng domain V VI 23S rRNA H pylori, làm ngừng tổng hợp protein vi khuẩn H pylori kháng lại clarithromycin bằng nhiều chế, chế chính đột biến thay một số nucleotid ở gen 23S rRNA làm giảm lực gắn clarithromycin Hiện nay, H pylori kháng lại clarithromycin nhiều, tỷ lệ kháng thuốc ở khu vực ở thời điểm không nhau: Trung Quốc (65,4% - 2009); My nước Châu Âu (> 20% - 2010); Ba Lan, Cameroon (gần 50% - 2010); Việt Nam (> 20% - 2009 - 2012), có khu vực Việt Nam có > 50% chủng H pylori kháng clarithromycin [2] Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang bệnh viện tuyến cuối cùng ngành y tế tỉnh Bắc Giang Tại đây, bệnh nhân VLDDTT định nợi soi chẩn đốn Khoa Vi sinh có trang thiết bị đáp ứng nhu cầu xét nghiệm trực tiếp, nuôi cấy, phân lập real-time PCR Tuy nhiên, việc áp dụng real-time PCR xác định H pylori lâm sàng hạn chế Các bác sy thường định nhuộm soi test urease cho xác định vi khuẩn H pylori mảnh sinh thiết dày kê đơn theo phác đồ điều trị Hơn nữa, việc nuôi cấy làm kháng sinh đờ với H pylori gặp nhiều khó khăn thời gian chờ kết dài độ nhạy thấp Hiện nay, Bắc Giang chưa có cơng trình nghiên cứu đánh giá H pylori kháng kháng sinh, đặc biệt kháng clarithromycin Từ thực tế trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Xác định H pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân loét dạ dày tá tràng real-time PCR tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang Xác định tỷ lệ H pylori có đột biến kháng clarithromycin kỹ thuật real-time PCR CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm của vi khuẩn H pylori 1.1.1 Vài nét về lịch sử nghiên cứu Các bệnh dày tá tràng nghi ngờ có liên quan đến nhiễm khuẩn từ lâu Tuy vậy, đến năm 1983, hai tác giả Marshall Warren bằng nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh vi khuẩn H pylori nguyên nhân chính liên quan đến bệnh viêm loét dày tá tràng, ung thư dày, viêm dày trào ngược, rối loạn tiêu hóa dày… giải Nobel y học năm 2005 [1] 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn H pylori 1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc, tính chất bắt màu của vi khuẩn H pylori H pylori có hình xoắn, cong, kích thước 0,3-1 x 1,5-5 µm H pylori chuyển dạng hình cầu gặp mợt số điều kiện khơng thuận lợi hoặc sau dùng một số kháng sinh Morozov gặp vi khuẩn chuyển dạng hình cầu ở bệnh nhân điều trị metronidazol omeprazol ở ngày thứ - Khi ở dạng hình cầu, hoạt đợng chuyển hóa vi kh̉n giảm mạnh, khơng sinh urease, vi khuẩn chuyển sang dạng hoạt đợng có điều kiện thích hợp Goodwin gọi “thể ngủ” H pylori, dạng giúp vi khuẩn tồn lâu ở môi trường không thuận lợi [1],[3] H pylori có - lơng ở mợt cực tế bào, lơng vi kh̉n nhuộm bằng phương pháp Kodaka (nhuộm âm với 1% acid phosphotungstic) Khi cắt ngang một lông, Susumo Ito (1965) nhận thấy vỏ bọc sợi lơng có 15 sợi tách biệt nhau, mỗi sợi kích thước 30 nm, dài - µm Tính chất bắt màu vi khuẩn tùy thuộc phương pháp nhuộm: Nhuộm Gram, vi kh̉n có màu Gram (-), nḥm HE bắt màu tím đỏ, nhuộm Giemsa hoặc Diff-Quik cho màu xanh thẫm, nhuộm Warthin-starry vi khuẩn bắt màu đen đậm, nhuộm huỳnh quang vi khuẩn bắt màu da cam [1],[3] 1.1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học - Các tính chất sinh vật hóa học chung H pylori: Bảng 1.1: Mợt số tính chất sinh vật hóa học H pylori [4] STT 10 11 Tính chất Catalase Oxydase Urease Phosphatase kiềm γGT (γ Glutamyl transferase) Lipase Protease Esterase C4 - C12 DNase Hipuricase Sinh Nitrate Đặc điểm + + ++ + + + + + + Âm tính Âm tính Westblot Majewski thấy một số chủng H pylori đột biến khiến vi khuẩn không sinh catalase Mendz CS nghiên cứu chuyển hóa pyruvate cho thấy, H pylori có ch̃i chuyển hóa vi kh̉n kỵ khí, thực tế H pylori vẫn cần oxy H pylori có đường chuyển hóa kiểu Entner - Doudonoff, giống cách chuyển hóa ở sinh vật cổ xưa H pyloricó vịng chuyển hóa urea, cách chuyển hóa chủ yếu ở tế bào có nhân điển hình, ít gặp ở vi khuẩn Schafer (Đức) xác