CHIẾT XUẤT HESPERIDIN TỪ VỎ CAM DƯỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA SÓNG SIÊU ÂM

Khi được thực hiện ở cùng nhiệt độ trong cùng một thời gian sử dụng ba tần số, methanol làm dung môi cải thiện năng suất chiết xuất rõ ràng so với ethanol hoặc isopropanol; Bằng cách so

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ KHOA DƯỢC - ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

Lớp cao học khóa 2016 - 2018

CHIẾT XUẤT HESPERIDIN

TỪ VỎ CAM DƯỚI SỰ HỖ TRỢ

CỦA SÓNG SIÊU ÂM Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Học viên cao học: TRÌ KIM NGỌC Thầy hướng dẫn: TS VÕ VĂN LẸO

TP HCM, 04/2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ KHOA DƯỢC - ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO BÁO CÁO HẾT MÔN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

Lớp cao học khóa 2016 - 2018

CHIẾT XUẤT HESPERIDIN

TỪ VỎ CAM DƯỚI SỰ HỖ TRỢ

CỦA SÓNG SIÊU ÂM Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

Học viên cao học: TRÌ KIM NGỌC Thầy hướng dẫn: TS VÕ VĂN LẸO

TP HCM, 04/2017

Bài báo sưu tầm từ tạp chí ScienceDirect năm 2008, trang 227-232

Chiết xuất hesperidin from vỏ Cam (Citrus reticulata) dưới sự hỗ trợ của sóng

siêu âm

Yaqin Ma, Xingqian Ye, Yunbin Hao, Guoneng Xu, Guihua Xu, Donghong Liu * Khoa Khoa học Thực phẩm và Dinh dưỡng, Đại học Chiết Giang, Trụ sở Huajiachi,

Hàng Châu, Trung Quốc Nhận ngày 27 tháng 11 năm 2006; chỉnh sửa ngày 13 tháng 3 năm 2007; Được chấp

nhận ngày 26 tháng 3 năm 2007

Có sẵn trực tuyến 2 Tháng 4, 2007

Tóm tắt

Hesperidin, một bioflavonoid chủ yếu trong vỏ Cam (Citrus reticulata), đã được báo

cáo có nhiều tính chất dược lý Chiết xuất siêu âm là một kỹ thuật hiệu quả để cô lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu Trong nghiên cứu này, việc áp dụng phương pháp siêu âm đã cho thấy hiệu quả hơn trong việc chiết xuất hesperidin từ vỏ

Cam (C reticulata) so với phương pháp cổ điển Ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất siêu âm chủ yếu cho sản lượng chiết xuất của hesperidin từ vỏ Cam (C reticulata)

được đánh giá bao gồm dung môi chiết, thể tích dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết, năng lượng siêu âm, tần số siêu âm Kết quả cho thấy dung môi, tần suất và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng nhất để cải thiện năng suất chiết xuất hesperidin Khi được thực hiện ở cùng nhiệt độ trong cùng một thời gian sử dụng ba tần số, methanol làm dung môi cải thiện năng suất chiết xuất rõ ràng so với ethanol hoặc isopropanol; Bằng cách so sánh ảnh hưởng của tần số, năng suất của hesperidin cao hơn ở 60 kHz so với

ở 20 kHz và 100 kHz Các điều kiện siêu âm tối ưu được xác định như sau: methanol, tần số 60 kHz, thời gian chiết 60 phút và nhiệt độ 40 oC Ngoài ra, công suất siêu âm

có ảnh hưởng yếu đến năng suất chiết hesperidin trong phạm vi thí nghiệm Việc kéo dài thời gian chiết bằng siêu âm không làm suy giảm

1 GIỚI THIỆU

Trái cây có múi là một trong những loại thực vật đóng vai trò quan trọng trong chế độ

ăn uống của con người Các loài trái cây thuộc chi Citrus có số lượng lớn thứ hai ở Trung Quốc, đóng vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm Vỏ Citrus là nguồn

nguyên liệu tiềm năng cho ngành dược phẩm và thực phẩm vì chúng chứa flavonoid đáng kể là các hợp chất hoạt tính sinh học có đặc tính liên quan đến sức khoẻ Chúng

có một vài hydroxyl ở vị trí khác nhau của các vòng, nơi có hoạt động hóa học mạnh Các thành phần như chất chống oxy hoá trong các hệ thống sinh học khác nhau [1,2]

có thể ngừa thai [3], ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư trong ống nghiệm [4], và có hoạt động chống dị ứng và chống viêm [5] Hesperidin là thành phần flavanones phong phú nhất trong vỏ Cam Tuy nhiên, hầu hết vỏ cam quýt trong quá trình chế biến thực phẩm thông thường là các sản phẩm phụ bị lãng phí, dẫn đến ô nhiễm môi

trường Một vấn đề đặc ra cho thực tế trên là thiếu một cách có hiệu quả để chiết xuất các thành phần hữu ích từ vỏ cam quýt

Chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật với dung môi là một phương pháp cổ điển được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghiệp, đặc biệt là ngành dược phẩm Hiện nay y học đang rất quan tâm tới các loại thuốc có nguồn gốc thực vật đã dẫn đến nhu cầu cần sử dụng các phương pháp chiết lý tưởng hơn, có thể thu được tối

đa các thành phần có hoạt tính sinh học trong một thời gian ngắn nhất với chi phí thấp Phương pháp chiết bằng siêu âm đã được chứng minh làm giảm đáng kể thời gian chiết và làm tăng sản lượng chiết được trong nhiều loại thực vật [6-8]

Việc áp dụng siêu âm trong ngành công nghiệp thực phẩm có thể được chia thành hai loại tần số cao cường độ thấp (f> 100 kHz) và siêu âm cường độ cao tần số thấp (20 kHz 6 f 6 100 kHz) Siêu âm cường độ thấp không làm thay đổi các đặc tính vật lý hay hoá học của vật liệu mà sóng siêu âm truyền qua [9] Sóng gây sốc cường độ cao gây

ra áp lực mạnh, sự giảm nhiệt độ và tốc độ do bọt khí gây ra phần lớn các hiệu ứng siêu âm bên trong vật liệu, có thể tạo ra các ảnh hưởng vật lý, hóa học và cơ học [10] Ảnh hưởng của siêu âm cường độ cao đối với quy trình và sản phẩm gây rối loạn vật

lý hoặc thúc đẩy phản ứng hóa học nhất định (ví dụ quá trình oxy hóa) phụ thuộc vào nhiều biến bao gồm các đặc tính trung bình phản ứng, các thông số siêu âm, hiệu suất máy phát siêu âm, kích thước và hình dạng của bể siêu âm [11,12 ] Hiệu suất chiết xuất các hợp chất hữu cơ trong thực vật bằng siêu âm có thể được tăng lên đáng kể khi tác động bằng các tác động cơ học tạo ra sự thâm nhập của dung môi vào các tế bào dẫn đến sự phá vỡ các vách tế bào để tạo điều kiện giải phóng vật chất bên trong [13,14] Hoặc kết hợp các hiệu ứng khác nhau [12], nhưng kết quả tổng hợp của nhiều biến trên hiện vẫn chưa được biết rõ

Gần đây, việc áp dụng công nghệ siêu âm trong chế biến thực phẩm đã thu hút sự quan tâm rộng rãi [15] Nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của kỹ thuật chiết cổ điển và siêu âm

trên năng suất và đặc điểm cấu trúc của các chất chiết xuất từ rơm rạ và rễ của valerian

cho thấy sản lượng và tính ổn định cao hơn [16 , 17] Việc chiết xuất axit carnosic

bằng phương pháp siêu âm từ Rosmarinus officinalis bằng ethanol đã có hiệu quả

trong việc sản xuất năng suất lớn hơn và rút ngắn thời gian chiết [18] Sun và Tomkinson đã báo cáo một kỹ thuật siêu âm từ cây lúa mì, Romdhane và Gourdou

[20] đã chiết xuất pyrethrines từ hoa pyrethrum và dầu từ các hạt bằng siêu âm Việc

tối ưu hóa các biến số siêu âm theo một ma trận thực vật cụ thể cũng rất quan trọng để

đạt được năng suất khai thác cao Trong các trường hợp của Eucommia và hoa

Hibiscus tiliaceus L., các điều kiện chiết siêu âm tối ưu đã được thiết lập

Những công trình trước đó đã chứng minh rằng khai thác siêu âm là một công nghệ tiềm năng trong chế biến thực phẩm và công nghiệp dược phẩm Ứng dụng kỹ thuật siêu âm để chiết xuất hesperidin đã được chứng minh là một quá trình tối ưu [23,24] Tuy nhiên, chưa có báo cáo đầy đủ về ứng dụng kỹ thuật siêu âm để chiết xuất hesperidin từ vỏ Cam Mục tiêu của bài báo này là để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện chiết chính bao gồm dung môi, nhiệt độ, tần số, và năng lượng đối với năng suất

và sự ổn định của hesperidin từ vỏ Cam (C reticulata)

