Ứng dụng phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu để đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự suy giảm hàm lượng của chế phẩm 3 vitamin b1, b6, b12

Trong luận văn này, thông qua nghiên cứu khảo sát sự suy giảm hàm lượng các vitamin của viên 3B, chúng tôi muốn thử nghiệm mô hình bố trí thí nghiệm tối ưu hoá thống kê 2k cho việc đánh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ

ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ KIM DUNG

ÚNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP B ố TRÍ THÍ NGHIỆM TỐI ư u ĐỂ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT s ố YẾU TỐ ĐẾN S ự SUY GIẢM HÀM LƯỢNG CỦA

1.1.1.3- Các phương pháp nghiên cứu độ ổn định của thuốc 71.1.3.1 - Phương pháp nghiên cứu lão hoá cấp tốc 71.1.3.2- Phương pháp nghiên cứu lão hoá ở điều kiện thường 10

1.2.1- Phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu 2k 141.2.2- Phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu 2k tâm trực giao 161.3- Phương pháp xác đinh vitamin B1? B6 và Bl2 trong các chế 18 phẩm viên

2.3.1- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 242.3.2- Xử lý toán thống kê số liệu thí nghiệm theo mô hình 2k 25

tâm trực giao

1

3.2.1- Máy móc và dụng cụ 31

3.2.3- Điều kiện tiến hành đinh lượng bằng HPLC 33

3.2.5- Đánh giá độ lặp lai và độ đúng của phương pháp trong 34

điều kiện thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Phân tích dược, phòng Vật lý

đo lường - Viện kiểm nghiệm và Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - Sở Y tế

Hà Nội dưới sự hướng dẫn của PGS PTS Trần Tử An

Trong quá trình thực hiện luận văn này, chúng tôi đã nhận được sự đóng góp quí báu của PTS Trịnh Văn Lẩu, PGS PTS Phạm Quang Tùng, PGS PTS Bùi Kim Liên, DS CKĨĨ Đào Hùng Phi, DS Nguyễn Thi Thuận cùng các đổng nghiệp phòng Vật lý đo lường, các thày cô giáo chuyên ngành kiểm nghiêm, phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Dược Hà Nội; đồng thòi chúng tôi cũng nhận được sự giúp đỡ và tạo mọi điều kiện của Lãnh đạo Trung tâm KNDP Hà Nội và bạn bè đồng nghiệp

Nhân dịp này, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối vói sự giúp đỡ quí báu của thày cô, đổng nghiệp và các đon vị kể trên

- 1

-MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, thị trường thuốc nước ta lưu hành rất nhiều loại thuốc có thành phần hỗn họp các dược chất, trong đó nhiều nhất là các vitamin Các chế phẩm này do nhiều xí nghiệp dược trong nước sản xuất hoặc các công ty nước ngoài nhập vào nước ta dưới nhiều tên biệt dược khác nhau

Độ ổn đinh của các chế phẩm này mới chỉ được nghiên cứu, ghi nhân trong các hồ sơ đăng ký thuốc, ít khi được kiểm tra lại một cách chặt chẽ Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng cũng như các chất làm tăng độ ổn định của dược phẩm chưa được đầu tư nhiều

Thời gian gần đây, việc theo dõi sự thay đổi hàm lượng 3 vitamin trong chế phẩm 3B được một số cơ sở sản xuất và nghiên cứu quan tâm, đặc biệt đã

có những ghi nhận sự suy giảm hàm lượng vitamin B12

Trong luận văn này, thông qua nghiên cứu khảo sát sự suy giảm hàm lượng các vitamin của viên 3B, chúng tôi muốn thử nghiệm mô hình bố trí thí nghiệm tối ưu hoá thống kê 2k cho việc đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn đinh của chế phẩm thuốc Để nghiên cứu vấn đề trên, chúng tôi lựa chọn đề tài "Úng dụng phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu để đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự suy giảm hàm lượng của chế phẩm 3 vitamin B„ B6 và B12"

Mục tiêu của đề tài là:

- Sử dụng mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ cũng như tương tác giữa chúng đến sự suy giảm hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm,

- Úng dụng mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và thời gian đến độ ổn định của chế

phẩm 3 vitamin Bj, B6 và B12.