định một chức khác biệt H pylori vận chuyển ion men type P vận chuyển ion sắt clone khác vận chuyển ion Cu2+ Ni2+ 1.1.2.3 Đặc điểm gen - Bộ gen chủng H pylori tương đối đồng nhất, khoảng từ 1,6 – 1,72 Mb (Taylor, Chang Easton), với tỷ lệ G + C từ 35 đến 40% Gần tất chủng H pylori phân lập có hai plasmid pHPM180 (3,5 kb) pHel1 (2,9 kb Chúng cho có ng̀n gốc từ vi kh̉n E coli Cịn mợt plasmid gặp có ở mợt số chủng H pylori pHPK225 (1,5 kb) có ng̀n gốc từ vi kh̉n Gram (+) [5] - Bợ gen H pylori có sự đa dạng lớn trình tự chủng Hiện nay, tồn bợ cấu trúc bợ gen chủng H pylori HP 26695 phân lập ở Anh vào năm 1987 HP 199 phân lập ở My vào năm 1994 nghiên cứu xong Cấu trúc bộ gen chúng gồm một nhiễm sắc thể dạng vịng có kích cỡ 1,64 - 1,67 Mb; 90,8 - 91% vùng mã hóa Nhiễm sắc thể chủ yếu chứa gen tham gia vào sự tổng hợp men urease, yếu tố độc tế bào vacA, kháng nguyên cagA lông Bộ gen H pylori chủng 26695 bao gờm 1587 gen, chủng J99 có 1491 gen Mặc dù bộ gen chủng 26695 lớn J99 tới 24kb tỷ lệ G + C bằng 39% có mợt số đặc điểm chung bao gờm chiều dài trung bình trình tự mã hóa, mật đợ mã hóa codon khởi đầu Cả hai bợ gen có hai gen 16S, 23S, 5S rRNA chủng 26695 có thêm một 5S rRNA [5] - Đa số chủng phân lập ở Đơng Á có gen cagA allen gây độc tế bào gen vacA Trong đó, 50% số chủng ở Châu Âu My có gen Sự khác biệt nguồn gốc địa lý chủng hoặc sự chọn lọc khác chủng theo đặc điểm thể vật chủ - Tính đa dạng di truyền sự thích nghi H pylori đáp ứng lại điều kiện môi trường ở dày tá tràng thể vật chủ Cơ chế tạo nên tính đa dạng di truyền xảy theo đường thông thường bằng sự sắp xếp lại DNA việc thêm vào hoặc bỏ trình tự lạ Các chủng đợt biến thường có thành phần G + C khác biệt mang gen độc lực Sự đa dạng thấy ở mức độ điều hòa biểu gen dẫn đến sự đa dạng kiểu hình Ví dụ sự đa dạng kiểu hình enzyme sinh tổng hợp lipopolysaccharid (LPS) [5] - Kích cỡ bộ gen H pylori nhỏ vi khuẩn khác Tuy vậy, trình tự bộ gen khác ở chủng, dày mợt bệnh nhân, trình tự gen chủng H pylori khác - Các gen chính H pylori xác định gờm: Gen tổng hợp enzym urease: có khoảng gen ký hiệu từ A - I, A, B gen cấu trúc, F, G, H gen hoạt hóa Gen sinh đợc tố tế bào: cagA, vacA: sinh protein gây độc vật chủ Tất chủng H pylori mang gen vacA mã hóa protein vacA với mức đợ đa hình khác [1] + Một số nghiên cứu dịch tễ học bộ gen H pylori sau: - Peek CS (1998) phát gen iceA H pylori, thấy một hai alen iceA1 có liên quan đến loét đường tiêu hóa sự gia tăng nờng đợ IL-8 ở màng nhầy niêm mạc dày sau sự bám dính vi khuẩn [6] Van Doorn CS (1998) khảo sát Hà Lan, kết iceA1 chiếm 56,4%, iceA2 chiếm 26,6%, 94 trường hợp Tác giả kết luận, kiểu gen iceA độc lập với cagA vacA, vacA s1, cagA iceA1 giữ vai trò quan trọng bệnh sinh loét đường tiêu hóa [7] Yamaoka CS (1999) nghiên cứu 424 chủng H pylori phân lập từ bốn nước Colombia, My, Hàn Quốc Nhật Kết kiểu gen phân bố khác theo khu vực địa lý Kiểu gen cagA+ iceA1 vacAs1c-m1 chiếm ưu ở Nhật Hàn Quốc, kiểu gen cagA+ iceA2 vacAs1b-m1 chiếm ưu ở My, kiểu cagA+ iceA2 vacAs1a-m1 chiếm ưu ở Comlobia [8] Van Doorn CS (2000) công bố cấu trúc locus iceA H pylori Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp Northern Blots RT-PCR để phân tích sự phiên mã iceA1 gen liền kề hpyIM cysE Kết cho thấy, iceA1 khơng mã hóa mợt protein có chức Sự phiên mã hpyIM (gen mã hóa CATG-methyltransferase) phụ tḥc vào sự phiên mã iceA1 Tác giả cho rằng, iceA1có thể gây đợc thơng qua điều hịa phiên mã hpyIM Đờng thời, Van Doorn CS dùng real-time RT-PCR xác định mức độ biểu gen H pylori thể Từ tìm hiểu mối liên quan gen với trình sinh viêm ở dày Các kết cho thấy, mức độ phiên mã iceA1, iceA2 16S rRNA độc lập Mức độ biểu iceA1 liên quan đáng kể với sự gia tăng nồng độ IL-8, thu hút bạch cầu đoạn phản ứng viêm lớp màng nhầy niêm mạc dày [7] Ito CS (2000) cơng bố trình tự đầy đủ gen iceA1 từ 25 chủng H pylori khác Các chủng vi khuẩn phân lập từ hai nhóm bệnh nhân viêm loét dày Nhật [9] Kidd CS (2001) công bố kết khảo sát kiểu gen iceA H pylori ở Nam Phi Tác giả sử dụng PCR kết hợp giải trình tự để xác định kiểu gen iceA H pylori ở hai nhóm bệnh nhân ung thư loét dày tá tràng Kết là, iceA1 liên quan đến ung thư dày, kiểu vacA s1/iceA1 chiếm tỷ lệ cao [10] Xu Blaser (2001) chứng minh promotor trình tự DNA khởi đợng phiên mã gen hpyIM hai chủng H pylori, gen iceA1 iceA2 khác Chủng có gen iceA1, hpyIM có hai promotor hoạt đợng đợc lập Chủng có gen iceA2, hpyIM có mợt promotor khác Mức đợ phiên mã gen ở chủng có gen iceA1cao ở chủng có iceA2 Trình tự hpyIM bảo tờn cao sự biểu phức hợp iceA1-hpyIM hệ thống restrictionmodification (R-M) đa dạng chủng H pylori Hoạt động R-M trình tự chun biệt CATG gây đợc cho vật chủ giữ vai trị quan trọng q trình tồn phát triển vi khuẩn vật chủ [11] 1.1.2.4 Nuôi cấy H pylori vi khuẩn khó mọc điều kiện khí trường bình thường, tác giả nuôi cấy thành công sử dụng điều kiện vi hiếu khí với nồng độ khí: N2: O2: CO2 85:5:10 [1],[3],[4],[12] Nhiệt độ môi trường thích hợp cho H pylori 370C, phát triển từ 34 - 370C pH môi trường thích hợp từ - 8, vi khuẩn phát triển ở pH từ 5,5 – 8,5 Mơi trường ni cấy cần có yếu tố giàu dinh dưỡng cho phát triển, một số yếu tố phụ gia cần thiết, một số yếu tố ức chế vi khuẩn khác gồm một số kháng sinh không nhạy với H pylori Đặc điểm nuôi cấy: H pylori khó mọc chậm mơi trường ni cấy, thường sau 48 - 72 mọc thành khuẩn lạc nhỏ khoảng 1mm Độ ẩm môi trường yếu tố quan trọng cho sự phát triển vi khuẩn H pylori, theo một số nghiên cứu cho thấy độ ẩm cần thiết cho vi khuẩn phát triển 85% [90] Bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm nuôi cấy vấn đề quan trọng cho sự thành công ky thuật nuôi cấy H pylori [1],[4] 1.1.2.5 Các yếu tố độc lực + Enzym urease - Enzym urease H pylori tổng hợp sự điều hòa gen ure A, B C, mợt protein có trọng lượng phân tử 550 kDa - Một số đặc điểm enzym urease: Vị trí hoạt đợng địi hỏi có gắn yếu tố nikel với urease jack Bean một vài loại vi khuẩn khác, việc hoạt hóa in vitro sử dụng mangan cobalt Trọng lượng phân tử: 480 hoặc 545 kDa (với urease Jack Bean), có 840 amino acid cho mỡi phân tử 90 cystein pH hoạt đợng tốt nhất: 7,4 Nhiệt độ hoạt động mạnh nhất: 600C Hoạt động đặc hiệu: thủy phân urea Yếu tố ức chế: kim loại nặng (Pb-, Pb2+) Hầu hết urease vi khuẩn khác hoạt động nội tế bào, ngoại trừ urease H pylori hoạt động ngoại tế bào [13] + Các gen phụ H pylori: có gen là: - Ure E - I tham gia hoạt hóa apoenzyme bằng thu nhận ion Ni+ - Gen urel H pylori mã hóa cho mợt protein màng để tạo một lỗ cho urea ở màng bào tương, lỡ mở có pH acid, urea vận chuyển dễ dàng môi trường có pH acid, gen urel coi đầu dị đợ acid H pylori + Tính di động vi khuẩn: H pylori di động nhờ - lông ở một cực vi khuẩn, lông giúp vi khuẩn quần cư niêm mạc chui sâu vào tuyến dày, lẩn tránh tác dụng acid dịch vị + Yếu tố bám dính: H pylori bám vào niêm mạc dày nhờ yếu tố bám dính receptor tế bào niêm mạc Một số gen liên quan đến bám dính sau: - Gen babA (Hp 1243) receptor kháng nguyên Leb - Gen babB (Hp 0896) - Gen alpA (Hp 0912) alpB (Hp 0913) bị bất hoạt làm giảm tính bám dính - Gen sabA (Hp 0725) receptor thụ thể Lex Các gen quy định tính bám dính H pylori thuộc nhóm 32 gen mã hóa protein màng ngồi, tùy vào mức dộ tổng hợp protein mà chúng làm thay đổi thành phần bề mặt tế bào vi khuẩn + Một số enzym sinh học: - Enzym SOD (Superoxide dismutase) tách ion superxyd thành hydro, peroxyd, oxy - Enzym catalase giáng hóa hydrogen peroxyd thành nước oxy, enzym khơng có hoạt tính peroxydase, giống urease, cần cho H pylori tờn tiếp xúc với tế bào thực bào 10 - Enzym Ahp (Alkalinhydroperoxyd) - Gần đây, phát enzym argininase H pylori, enzym chu trình urea có ở vi kh̉n khác Enzym điều chỉnh tế bào chủ sản xuất NO, có tác dụng bảo vệ H pylori chống lại NO đại thực bào sản xuất Các enzym một số đặc tính có tác dụng bảo vệ H pylori chống lại hệ thống bảo vệ thể