2 THỰC NGHIỆM

2.1 Thiết bị

Các thí nghiệm chiết xuất bằng siêu âm được thực hiện trong các bồn chiết bằng siêu

âm được sản xuất bởi Công ty TNHH Thiết bị Điện tử Siêu âm Quảng Châu của Sonoc, Trung Quốc, có thể hoạt động ở tần số 20 kHz, 60 kHz, 100 kHz với công suất biến đổi và có bộ đếm thời gian kỹ thuật số Và một bộ điều khiển nhiệt độ để điều khiển nhiệt độ, đồng hồ đo điện áp, đồng hồ điện hiện tại được sử dụng để đo điện năng tiêu thụ, một bánh răng quay để đặt các cốc, chiếc cốc được quay khi bánh quay được điều khiển bởi động cơ Đáy bể chứa nước được tạo thành như hình chữ nhật của một kim tự tháp được trang bị năm máy tạo siêu âm tương tự ở mỗi bên Sơ đồ của các thiết bị siêu âm được thể hiện trong Hình 1

Hesperidin sau khi chiết xuất được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong hệ thống Waters 26952996 bao gồm 515 bơm và một cột ODS-2 Econosphere với kích thước 250 x 4,6 mm và cột C-18 (250 mm x 4,6 mm, ID 5 Lm)

từ Công ty TNHH Dilma Technologies (Mỹ)

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc của bộ máy siêu âm

2.2 Vật liệu và thuốc thử

Cam tươi (Penggan) được thu thập từ Quzhou, tỉnh Chiết Giang, Trung Quốc, vào tháng 11 năm 2005 Vỏ Cam được sấy khô trong tủ sấy có lưu thông không khí ở

50 oC, vỏ Cam khô được nghiền trong phòng thí nghiệm với máy trộn lưỡi cắt rồi rây qua cỡ rây 0,45-1 mm và được giữ trong máy hút khô cho đến khi sử dụng Ba dung môi khác nhau: methanol, ethanol, isopropanol được sử dụng để chiết xuất hesperidin

từ vỏ Cam Tất cả các thuốc thử hoá học được sử dụng trong các thí nghiệm đều có độ tinh khiết phân tích

Methanol (thuốc thử cho HPLC), acid acetic băng (chất thử cho HPLC) và nước cất được lọc qua một màng mỏng 0,45 µm trước khi sử dụng Hesperidin chuẩn được mua

từ Công ty TNHH Sigma Aldrich Tất cả thủy tinh và đồ nhựa đã được rửa bằng nước cất

2.3 Phương pháp chiết

1 g bột vỏ Cam được nạp vào một cốc 600 ml (đường kính 8 cm x chiều cao 14,5 cm) bịt kín bằng màng nhựa để tránh mất dung môi và sau đó thêm dung môi chiết xuất với

tỷ lệ chất rắn-lỏng là 1:40 Tỷ lệ hạt và tỷ lệ chất rắn-lỏng được sử dụng trong các thí nghiệm đã được lựa chọn từ nghiên cứu trước [19] Các cốc đã được ngâm trong bồn siêu âm để chiết xuất dưới các điều kiện chiết khác nhau Cuối cùng, chất chiết được được lọc qua màng microporous 0,45 µm và dịch lọc được thu thập để phân tích HPLC Tất cả các thí nghiệm được thực hiện nhiều lần

2.4 Chiết bằng Soxhlet

3 g bột vỏ Cam và 120 ml dung môi được đưa vào bộ máy soxhlet Việc chiết xuất được thực hiện từ 20 đến 160 phút ở 60 o

C, được sử dụng để kiểm soát, so sánh với các phương pháp chiết xuất bằng siêu âm

2.5 Chiết xuất tắm bằng tia cực tím

Ảnh hưởng của năng lượng bức xạ đồng nhất hấp thụ đối với vật liệu trên năng suất của hesperidin được xác định bằng cốc quay với 60 kHz ở 40 oC trong 40 phút Vật liệu trong các thí nghiệm sau đây được xử lý bằng cốc quay

Các mẫu sấy được chiết xuất với tần số 20 kHz, 60 kHz, 100 kHz trong 20 phút ở

30 oC, 40 oC, 50 oC sử dụng methanol, ethanol, isopropanol Song song một khảo sát khác được thực hiện bằng cách sử dụng methanol như dung môi chiết xuất ở 40 °C Thời gian chiết xuất được thực hiện từ 20 đến 160 phút ở 40 oC, trong khi đó các hesperidin chuẩn lần lượt được áp dụng trong các điều kiện siêu âm ở trên theo thứ tự

