Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Nhân trần tía

Để nâng cao giá trị dược liệu, khóa luận này tiến hành “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Nhân trần tía” nhằm góp phần xác định thành phần hóa học của cây này với mong muốn gi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh gan mật là một bệnh khá phổ biến và gây ra những hậu quả nguy hiểm lâu dài [4] Hiện nay, tỉ lệ người mắc bệnh viêm gan và đặc biệt là số người có phản ứng HbsAg (+) ngày một tăng [9] Đây là bệnh truyền nhiễm và là nguy cơ dẫn đến

xơ gan hay ung thư gan [12] Các thuốc tân dược dùng trong điều trị bệnh viêm gan thường có giá thành cao, một số lại có tác dụng không mong muốn Vì thế, vấn đề tìm nguồn thuốc trị bệnh gan mật có nguồn gốc thảo mộc đang rất được quan tâm [9] Theo kinh nghiệm dân gian, một số cây thuốc đã được dùng trong điều trị lâm sàng và bước đầu cho thấy có hiệu quả tốt

Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) là một cây thuốc chữa các

bệnh liên quan đến gan mật có từ lâu đời Nhân dân Nam Bộ thường dùng cây này chữa các chứng vàng da, cảm cúm và tiêu độc Các tài liệu nghiên cứu về lâm sàng cũng cho thấy: Nhân trần tía thực sự có tác dụng chữa bệnh gan Bệnh viện Chợ Quán đã từng dùng cây này chữa cho 4.000 trường hợp viêm gan do virus và đạt kết quả tốt; Bệnh viện Y học Dân tộc Tây Ninh đã dùng để chữa 100 trường hợp xơ gan

cổ trướng cho kết quả là khỏi 24% và tiến triển khá tốt là 46,6% [17]

Tuy được sử dụng làm thuốc từ rất lâu nhưng cho đến nay Nhân trần tía vẫn

có rất ít những nghiên cứu về mặt dược lý và hóa học, dạng dùng còn thô sơ, chủ yếu là dạng cao nước hoặc cao cồn chưa có tiêu chuẩn cụ thể Để nâng cao giá trị

dược liệu, khóa luận này tiến hành “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học

của Nhân trần tía” nhằm góp phần xác định thành phần hóa học của cây này với

mong muốn giúp cho việc tiêu chuẩn hóa cây thuốc, nghiên cứu tác dụng dược lý và các dạng chế phẩm trong tương lai

TỔNG QUAN

1 THỰC VẬT HỌC

1.1 Chi Adenosma

1.1.1 Vị trí của chi Adenosma trong giới thực vật

Theo Takhtadjan [7], chi Adenosma (thuộc họ Hoa m m chó – Scrophulariaceae) có

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Adenosma

Cỏ mọc hàng năm hay sống dai, thường có mùi thơm Lá đơn, mọc đối, có cuống hay không, có mép nhăn

Hoa đơn độc ở nách lá hoặc mọc thành chùm có lá hoặc là cụm hoa đầu hay dạng bông Hai lá bắc con dạng sợi nằm đúng ngay dưới đài Đài có 5 lá đài không đều, 3 cái ngoài lớn hơn, hình ngọn giáo rộng tới hình tim – trứng; 2 cái ở trong hình dải – ngọn giáo Tràng hình trụ, có 2 môi, môi trên (ở ngoài) hình bầu dục tới tròn,

nguyên hay l m; môi dưới (ở trong) có 3 thùy Nhị 4, không thò, 2 trội; bao phấn 2

ô rời nhau mà 1 cái sinh sản trong cả 4 nhị hoặc chỉ có 2 nhị sau sinh sản Vòi dạng sợi; đầu nhụy dạng đấu

Quả nang có hình trứng, hình nón hay bầu dục, thon hẹp nhiều ở đỉnh, có 2 rãnh,

mở cắt vách hay mở ô bởi 4 van; hạt nhiều, nhỏ, hình bầu dục hay hình trụ ngắn; vỏ

có vân mạng [7]

Chi Adenosma có khoảng 15 loài có ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á, Trung