bị nhiễm vi khuẩn + Độc tố cagA: CagA (Cytotocin associated gen A) protein có trọng lượng phân tử 120 - 140 kDa, kết biểu gen cagA Gen cagA nằm chuỗi DNA H pylori, vùng tiểu đảo tạo chế gây bệnh PAI (Pathogenicity island) Có 7/31 gen hệ thống cagPAI mã hóa protein tương tự hệ thống tiết typ IV Tiểu đảo PAI mã hóa cho bợ máy tiết vận chuyển protein cagA vào tế bào vi khuẩn tiếp xúc với tế bào biểu mô hoặc đại thực bào Một số nghiên cứu ở châu Âu cho thấy, 60% chủng phân lập có cagA(+) thể bệnh viêm loét ung thư dày thường liên quan đến chủng có cagA(+) [1] Mợt số nghiên cứu khác cho thấy, ở bệnh nhân loét tá tràng, 80 - 100% chủng H pylori phân lập có cagA(+) Trong đó, ở bệnh nhân viêm dày có 40 - 60% chủng có cagA(+) Ở bệnh nhân nhiễm H pylori có cagA(+), thường thấy có dị sản ṛt, viêm mạn teo ung thư dày, yếu tố viêm IL-1α, IL-1β, IL-8 tăng cao ở người nhiễm chủng cagA(-)[14],[15],[16], [17], [18] Nghiên cứu đa trung tâm Pháp (2001) cho thấy, 652 bệnh nhân nội soi, sinh thiết làm xét nghiệm Những người có H pylori với cagA(+) thường có tổn thương mơ bệnh học nặng viêm dày hoạt 80 Nguyễn Đức Toàn: kiểu T2182C chiếm tỷ lệ tương đương, kiểu A2143G nghiên cứu cao (45,2% so với 26,7%) Tác giả sử dụng ky thuật giải trình tự gen nên phát kiểu đột biến A2143T Có thể số mẫu tác giả thấp (15 mẫu) nên khơng phát chủng có mang đột biến vị trí A2142 Như vậy, với ky thuật real-time PCR xác định bốn kiểu đột biến điểm 23S rRNA H pylori, xác định kiểu đột biến chủng H pylori kháng lại clarithromycin Kết nghiên cứu tác giả nước cho kết tỷ lệ số kiểu đột biến 23S rRNA H pylori thấp nghiên cứu chúng tôi: Nourkhoda (năm 2013) [105], sử dụng ky thuật PCR hạn chế chiều dài đoạn đa hình (PCR-RFLP) phát đợt biến kháng clarithromycin chủng H pylori có kháng clarithromycin bằng kháng sinh đồ ky thuật Kirby bauer Iran cho thấy có đợt biến kiểu A2143G Tuy nhiên, số mẫu tác giả ít (22 mẫu) nên chưa đủ đại diện phát đợt biến khác chủng H pylori nghiên cứu tác giả phân lập khu vực khác, Việt Nam hay Bắc Giang Agudo (2010) [107], nghiên cứu 118 chủng H pylori từ bệnh nhân có bệnh dày tá tràng Tây Ban Nha thấy tỷ lệ kháng clarithromycin bằng E test 35,6%; 42 chủng H pylori kháng clarithromycin bằng E test có 88,1% chủng có đợt biến điểm 23S rRNA bằng giải trình tự gen Tỷ lệ đợt biến A2143G chiếm 85,3%; A2142G chiếm 8,8%; T2182C chiếm 5,9% Như vậy, Tây Ban Nha tỷ lệ kiểu đợt biến kháng clarithromycin H pylori khác với kết nghiên cứu nghiên cứu Mohammad Kargar[106], thống kê kết luận: tỷ lệ kiểu đột biến kháng clarithromycin H pylori khác tùy vùng lãnh thổ hay quốc gia thời điểm, ky thuật tiến hành nghiên cứu 81 Như vậy, kết nghiên cứu một số tác giả nghiên cứu chủng H pylori ở Việt Nam thấy tỷ lệ có đợt biến vị trí T2182 cao chủng H pylori ở nước khác, đặc biệt châu Âu Tỷ lệ vị trí đợt biến nghiên cứu có kết khác tùy thuộc vùng lãnh thổ ky thuật sử dụng nghiên cứu Hiện nay, chưa có nghiên cứu lý giải chế H pylori có mợt số vị trí đợt biến nghiên cứu tập trung xác định vị trí đột biến, kiểu đột biến, tỷ lệ kiểu đột biến Một số kết nghiên cứu Việt Nam Nguyễn Đức Toàn [86], có kết tương tự với nghiên cứu biểu đồ 3.16 Theo tác giả, chủng H pylori gây bệnh ở Việt Nam có vị trí đột biến T2182 cao nhiều so với nghiên cứu tác giả nước Tuy vậy, tác giả Nguyễn Đức Toàn với số lượng mẫu thấp (15 mẫu) nên không gặp đột biến vị trí A2142 M Gerrits [110], thống kê cho thấy tỷ lệ kiểu đột biến ở khu vực khác nhau: Châu Âu: A2143G: 44-67%; A2142G: 23-33% Bắc My: A2143G: 39-45%; A2142G: 48-53% Trung Đông: A2143G: 75%; A2142C: 15%; A2142G: 5% Như vậy, chủng H pylori nghiên cứu bệnh nhân tỉnh Bắc Giang biểu đờ 3.16 có tỷ lệ kiểu đột biến khác nhiều so với thống kê Gerrits Biểu đồ 3.17 cho thấy tỷ lệ kiểu thay nucleotid nghiên cứu Kiểu T→C (50%) > kiểu A→G (40,6%) > kiểu A→C (9,4%) Barile CS (năm 2010) [101], dùng ky thuật giải trình tự với 49 chủng H pylori bệnh nhân Brasil thấy