để kiểm tra nếu thời gian siêu âm mở rộng có thể dẫn đến sự hư hỏng của hesperidin hay không Các mức công suất siêu âm 3,2, 8, 30, 56 W đã được điều tra

2.6 Phân tích bằng sắc ký

Đối với phân tích bằng HPLC, pha động là methanol- nước đã khử ion-acid acetic (10: 1: 14), tốc độ dòng chảy 1 ml / phút, nhiệt độ cột là 25 oC và thể tích mẫu tiêm là

10 μl, bước sóng phát hiện tối ưu của hesperidin là 283 nm Dưới điều kiện trên, hesperidin đạt đến cực đại hấp thu lúc 9,1 phút Hình 2 cho thấy sắc ký đồ HPLC của hesperidin chuẩn

3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của cốc quay đến năng suất chiết xuất của hesperidin từ vỏ Cam

(C reticulata)

Hình 3 cho thấy ảnh hưởng của các loại cốc với năng suất của hesperidin chiết xuất từ

vỏ Cam trong điều kiện siêu âm: thời gian chiết 40 phút, methanol làm dung môi, tần

số 60 kHz, và nhiệt độ 40 oC Có thể thấy rằng Năng suất của hesperidin trong cốc quay cao hơn nhiều so với trong cốc cố định Ngoài ra, năng suất khai thác tăng lên cùng với sự gia tăng nhiệt độ mặc dù có cốc cố định và quay Kết quả có thể liên quan đến các mẫu trong cốc quay có thể thu được cường độ siêu âm mạnh hơn so với mẫu cốc cố định

Hình 2 Sắc ký đồ HPLC của hesperidin chuẩn

30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60

30 40 50 Temperature (°C)

30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60

30 40 50 Temperature (°C)

Hình 3 Ảnh hưởng của cốc quay đến năng suất chiết hesperidin từ vỏ Cam

(C reticulata) sử dụng methanol với tần số 60 kHz trong 60 phút

3.2 Ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và tần số đến năng suất chiết xuất

hesperidin từ vỏ Cam (C reticulata)

Các kết quả được minh họa trong hình 4 cho thấy năng suất chiết hesperidin phụ thuộc vào các dung môi khác nhau Methanol dường như là dung môi chiết suất hiệu quả nhất trong điều kiện siêu âm tương tự, sau đó là ethanol và isopropanol Năng suất chiết xuất khác nhau có thể là do các cực phân giải [19,22] Trong thực tế, hiệu suất chiết của dung môi tăng lên cùng với sự gia tăng nhiệt độ và nhiệt độ dẫn đến sản lượng hesperidin tối đa ở 60 kHz là 50 oC Mặt khác, nhiệt độ cao không có lợi cho việc chiết siêu âm do bay hơi dung môi Vì vậy, 40 oC được chọn là nhiệt độ tối ưu trong các quy trình chiết xuất sau

3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến năng suất chiết hesperidin từ vỏ Cam (C reticulata)

Ảnh hưởng của thời gian chiết khi sử dụng phương pháp siêu âm và soxhlet đối với năng suất chiết hesperidin từ vỏ Cam được thể hiện trong hình 5 Đối với tất cả các trường hợp được trình bày, hàm lượng hesperidin của phương pháp siêu âm được hỗ trợ dưới ba tần số đều cao hơn so với phương pháp soxhlet Năng suất của việc chiết xuất bằng soxhlet trong 160 phút không đạt được bằng phương pháp chiết xuất bằng siêu âm dưới 3 tần số trong 20 phút, ngay cả khi chiết xuất bằng soxhlet ở nhiệt độ

60 oC, nhưng việc chiết xuất bằng siêu âm chỉ ở 40 o

C Kết quả cho thấy lợi thế chiết xuất bằng siêu âm, có thể đạt được ở nhiệt độ thấp hơn và có hiệu quả có thể làm giảm thời gian chiết, so sánh với phương pháp chiết bằng soxhlet

Đối với ba tần số khác nhau, năng suất chiết phụ thuộc đáng kể vào thời gian, tăng lên khi thời gian siêu âm tăng ở ba tần số khác nhau, đặc biệt là từ 20 phút đến 60 phút

Hình 4 Ảnh hưởng của dung môi và tần suất đến năng suất của hesperidin từ vỏ

Cam (C reticulata) công suất 30 W ở nhiệt độ khác nhau trong 20 phút

(A) 20 kHz, (b) 60 kHz và (c) 100 kHz

Y Ma et al / Ultrasonics Sonochemistry 15 (2008) 227-232

đa với ba tần số là khoảng 60 phút Các kết quả tương tự đã được báo cáo trong tài liệu [25]