Quốc và Australia Ở khu vực Đông Dương, Lào có 8 loài; Việt Nam 7 loài và

Campuchia 6 loài [18] Theo Phạm Hoàng Hộ [13] ở Việt Nam có 7 loài Adenosma, còn theo Lê Tùng Châu, ở Việt Nam có 9 loài thuộc chi Adenosma [2] Trong các loài Adenosma có ở Việt Nam, Y học cổ truyền thường dùng 3 loài sau:

 Nhân trần, Adenosma glutinosum (L.) Druce và Adenosma caeruleum R.Br: loài này

phân bố khắp vùng nhiệt đới từ Ấn Độ, Srilanca đến Malaysia, Lào, Việt Nam, Nam Trung Quốc và một số đảo lớn (Borneo, Java) của Indonesia Ở Việt Nam, Nhân trần phân bố tập trung các tỉnh vùng núi phía Bắc như: Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Tuyên Quang, Hà Giang, Yên Bái, Lào Cai, Lai Châu, Sơn La và Hòa Bình Gần đây cũng tìm thấy ở Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế…[18]

 Bồ bồ, Adenosma capitatum Benth hay Adenosma indianum (Lour) Merr.: cây phân

bố ở Srilanca, Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Philippin Ở nước ta, loài này thường gặp từ Thái Nguyên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây vào tới Đồng Nai,

Bà Rịa – Vũng Tàu và Bình Dương [7]

 Nhân trần tía, Adenosma bracteosum Bonati: thường gặp ở các tỉnh như Tây Ninh,

Bình Dương, khu vực Vũng Tàu, đảo Phú Quốc và Côn Đảo [18]

1.2 Nhân trần tía

1.2.1 Đặc điểm thực vật của Nhân trần tía

Cây thảo, cao 30-40 cm Thân hình trụ, phân cành từ

gốc, phần ngọn có 4 cánh, nhẵn Cành mọc tỏa ngang

hay đứng thẳng Lá mọc đối, hình mác thuôn, dài

khoảng 2 m, rộng 7 cm, không cuống, gốc gần như ôm

thân, nguyên hoặc có răng cưa tròn, gân lá r

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành bông dày đặc, dài 1,5-3

cm; tổng bao gồm những lá bắc dạng lá, hình tim, đầu

nhọn, mép nguyên, có lông thô; đài có 5 răng không đều,

3 răng ngoài rộng, 2 răng trong hẹp Tràng có ống hình trụ chia thành 2 môi, môi trên bằng đầu, chia đôi, môi dưới dài bằng môi trên chia 3 thùy gần bằng nhau; nhị

có 1 ô, bầu nhẵn

Quả nang, hình trứng thuôn, thắt lại ở đầu, nằm gọn trong đài tồn tại; hạt nhỏ li ti, màu đen hay màu nâu tía Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng [2]

1.2.2 Phân bố, sinh thái và thu hái

Trong số 3 loài thuộc chi Adenosma được sử dụng làm thuốc ở Việt Nam, loài Nhân

trần tía có phạm vi phân bố hạn chế và chỉ phát hiện thấy ở vài tỉnh phía Nam như: Tây Ninh, Bình Dương, khu vực Vũng Tàu, đảo Phú Quốc và Côn Đảo Có tài liệu còn ghi nhận ở cả Kon Tum, Đắc Lắc (V Văn Chi, 1997) Cây cũng phân bố khá phổ biến ở Lào và Campuchia

Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mưa đến đầu mùa khô hàng năm Cây ưa sáng, ưa ẩm và có thể chịu được khô hạn sau khi đã ra hoa, kết quả Cây thường mọc thành đám có khi tới hàng ngàn mét vuông trên những bãi đất bằng dưới chân đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao mới bỏ hoang Nơi mọc của Nhân trần tía thường là đất pha cát và hơi chua Ở những nơi đất bị rửa trôi mạnh, nghèo dinh dưỡng, cây chỉ cao không quá 15 cm đã thấy có hoa quả Sau khi quả già, toàn cây tàn lụi So với các loài Bồ bồ và Nhân trần (mọc ở các tỉnh phía Bắc), Nhân trần tía có vòng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 3,5-4 tháng và mức độ khai thác, sử dụng cũng ít hơn Thu hái lúc cây đang ra hoa, phơi hay sấy ở 40-50 0C đến khô [2]