kiểu thay T→C 23S rRNA chiếm tỷ lệ lớn (12,9% T2182C; 61,3% T2215C; 6,4% T2221C) Như vậy, tỷ lệ kiểu thay nucleotid phụ thuộc vào chủng H pylori phân lập vùng địa lý khác Qua biểu đồ 3.18 cho thấy: tỷ lệ chủng H pylori nghiên cứu mang một đột biến cao (59,5%) > kiểu (31,0%) > kiểu (7,1%) > kiểu 82 (2,4%) Kết một chủng H pylori mang một hay nhiều kiểu đột biến phụ thuộc vào tần suất đột biến Mỡi vị trí đợt biến có tần suất riêng Do vậy, một chủng vi khuẩn, xác suất tích hợp nhiều kiểu đột biến thấp so với một kiểu Theo tác giả nghiên cứu đột biến kháng thuốc, chủng H pylori mang nhiều kiểu đợt biến nhiều vị trí đợt biến có khả kháng clarithromycin mợt số kháng sinh khác cao Nguyên nhân chúng làm giảm sự gắn kháng sinh vào vùng domain V 23S rRNA, làm tăng dần nồng độ MIC kháng sinh [106],[110] Nghiên cứu Việt Nam Ngũn Đức Tồn (2013) [86], có 20% sơ chủng H pylori có mang hai kiểu đợt biến Như vậy, với kết nghiên cứu chúng tơi số chủng H pylori bệnh nhân Bắc Giang có hai kiểu đợt biến phối hợp 31,0%; tổng số chủng có hai kiểu đợt biến trở lên 40,5% Kết cao so với Nguyễn Đức Tồn Sự khác vị trí địa lý số mẫu nghiên cứu tác giả nhỏ (15 mẫu) nên chưa đủ đại diện Tác giả Cirak (2007) [100], báo ra: Ý, tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin H pylori tăng gấp lần từ 10,2% sau 15 năm lên 21,3% Sự xuất thêm chủng có nhiều đợt biến làm cho tỷ lệ kháng clarithromycin H pylori Pháp tăng từ 18,6% giai đoạn 1993 - 1996 lên 41,6% năm 2001 Theo tác giả, việc có nhiều đợt biến H pylori làm tăng khả kháng clarithromycin nhanh Như vậy, tỷ lệ chủng H pylori mang một hay nhiều đột biến ngày tăng, nữa, tỷ lệ phụ thuộc vào đặc điểm vị trí địa lý đối tượng nghiên cứu Qua bảng 3.6 cho thấy chi tiết tỷ lệ kiểu đột biến kiểu phối hợp tỷ lệ đột biến H pylori 23S rRNA với việc xác định bốn kiểu thay nucleotid bằng ky thuật real-time PCR Trong đó, kiểu đột biến đơn T2182C chiếm tỷ lệ cao (47,6%); kiểu đột biến kép 83 T2182C+A2143G chiếm tỷ lệ cao (19,0%) Các kiểu đột biến đơn phối hợp khác chiếm tỷ lệ thấp nghiên cứu Tác giả Ngũn Đức Tồn [86], có kết nghiên cứu tương đồng với với 80% T2182C 20% kiểu phối hợp Các nghiên cứu khác giới có kết tỷ lệ kiểu đột biến khác tùy vùng thời điểm, vùng địa lý ky thuật sử dụng nghiên cứu [76],[77],[79],[106],[107] Có hai mẫu sinh thiết bệnh nhân chứa hai kiểu đột biến A2142G A2142C (mẫu số 86 139, chiếm 4,8% trường hợp có đợt biến) Hiện tượng do: (i) chủng đột biến dị hợp tử (hai đột biến khác gen 23S rRNA) (ii) tờn hai chủng H pylori có đợt biến kháng clarithromycin Tuy nhiên, xét kết real-time PCR cho thấy vị trí có hai đợt biến có cùng chu kỳ dương tính (mẫu số 86 dương tính ở chu kỳ 33; mẫu 139 dương tính ở chu kỳ 34) Như vậy, trường hợp đợt biến dị hợp tử Do có cùng số lượng copy DNA nên có cùng chu kỳ dương tính Để xác định chất vấn đề này, cần có nghiên cứu sâu nuôi cấy chủng bắt khuẩn lạc riêng rẽ để thử lại hoặc sử dụng ky thuật PCR phát đột biến dị hợp tử mạch đơn 23S rRNA H pylori Tìm hiểu nghiên cứu nước, không thấy tác giả đề cập đến vấn đề Mợt số tác giả nước ngồi có đề cập đến như: Kargar [106], so sánh ky thuật real-time PCR RFLP-PCR thấy có 21 chủng H pylori (12,8%) có hai kiểu thay nucleotid cùng một vị trí một chủng dùng real-time PCR Tác giả gọi trường hợp đợt biến dị hợp tử (Heteroresistance) Khi sử dụng ky thuật RFLP-PCR có kết khác nhau: có chủng khơng đợt biến, đợt biến dị hợp tử, có mợt đợt biến có mẫu mang chủng có mợt đợt biến mợt chủng không đột biến 84 Gerrits [110] mô tả trường hợp đột biến dị hợp tử Theo tác giả, trường hợp đột biến dị hợp tử có liên quan đến kháng clarithromycin, nhiên, trường hợp có mức kháng thuốc thấp trường hợp đột biến đồng hợp tử chúng dễ chuyển sang dạng thay đồng hợp tử Tỷ lệ đột biến dị hợp tử ở mức thấp 4.2.5 Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin LDD đơn thuần, loét DDHTT và LHTT đơn thuần Kết biểu đờ 3.19 cho thấy khơng có sự khác biệt tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin H pylori nhóm bệnh nhân có tổn thương ở dày hay HTT (p >0,05) Kết nghiên cứu tương tự Kargar [106]: nghiên cứu tác giả khơng có liên quan tỷ lệ kháng clarithromycin kết nội soi đặc điểm lâm sàng bệnh nhân Tổn thương loét dày hay HTT H pylori phụ huộc vào nhiều yếu tố yếu tố địa bệnh nhân, tổn thương viêm ban đầu, yếu tố độc lực chủng H pylori… [1],[8],[21] Tuy vậy, tỷ lệ kháng clarithromycin tiên phát đột biến điểm không khác chủng H pylori ở bệnh nhân có tổn thương loét ở dày tá tràng 85 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 190 mẫu sinh thiết dày bệnh nhân LDDTT đến khám điều trị bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang, xét nghiệm xác định đột biến kháng clarithromycin cho 89 mẫu H pylori, chúng tơi có mợt số kết luận sau: Tỷ lệ phát hiện H pylori mảnh sinh thiết bệnh nhân loét dạ dày tá tràng bằng kỹ thuật real-time PCR là 88,4% - Tỷ lệ nhiễm H pylori ở bệnh nhân LDDTT không phụ thuộc vào độ tuổi, giới tính, địa dư, vị trí đặc điểm ổ loét ở dày HTT, số lần điều trị bệnh DDTT - Tỷ lệ H pylori (+) bằng xét nghiệm real-time PCR mảnh sinh thiết dày khác phụ tḥc vào tình trạng sử dụng kháng sinh tuần trước nội soi Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin của H pylori nghiên cứu bằng real-time PCR với kiểu đột biến (A2142C, A2142G, A2143G, T2182C): - Có 47,2% chủng có ít mợt đột biến - Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin chủng H pylori nghiên cứu khơng có sự khác biệt yếu tố tuổi, giới, địa dư, tình trạng sử dụng kháng sinh trước tình trạng loét ở dày hay HTT - Tần suất đột biến vị trí T2182 (76,7%) > A2143 (45,2%) > A2142 (31,0%) tỷ lệ kiểu đột biến T2182C (76,7%) > A2143G (45,2%) > A2142G (16,7%) > A2142C (14,3%) - Tỷ lệ chủng H pylori mang kiểu đột biến chiếm (59,5%) > mang kiểu (31,0%) > mang kiểu (7,1%) > mang kiểu (2,4%) 86 KIẾN NGHI Qua kết nghiên cứu đề tài, chúng tơi có mợt số kiến nghị sau: Nên ứng dụng ky thuật cho xác định H pylori mảnh sinh thiết dày sở có điều kiện có đợ nhạy đặc hiệu cao Tỷ lệ H pylori có đợt biến tiên phát ba vị trí thuộc 23S rRNA (A2142, A2143, T2182) cao, định phác đồ kháng sinh diệt H pylori cho bệnh nhân cần có xét nghiệm đánh giá mức đợ nhạy cảm vi khuẩn để lựa chọn phác đồ cho phù hợp Cần có nghiên cứu sâu để đánh giá mức độ ảnh hưởng kiểu đột biến tới nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) clarithromycin với H pylori MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TAI LIÊU .3 1.1 Đăc điêm cua vi khuân H pylori .3 1.1.1 Vài nét về lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Đăc điêm sinh hoc vi khuân H pylori 1.1.3 Phân loại Helicobacter 12 1.1.4 Kha gây bênh cua H pylori 12 1.1.5 Xác định tổn thương LDD-HTT qua nội soi 14 1.2 Các phương pháp xét nghiêm xác định nhiêm H pylori hi ên 15 1.2.1 Các test co sử dung thu thuât xâm lấn 15 1.2.2 Các test không sử dung thu thu ât xâm lấn 19 1.3 Các ky thuât real-tme PCR xác định H pylori 21 1.3.1 Giơi thiêu chung về real-tme PCR 21 1.3.2 Môt sô nghiên cứu xác định H pylori sử dung real-tme PCR 26 1.3.3 Các phương pháp phát hiên đôt biên điêm sử dung real-tme PCR 27 1.3.4 Môt sô nghiên cứu xác định đôt biên điêm cua H pylori sử dung real-tme PCR 30 1.4 Các phác đô diêt H pylori và sư kháng kháng sinh cua vi khuân 30 1.4.1 Các phác đô điều trị diêt H pylori 31 1.4.2 Kha kháng clarithromycin cua H pylori 31 1.4.3 Môt sô nghiên cứu đôt biên kháng clarithromycin cua H pylori sử dung real-tme PCR 34 1.5 Thông tn sơ lược về địa điêm tổ chức nghiên cứu 36 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.1 Địa điêm và đôi tượng nghiên cứu 38 2.1.1 Địa điêm, thời gian nghiên cứu 38 2.1.2 Đôi tượng nghiên cứu 38 2.1.3 Vât liêu nghiên cứu 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Thiêt kê nghiên cứu 39 2.2.2 Cỡ mẫu và cách chon mẫu .40 2.2.3 Các ky thuât nghiên cứu .41 2.2.4 Sơ đô nghiên cứu 46 