Để xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến sự ổn định của hesperidin, giải pháp dùng hesperidin chuẩn trong các điều kiện siêu âm tương tự đã được áp dụng Các kết quả thu được bằng phân tích HPLC được thể hiện trong hình 6, có thể thấy rằng nồng

độ dung dịch của hesperidin chuẩn không thay đổi (hình 6), gợi ý rằng hesperidin dưới các thông số siêu âm được lựa chọn trong nghiên cứu này không bị giảm đi Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đó [16,17,26]

3.4 Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm đến năng suất chiết hesperidin từ vỏ Cam (C reticulata)

Hình 7 cho thấy siêu âm có ảnh hưởng yếu đến sản lượng hesperidin theo mức tiêu thụ điện năng bao gồm 2, 3, 8, 30, 56 W ở các tần số khác nhau Bất cứ khi nào năng lượng siêu âm được truyền vào một vật liệu nhẹ như mô của cây, biên độ của sóng giảm với sự gia tăng khoảng cách [27], năng lượng và sự truyền tải khối lượng cũng

Hình 5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến năng suất chiết hesperidin từ vỏ

Cam (C reticulata) sử dụng methanol với tần số khác nhau (20 kHz, 60 kHz,

100 kHz) ở 40 o C và 30 W

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

40

Time (min)

ug/ml 42

20 ug/ml

Hình 6 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến sự ổn định của hesperidin chuẩn

(dung môi methanol với 60 kHz tại 40 o C và 30 W)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ultrasonic intensity (W)

z kH

20 60 k Hz 100 kHz

Hình 7 Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm đến năng suất chiết hesperidin từ vỏ Cam

(C reticulata) với dung môi methanol với tần số khác nhau trong 5 phút ở 40 o C

giảm [28] Sự suy giảm hoạt động này được goị là sự hấp thụ hoặc tán xạ Sự hấp thụ đại diện cho phần năng lượng sóng được chuyển đổi thành nhiệt Do đó, khoảng cách

từ bề mặt bức xạ có thể ảnh hưởng đến cường độ siêu âm, cường độ siêu âm hiệu quả cũng được đo ở gần bề mặt bức xạ của máy phát siêu âm [29] Ngoài ra, khu vực hoạt động của siêu âm, trong đó là các hoạt động hóa học cường độ cao (sonochemistry) và chuyển giao khối lượng lớn (thủy động lực học) (f = 20 hoặc 40 kHz) [28], đã được quan sát trong một xi lanh đường kính 6 cm [29] Trong cuộc khảo sát, khoảng cách từ dưới cùng của cốc đến máy phát siêu âm khoảng 10 cm Do đó, sự khác biệt nhỏ của sản lượng khai thác dưới các mức năng lượng siêu âm khác nhau trong hình 7 có thể một phần do sự kích hoạt siêu âm thấp hơn do khoảng cách xa hơn so với bề mặt bức

xạ

4.Kết luận

Các kết quả từ nghiên cứu này cho thấy rằng dung môi trong chiết siêu âm có ảnh hưởng nhiều nhất đến năng suất chiết xuất Tăng nhiệt độ và thời gian chiết có thể nâng cao hiệu quả chiết Tuy nhiên, việc lựa chọn nhiệt độ và thời gian chiết xuất cần xem xét kỹ càng sự bay hơi của dung môi và độ tan của các hợp chất chiết xuất để tránh mất dung môi ở nhiệt độ cao và giảm chi phí Trong bài báo này, các thông số siêu âm hiệu quả nhất của chiết xuất hesperidin từ vỏ Cam được xác định như sau: methanol, tần số 60 kHz, thời gian chiết 60 phút, nhiệt độ 40 oC Tăng thời gian siêu

âm không làm suy giảm hesperidin Cường độ siêu âm có ảnh hưởng yếu đến năng suất của hesperidin, bởi vì sự hiện diện của một pha phân tán góp phần làm suy giảm sóng siêu âm và phần hoạt động của siêu âm bên trong máy chiết được giới hạn trong vùng lân cận của bộ phát Ngoài ra, sức hấp thụ đồng nhất của các mẫu góp phần làm cho năng suất chiết cao hơn Hiệu quả của siêu âm khi chiết xuất hesperidin phụ thuộc vào nhiều thông số siêu âm tạo ra các ảnh hưởng vật lý, hóa học hoặc cơ học, sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ vỏ Cam