Hình 1: Adenosma bracteosum

); nD = 1,4705 (200); []D = + 4,8

[14] Gần đây, Nguyễn Xuân Dũng và Lê Văn Hạc đã phát hiện một chemotype mới

của Nhân trần Việt Nam là Adenosma glutinosum (L.) Druce var caeruleum (R.Br)

Tsoong Mẫu được lấy vào thời kỳ nở hoa của cây Nhân trần tại huyện Tân Kỳ - Nghệ An, thành phần tinh dầu đặc trưng bởi -pinen (22,7%); 1,8-cineol (18,2%) và

-terpinen (16,9%) và hơn 30 chất khác với hàm lượng thấp hơn nhiều [16]

Năm 1950, P V Nair và cộng sự đã cất được từ cây Bồ bồ mọc ở Ấn Độ 1% tinh dầu và đã phân tích thấy có 5 l-monoterpen và 2 d-sesquiterpen trong đó có 38,5% cineol, ngoài ra còn thấy limonen [14]

Năm 1974, Lê tùng Châu đã phân tích tinh dầu Bồ bồ xác định các hằng số: d20 = 0,0120; nD = 1,4768; D = 44,92; hằng số điện môi : 30; chỉ số acid: 2,89; este: 12,09; acetyl: 45,68; sắc ký khí 12 thành phần, dùng các phổ UV, IR, NMR và MS xác định có các chất: 22,6% l-limonen, 11,6% humulen, 33,5% l-fenchon và 5,9%

cineol Ngoài ra còn có fenchol, pireritenon oxyd, geranyl acetat, 1 sesquiterpen

Qua phân tích sơ bộ thì tất cả các loài thuộc chi Adenosma đang được sử dụng làm

thuốc ở Việt Nam đều có chứa flavonoid [2]

2.1.3 Các thành phần khác

Ngoài các thành phần trên thì các loài thuộc chi Adenosma còn có coumarin,

saponin triterpen, acid nhân thơm, các hợp chất polyphenol Đặc biệt, trong Bồ bồ còn có 1,67% kali nitrat, một saponin có chỉ số bọt 2.600, một glucosid tan trong aceton, trong ether và không tan trong nước Saponin của Bồ bồ được tạo thành từ 3 genin trong đó có 1 genin được xác định cấu trúc là 17-methyl, Δ5-6 androsten-3,17 diol [14,2]

2.2 Thành phần hóa học của Nhân trần tía

2.2.1 Tinh dầu

Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Nhân trần tía có 0,25% tinh dầu, màu vàng, tỉ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ 1,496 Sắc ký khí cho thấy có 19 peak trong đó có 5 peak lớn với hàm lượng cineol khoảng 18% [14]

Tsankkova, Elena T.; K uleva, Liliva V.; Lê Thái Thanh phân tích tinh dầu của Nhân trần tía thấy có thành phần chính là thymol (25,3%), linalol (13,1%), β-farnesen (9,5%) [10]

Lê Tùng Châu, E Hetelyi và cộng sự khảo sát Nhân trần tía khi cây đang ra hoa (tháng 11, 12) ở Tây Ninh thì thấy có 0,6% tinh dầu Tinh dầu màu vàng nhạt, mùi cay nồng, thoảng mùi ascaridol Ba thành phần chính trong tinh dầu được xác định là:

bracteosum bốn dẫn xuất từ flavon trong đó có một chất màu vàng có điểm chảy

243,5 0C nhưng chưa xác định được cấu trúc [17]

Gần đây, nhóm nghiên cứu thuộc Ban nghiên cứu khoa học – Đại Học Y Dược Tp HCM đã tách được một chất có tên là scutellarein – 6 – O – glucosid

2.2.3 Các thành phần khác

Nguyễn Minh Đức và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được 3 chất từ Nhân trần tía

là bracteosid A, bracteosid B và bracteosid C [11]

Ngoài ra, trong Nhân trần tía còn có hợp chất polyphenol, coumarin, saponin và acid nhân thơm

3 TÁC DỤNG SINH HỌC

3.1 Tác dụng sinh học của chi Adenosma

Cả Nhân trần và Bồ bồ đều có tác dụng tăng tiết mật và tăng thải độc của gan nhưng