2.2.5 Các chỉ têu nghiên cứu 46 2.2.6 Phương pháp thu thâp thông tn 48 2.2.7 Các sai sô và không chê sai sô 48 2.2.8 Phương pháp phân tch và xử ly sô liêu 48 2.2.9 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 48 CHƯƠNG 3: .50 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .50 3.1 Xác định H pylori manh sinh thiêt dày bằng ky thuật real-tme PCR 50 3.1.1 Tỷ lệ nhiêm H pylori nghiên cứu 50 - Đường base line - Đô thị cua mẫu Dương, cắt baseline trươc chu kỳ 30 51 - Đô thị cua chứng nôi, cắt baseline chu kỳ 32 .51 3.1.2 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo đ ô tuổi 51 3.1.3 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo giơi 51 3.1.4 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo địa dư 52 3.1.5 Kêt qua real-tme PCR H pylori LDD đơn thuần, loét DD-HTT và LHTT đơn thuần .53 3.1.6 Tỷ lê nhiêm H pylori và vị trí ổ loét dày b ênh nhân loét dày .53 3.1.7 Tỷ lê nhiêm H pylori và vị trí ổ loét dày b ênh nhân loét DD - HTT 54 3.1.8 Tỷ lê nhiêm H pylori vơi hình thái loét HTT b ênh nhân loét HTT 54 3.1.9 Tỷ lê nhiêm H pylori vơi hình thái loét HTT b ênh nhân loét DD - HTT 55 3.1.10 Tỷ lê nhiêm H pylori và tnh trạng b ênh nhân sử dung kháng sinh dươi tuần trươc nôi soi 56 3.1.11 Tỷ lê nhiêm H pylori và sô lần điều trị b ênh DD-HTT 57 3.2 Xác định tỷ lê co đôt biên đề kháng clarithromycin 57 3.2.1 Tỷ lê H pylori co đôt biên 57 3.2.2 Tỷ lê H pylori đôt biên kháng clarithromycin theo đ ô tuổi .58 3.2.3 Tỷ lê H pylori đôt biên kháng clarithromycin theo giơi tnh .59 3.2.4 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin theo địa dư 59 3.2.5 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin và tnh trạng sử dung kháng sinh điều trị H pylori 60 3.2.6 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin vơi tnh trạng sử dung kháng sinh cu thê theo phác đô 61 3.2.7 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin và tnh trạng sử dung kháng sinh dươi tuần trươc nôi soi 61 3.2.8 Tỷ lê kiêu đôt biên nghiên cứu 62 3.2.9 Tỷ lê vị trí đơt biên 63 3.2.10 Tỷ lê kiêu thay thê nucleotd .63 3.2.11 Tỷ lê chung mang môt hay nhiều đ ôt biên 64 3.2.12 Tỷ lê kiêu phôi hợp đôt biên m ôt chung H pylori 64 Đường đô thị sô 1: T2182C; đường đô thị sô 2: A2142C; .66 Đường đô thị sô 3: A2142G; đường đô thị sô 4: A2143G .66 .66 Đường đô thị sô 1: A2142C; đường đô thị sô 2: A2142G 66 Đường đò thị sô 3: A2143G 66 3.2.13 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin LDD đơn thuần, loét DD-HTT và LHTT đơn thuần 66 CHƯƠNG 4: BAN LUÂN .68 4.1 Xác định H pylori manh sinh thiêt dày bằng ky thu ât real-tme PCR 68 4.1.1 Tỷ lê nhiêm H pylori cua bênh nhân nghiên cứu bằng xét nghi êm real-tme PCR 68 4.1.2 Tỷ lê nhiêm H pylori đôi tượng nghiên cứu theo đ ô tuổi 70 4.1.3 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo giơi tnh 70 4.1.4 Tỷ lê nhiêm H pylori theo địa dư 71 4.1.5 Tỷ lê nhiêm H pylori và hình thái loét DD-HTT 72 4.1.6 Đăc điêm ổ loét DD-HTT và kêt qua xét nghi êm real-tme PCR xác định H pylori 72 4.1.7 So sánh kêt qua real-tme PCR xác định H pylori và tnh trạng sử dung kháng sinh dươi tuần trươc nôi soi 73 4.1.8 Tỷ lê nhiêm H pylori và sô lần mắc b ênh DD-HTT .74 4.2 Tỷ lệ đôt biên kháng clarithromycin cua chung H pylori phân l âp b ênh nhân loét DD – HTT nghiên cứu 75 4.2.1 Tỷ lê chung chung H pylori co đôt biên kháng clarithromycin 75 4.2.2 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin và yêu tô tuổi, giơi tnh, vung địa dư 77 4.2.3 Tỷ lê H pylori đôt biên kháng clarithromycin vơi tnh trạng sử dung kháng sinh 78 4.2.4 Tỷ lê kiêu và loại đôt biên kháng clarithromycin 79 4.2.5 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin LDD đơn thuần, loét DD-HTT và LHTT đơn thuần 84 KẾT LUÂN 85 KIẾN NGHI 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bang 1.1: Môt sô tnh chất sinh vât hoa hoc cua H pylori [4] Bang 1.2: Các gen cua H pylori, năm nghiên cứu, ky thuật dung nghiên cứu .27 