Bồ bồ có tác dụng mạnh hơn

Tác dụng chống viêm:

Thử nghiệm trên 3 mô hình (mô hình phù kaolin, mô hình u hạt, mô hình teo tuyến ức) Kết quả Nhân trần và Bồ bồ đều có tác dụng chống viêm trên cả 3 mô hình So sánh tác dụng giữa Nhân trần và Bồ bồ thì ở mô hình phù kaolin, Nhân trần mạnh hơn một ít nhưng với liều cao tác dụng lại giảm Ở mô hình teo tuyến ức thì Nhân trần kém hơn một ít Ở mô hình u hạt thì tác dụng của Nhân trần chỉ bằng ½ của Bồ

bồ

Tác dụng kháng khuẩn:

Bồ bồ có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn so với Nhân trần, nhất là với trực khuẩn Khác với Bồ bồ, Nhân trần ức chế mạnh nhất trên cầu khuẩn

Tác dụng giảm tiết dịch vị và giảm tiết acid:

Nhân trần không có tác dụng giảm loét dạ dày, thậm chí còn tăng, có tác dụng yếu đến giảm tiết dịch vị, có tác dụng giảm acid tự do và acid toàn phần trong dịch vị, nhưng 2 tác dụng này lại giảm khi dùng liều cao Khác với Nhân trần, Bồ bồ có tác dụng r rệt đến giảm loét thực nghiệm và giảm tiết dịch vị

Độc tính:

Thử độc tính cấp và bán trường diễn với liều có tác dụng dược lý, dùng liên tục thời gian dài không thấy biểu hiện của nhiễm độc hoặc tổn thương do thuốc; với liều cao gấp 20 lần so với liều có tác dụng không có súc vật nào chết Như vậy, Nhân trần và

Bồ bồ là dược liệu không độc [1]

Hiện nay, cũng có 1 loài mang tên Nhân trần nhưng không thuộc chi Adenosma đó

là Nhân trần Trung Quốc, Artemisia capillaris Thunb: dùng chữa hoàng đản và các

bệnh ở túi mật như vàng da, đái ít, viêm gan truyền nhiễm thể hoàng đản, trị mụn nhọt, ghẻ ngứa [6]

3.2 Tác dụng và công dụng của Nhân trần tía

3.2.1 Tác dụng sinh học

Tác dụng tăng tiết mật:

Thí nghiệm trên chuột lang thấy dịch chiết Nhân trần tía làm tăng tiết mật 24,7% so với lô đối chứng

Thử lâm sàng chữa viêm gan virus:

Bệnh viện chợ Quán thành phố Hồ Chí Minh đã dùng Nhân trần tía chữa hơn 4000 trường hợp bị viêm gan do virus có kết quả tốt

Thử lâm sàng xơ gan cổ trướng:

Bệnh viện Y học Dân tộc tỉnh Tây Ninh dùng Nhân trần tía chữa gần 100 bệnh nhân, thấy khỏi 24%, có tiến triển khá và tốt 46,6% [18]

3.2.2 Công dụng dân gian

Toàn cây Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan, vàng da, ăn uống kém tiêu, sốt, cảm cúm, ngộ độc [17]

Hiện nay, Nhân trần tía được các cơ sở sản xuất Đông Nam Dược ở thành phố Hồ Chí Minh sử dụng khá nhiều trong các bài thuốc có tác dụng thông mật, lợi gan như:

thuốc nước Thông mật giải độc gan của công ty Nam Việt, thuốc nước Long đởm

mát gan giải độc của cơ sở Phước Linh, thuốc nước Mát gan giải độc của cơ sở

Phước An…

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT

BỊ

1.1 Nguyên liệu

Toàn cây trên mặt đất của Nhân trần tía (mua ở đường Hải Thượng Lãn Ông - Quận

5 Tp HCM), mẫu khô lưu tại Bộ môn Dược Liệu Dược liệu được xay thành bột mịn (10 kg)

1.2 Dung môi, hóa chất

Cồn 96%: loại dùng cho thực phẩm

Các dung môi hữu cơ: ether dầu hỏa, ether ethylic, aceton, chloroform, methanol,

benzen, ethyl acetat, n-BuOH sử dụng loại PA do Trung Quốc sản xuất

Các hóa chất khác: acid acetic, HCl, H2SO4, NaOH, KOH, bột Mg kim loại,

Na2CO3, vanillin sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)