Bang 1.3: Các phác đô diệt H pylori 31 Bang 1.4 Tỷ lê kiêu đôt biên kháng clarithromycin 33 Bang 2.1: Mô ta đăc tnh môi kit real-tme PCR xác định H pylori 39 Bang 2.2: Sơ đô mix chứng dương và chứng âm .44 Bang 2.3: Sơ đô mix mẫu phát hiên đ ôt biên kháng clarithromycin 44 Bang 3.1 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo đ ô tuổi (n = 190) 51 Bang 3.2 Tình trạng sử dung kháng sinh dươi tuần trươc n ôi soi b ênh nhân nghiên cứu (n = 190) .53 Bang 3.3 Tỷ lê nhiêm H pylori và vị trí ổ loét dày b ênh nhân loét dày (n = 159) 54 Bang 3.4 Tỷ lê H pylori đôt biên kháng clarithromycin theo đ ô tuổi (n = 89) 58 Bang 3.5 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin vơi tnh trạng sử dung kháng sinh theo phác đô (n = 89) .61 Bang 3.6 Tỷ lê kiêu phôi hợp đôt biên m ôt chung H pylori (n = 42) 65 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biêu đô 3.1 Tỷ lệ nhiêm H pylorri nghiên cứu (n = 190) .50 Biêu đô 3.2 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo giơi (n = 190) 52 χ2 = 1,9; df = 1; p = 0,2 52 Biêu đô 3.3 Phân bô tỷ lê nhiêm H pylori theo địa dư (n = 190) 52 Biêu đô 3.4 Kêt qua real-tme PCR H pylori bệnh (n = 190) 53 Biêu đô 3.5 Tỷ lê nhiêm H pylori và vị trí ổ loét dày b ênh nhân loét DD - HTT (n = 17) .54 Biêu đô 3.6 Tỷ lê nhiêm H pylori vơi hình thái loét HTT b ênh nhân loét HTT (n = 14) 55 Biêu 3.7 Tỷ lê nhiêm H pylori vơi hình thái loét HTT b ênh nhân loét DD - HTT (n = 17) 55 55 Biêu đô 3.8 Tỷ lê nhiêm H pylori và tnh trạng b ênh nhân sử dung kháng sinh dươi tuần trươc nôi soi (n = 190) .56 Biêu đô 3.9 Tỷ lê nhiêm H pylori và sô lần điều trị b ênh DD-HTT (n = 190) 57 Biêu đô 3.10 Tỷ lê H pylori co đôt biên (n = 89) 57 Biêu đô 3.11 Tỷ lê H pylori đôt biên kháng clarithromycin theo giơi tnh (n = 89) 59 Biêu đô 3.12 Tỷ lê H pylori co đôt biên kháng clarithromycin theo địa dư (n = 89) 59 Biêu đô 3.13 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin và tnh trạng sử dung kháng sinh điều trị H pylori (n = 89) 60 Biêu đô 3.14 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin và tnh trạng sử dung kháng sinh dươi tuần trươc nôi soi (n = 89) 62 Biêu đô 3.15 Tỷ lê kiêu đôt biên nghiên cứu 63 Biêu 3.16 Tỷ lê vị trí đơt biên (n = 64) 63 Biêu đô 3.17 Tỷ lê kiêu thay thê nucleotd (n = 64) .64 Biêu đô 3.18 Tỷ lê chung H pylori mang đ ôt biên (n = 42) 64 Biêu đô 3.19 Tỷ lê đôt biên kháng clarithromycin LDD đơn thuần, loét DD-HTT và LHTT đơn thuần (n = 89) 67 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Real-tme PCR dung thuôc nhuôm huỳnh quang EvaGreen [59] 22 Hình 2: Ky thuật real-tme PCR vơi mẫu dò Taqman 25 Hình 3: Ky thuật real-tme vơi mẫu dò beacon 25 Hình 4: Hoạt đơng cua probe lai 26 Hình 5: Mơi bắt cặp vơi đột biên [57] 28 Hình 6: Mẫu dò bắt cặp vơi đột biên [59] 29 Hình 7: Cơ chê xác định khác biêt alen dung Taqman probe [59] .29 Hình 8: Cấu truc và hoạt đông cua MGB Taqman probe [59] 30 Hình 3.1 Môt mẫu sinh thiêt co kêt qua real-tme PCR dương tnh trươc chu kỳ 30: .51 Hình 3.2 Môt mẫu co kêt qua đôt biên điêm vị trí A2142G, A2143G: .58 Hình 3.3 Mẫu bênh phâm sô 86 co kiêu đôt biên phôi hợp Dương chu kỳ 33 66 Hình 3.4 Mẫu bênh phâm sơ 139 vơi kiêu đ ôt biên phôi hợp Dương chu kỳ 34 66 22,25,26,29,30,50,51,52,53,54,55,56,57,58-60,62-64,66,67 1-21,23,24,27,28,31-49,61,65,68- ... hành đề tài nhằm mục tiêu: Xác định H pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân loét dạ dày tá tràng real- time PCR tại Bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Giang Xác định tỷ lệ H pylori. .. pylori (+) Thực real- time PCR phát đột biến kháng clarithromycin 2.2.5 Các tiêu nghiên cứu 2.2.5.1 Xác định H pylori bằng real- time PCR - Tỷ lệ H pylori (+) bằng real- time PCR - Phân bố tỷ... mẫu sinh thiết cho nghiên cứu - Thực xét nghiệm thường quy xác định H pylori - Tách chiết DNA mẫu cho xét nghiệm real- time PCR - Thực real- time PCR cho xác định H pylori Real- time PCR H pylori