 Tủ sấy hiệu số U-500 (Memmert)

 Nồi cách thủy WB-14 (Memmert)

 Cân kỹ thuật tự động KERN

 Cân phân tích độ nhạy 0,1 mg BP-221S (Sartorius)

 Bể siêu âm (Sonnerex)

 Đèn UV 254 / 365 nm (Vilber Lourmat LC-15)

 Máy quang phổ UV-Vis U-2010 (Shimadzu)

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: đo bằng máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

500 MHz, dung môi là methanol-d4

 Khối phổ: LC-MS được thực hiện tại Viện Hóa trung tâm Khoa Học Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội, kỹ thuật ESI

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chiết xuất

Dược liệu được chiết nóng với methanol Dịch chiết methanol thu được được loại dung môi bằng cách cô cách thủy và cô dưới áp suất giảm để thu được cao lỏng toàn phần

Tách cao lỏng toàn phần thành những phân đoạn đơn giản hơn bằng cách chiết với dung môi và phân bố lỏng – lỏng

2.2 Sắc ký

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng dùng bản mỏng tráng sẵn của Merck và sử dụng trong:

 Khảo sát, xem xét kết quả của các thử nghiệm chiết tách bằng dung môi và phân bố lỏng – lỏng

 Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột cổ điển

 Kiểm tra các phân đoạn sau khi tiến hành sắc ký cột cổ điển và cột Sephadex Kết quả sắc ký lớp mỏng được phát hiện bằng:

 UV 365 nm

 UV 254 nm

 Thuốc thử FeCl3 1% trong cồn tuyệt đối

 Thuốc thử KOH 5% trong cồn tuyệt đối

 Thuốc thử vanilin – sulfuric:

Vanilin 1% trong cồn tuyệt đối pha chung với H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối (tỉ lệ 1:1) phun lên bản mỏng, sấy ở 110 0C cho hiện màu và quan sát dưới ánh sáng thường

Hệ dung môi:

Các hệ dung môi sử dụng cho sắc ký lớp mỏng sẽ được trình bày cụ thể ở phần thực nghiệm

2.2.2 Sắc ký rây phân tử

Pha tĩnh: Sephadex LH-20

Kích thước cột: 1,2 x 2,4 cm

Dung môi khai triển: methanol

Tốc độ khai triển: 70 giọt/ phút

Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

2.2.3 Sắc ký cột cổ điển

Pha tĩnh: Silicagel loại cho sắc ký cột của Merck, cỡ hạt mịn (0,015-0,040 mm) Silicagel được khử hoạt bằng cách trộn 10% nước, sấy trong bình kín ở 110 0

C trong vòng 2 giờ, sau đó để nguội

Dung môi khai triển: sử dụng dung môi thích hợp đã được thăm dò bằng sắc ký lớp mỏng Các hệ dung môi sẽ được trình bày cụ thể ở các thực nghiệm

Kiểm tra phân đoạn: bằng sắc ký lớp mỏng Các phân đoạn có thành phần các chất giống nhau được gộp chung và loại dung môi bằng cách cô dưới áp suất giảm

2.3 Tinh chế

Các chất tách được được tinh chế lại bằng cách kết tinh lại trong các dung môi thích hợp Tinh thể thu được được lọc qua phễu thủy tinh xốp, rửa bằng dung môi lạnh và làm khô trong bình hút ẩm

THỰC NGHIỆM

1 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Thành phần hóa học chủ yếu của Nhân trần tía chủ yếu là các nhóm hợp chất: tinh dầu, flavonoid, saponin, coumarin, acid hữu cơ, chất khử Kết quả phân tích sơ bộ

thành phần hóa học của Nhân trần tía được tóm tắt ở Bảng 1

Bảng 1: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của Nhân trần tía

Coumarin ++ Phát huỳnh quang / OH

Phản ứng với thuốc thử diazo

Proanthocyanidin  HCl 10% /t0

Triterpen thủy phân  Phản ứng Liebermann-Burchard

Hợp chất polyuronic  Tủa trong cồn cao độ

Ghi chú: (): không có (±): nghi ngờ (+): có ít

(++): có (+++): có nhiều (++++): có rất nhiều

2 CHIẾT XUẤT VÀ XỬ LÝ SƠ BỘ CAO CHIẾT

2.1 Chiết xuất

Phần trên mặt đất của Nhân trần tía khô được xay thành bột mịn (10 kg) và được chiết với methanol Khi màu của dịch chiết nhạt hẳn và lượng cắn thu được từ dịch chiết còn lại là 0,05% thì dừng chiết

Toàn bộ dịch chiết được cô đến đậm đặc thì đượccắn (A) và dịch nước (B)

2.2 Xử lý sơ bộ cao chiết

Để tách dịch nước B thành các phân đoạn đơn giản hơn, dịch nước B được phân bố

với CHCl3 nhiều lần cho đến khi dịch CHCl3 nhạt màu Kết quả là thu được phần dịch CHCl3 và dịch nước (B 1) Cô quay dịch CHCl3 dưới áp suất giảm thì thu được

cắn (C) Tiếp tục xử lý phần dịch nước B1 bằng cách phân bố với EtOAc nhiều lần cho đến khi dịch thu được nhạt màu thì được phần dịch EtOAc và dịch nước (B 2)

Dịch EtOAc được cô dưới áp suất giảm đến cao khô (D), còn dịch nước B2 được giữ lại để chiết tách saponin và các thành phần phân cực hơn

Qui trình chiết và xử lý sơ bộ cao chiết toàn phần của Nhân trần tía được tóm tắt ở

3 TÁCH PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT TỪ CAO C

3.1 Xử lý sơ bộ cao C

Khi định tính bằng phản ứng hóa học, cao C thu được từ việc phân bố với cao lỏng ban đầu cho phản ứng cyanidin rất r Kết quả này giúp định hướng cho việc chiết tách và phân lập các hợp chất flavonoid trong cao C

Cao C được thăm dò trên sắc ký lớp mỏng rồi khai triển với nhiều hệ dung môi có

độ phân cực khác nhau nhưng không cho kết quả tốt mà chỉ tạo những vết kéo dài

Để tiếp tục đơn giản hóa các thành phần trong cao, C được thử hòa lại trong CHCl3

và cho phân bố với NaOH 5% thì thu được lớp kiềm có màu cam đỏ Tách lấy lớp kiềm và acid hóa lại bằng HCl đậm đặc thì nước kiềm bị đục, tiếp tục acid hóa đến khi thu được dịch nước acid có pH khoảng 2-3 Nước acid được phân bố với CHCl3, lớp CHCl3 thu được có màu đỏ, nước acid trong dần trở lại.

Theo d i bằng sắc ký lớp mỏng dịch CHCl3 vừa thu được với hệ dung môi Bz – EtOAc (7:3) thì thấy trên sắc đồ có 2 vết lớn phát quang màu tím sậm dưới UV 365

nm, gây tắt quang UV 254 nm, tăng màu trong môi trường kiềm, cho màu nâu với FeCl3 1% trong cồn, hiện màu vàng với thuốc thử vanilin - sulfuric Điều đó cho thấy 2 vết này có khả năng là flavonoid Vết có Rf cao hơn được gọi là E, vết còn lại gọi là F

Để tiến hành trên toàn bộ lượng cao C, cao này được hòa lại trong CHCl3 tạo thành cao lỏng rồi cho vào bình nón, thêm NaOH 5%, khuấy bằng máy khuấy từ ở nhiệt

độ thường, tiếp tục như trên cho đến khi nước kiềm thu được nhạt màu Nước kiềm được acid hóa ngay bằng HCl đậm đặc đến khi thu được nước acid có pH khoảng 2-

3 thì dừng

Nước acid được phân bố lần lượt với ether dầu hỏa (PE), CHCl3 thì thu được các

cao tương ứng và được đặt tên là P, C 1

C1 ở dạng cao lỏng để trong điều kiện bình thường thì thấy hiện tượng kết tinh ở đáy becher Tiến hành lọc và rửa phần tinh thể này thu được bột màu vàng, kết tinh lại trong CHCl3 thì thu được tinh thể hình kim

Trên sắc đồ chất này có Rf trùng với vết F Tinh thể này được đặt tên là AB 3 (179,6

mg) Cao C1 sau khi tách chất AB3 được gọi là C 2 và được cô đến cao để tách các flavonoid còn lại

Tiến hành chiết toàn bộ cao C2 với PE – CHCl3 (7:3) thì thu được phần dịch chiết giàu chất E và giảm hẳn các chất phân cực Trên sắc ký lớp mỏng dịch này vẫn còn

Bz – EtOAc

(7:3)

Bz – EtOAc (7:3)

C 1 AB 3 C 1 AB 3

UV 365 nm UV 254 nm AB3 có 3 cực đại hấp thu ở: 342,20 nm;

275,40 nm; 240,80 nm

Hình 2: Sắc ký và phổ UV của AB3

khá phức tạp, không thể tách được chất E bằng cách kết tinh trong dung môi Dịch

này được cô đến cao và được gọi là C 3

Để tách chất E và các chất khác có trong cao C3, sắc ký cột cổ điển được sử dụng

Qui trình tách phân đoạn các chất từ cao C được tóm tắt ở Sơ đồ 2

3.2.1 Phân tách phân đoạn C 3 bằng sắc ký cột:

Để thăm dò hệ dung môi thích hợp cho sắc ký cột phân đoạn C3, các hệ dung môi khác nhau đã được sử dụng để khai triển trên sắc ký lớp mỏng và từ đó đánh giá khả năng tách của từng hệ dung môi Các hệ dung môi sử dụng được trình bày ở Bảng 2

Bảng 2: Các hệ dung môi đã khảo sát STT Hệ dung môi Tỉ lệ STT Hệ dung môi Tỉ lệ

Phân bố với CHCl 3

Cô loại dung môi

Phân bố với NaOH 5%

Dịch CHCl 3 (C) Cao C

Dựa trên khả năng tách các vết và Rf của các chất, hệ 4 và 6 được chọn để tiến hành sắc ký cột với các điều kiện thực nghiệm như sau:

Kích thước cột: 70 x 3,5 cm

Pha tĩnh: silicagel sắc ký cột loại hạt mịn (0,015- 0,040 mm)

Khối lượng pha tĩnh/ chiều cao cột: 300 g/ 60 cm

Khối lượng mẫu: 4,29 g

Thể tích hứng mỗi phân đoạn: 20 ml

Pha động: CHCl3, CHCl3 – EtOAc

Kết quả: các phân đoạn hứng của sắc ký cột sau khi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng được gộp chung, cho bay hơi dung môi thu được 8 phân đoạn (C3.1, C3.2, C3.3, C3.4,

C3.5, C3.6, C3.7, C3.8) trong đó có 6 phân đoạn (C3.3, C3.4, C3.5, C3.6, C3.7, C3.8) đều có

sự hiện diện các vết màu tím dưới UV 365 nm Tất cả các phân đoạn đều được cô dưới áp suất giảm đến cắn khô và được tiếp tục tinh chế để thu các chất tinh khiết Kết quả sắc ký cột được tóm tắt ở Bảng 3

Bảng 3: Kết quả sắc ký cột phân đoạn C3

3.2.2 Phân lập các chất từ các phân đoạn của cột C 3

3.2.2.1 Tách AB1 từ phân đoạn C3.3

Sau khi cô giảm áp, phân đoạn C3.3 được kết tinh lại trong CHCl3 Sau khi lọc qua phễu thủy tinh xốp, rửa bằng CHCl3 lạnh thì thu được tinh thể hình kim, màu đỏ Tinh thể này được đặt tên là AB1 (7,0 mg)

AB1 phát quang màu tím dưới UV 365 nm, tắt quang dưới UV 254 nm, không tăng màu trong môi trường kiềm, không cho màu khi phun FeCl3 1% trong cồn, cho màu vàng khi phun thuốc thử vanilin - sulfuric

AB 1 có 3 cực đại hấp thu ở 398,40 nm;

367,60 nm; 284,80 nm

UV 254 nm

Bz – EtOAc (7:3)