Luận văn là một công trình khoa học bước đầu nghiên cứu việc ứng dụng mô hình bố trí thí nghiệm trong việc đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố (điều kiện bảo quản) đến độ ổn định của chế phẩm Chúng tôi cố gắng để các kết quả nghiên cứu đạt chất lượng

PHẦN ls TỔNG QUAN

1.1.1- NỘI DUNG NGHIÊN c ú u ĐỘ Ổn ĐỊNH CỦA THUÔC

1.1.1.1- Định nghĩa

Độ ổn đinh của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hay thành phẩm đã bào chế), được bảo quản trong đồ bao gói chuyên dụng, giữ nguyên được những đặc tính vốn có về vật lý, hoá học, vi sinh, đặc tính trị liệu và độc tính trong những giói hạn qui định [2], [4],

Mọi thành phần có hay không có đặc tính trị liệu trong dạng thuốc phân liều đều có thể ảnh hưửng đến độ ổn đinh của chế phẩm Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, bức xạ, độ ẩm, tạp chất trong không khí (đặc biệt là cacbon dioxyd và hoi nước) đều có ảnh hưởng đến độ ổn đinh Yếu tố con người cũng

có ảnh hưởng nhất đinh đến đến độ ổn đinh của thuốc (trong cách bảo quản ) [24], [25]

1.1.1.2- Mục tiêu chính của việc nghiên cứu độ ổn định của thuốc

Nghiên cứu độ ổn định của thuốc nhằm các mục tiêu chính sau đây [4]:

- Lưa chọn công thức bào chế hơp lý, hê thống bao bì hoàn chỉnh,

- Xác đinh tuổi thọ và điều kiện bảo quản hợp lý,

- Chứng minh tuổi thọ đã được đề xuất,

- Thẩm đinh sự thay đổi trong công thức hoặc quá trình sản xuất có những yếu tố nào ảnh hưởng bất lọi đến độ ổn đinh của chế phẩm để có biện pháp khắc phục

4

-Độ ổn định của thuốc được đánh giá thông qua các chi tiêu, thông số sau đây [4], [8], [20], [21], [24], [25], [26]:

- Hình dạng nên ngoài: + Thay đổi màu,

+ Thay đổi hình dạng,

+ Màu sắc,+ Mùi vị,+ Trạng thái,+ Độ đồng nhất,+ Độ hoà tan,

+ Định tính: Sự thay đổi thành phần,+ Đinh lượng: Sự biến đổi hàm lượng hoạt chất,+ Sản phẩm phân huỷ,

+ Tạp chất liên quan,+ Thay đổi pH,

+ Hoạt lực,+ Độ nhiễm khuẩn,+ Nấm mốc,

-1 -1 2 - CÁC YẾU TỐ ĐƯỢC ÁP DỤNG NGHIÊN c ứ u ĐỘ Ổ n ĐỊNH CỦA

THUỐC

Điều kiện nghiên cứu độ ổn định của thuốc được xác định bởi vùng khí hậu dự kiến trong đó sản phẩm thuốc sẽ được phân phối và sử dụng Người ta chia khí hậu trên thế giới để nghiên cứu độ ổn định của thuốc thành 4 khu vục

và theo hướng dẫn của WHO thì Việt Nam nên áp dụng vùng khí hậu IV (vùng khí hậu nóng và ẩm) có nhiệt độ bảo quản tối đa < 60 °c, và độ ẩm tối

đa < 75 %RH

Khí hậu Việt Nam là khí hậu nhiệt đới gió mùa với tổng bức xạ mặt trời cao vào khoảng 125-135 kcal/cnr, mùa hè nóng và độ ẩm cao là nhũng yếu tốbất lợi đến việc bảo quản, lưu thông phân phối thuốc, ảnh hưởng đến độ ổnđinh của thuốc [4], [8], [26] Có thể phân các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn đinh của thuốc thành hai nhóm: Yếu tố ngoại lai và yếu tố nội tại

1.1.2.1- Yếu tô ngoại lai

Nhiệt độ

Nhiệt độ thường thúc đẩy nhanh quá trình phân huỷ thuốc Đối với mỗi loại thuốc, cần xác định nhiệt độ thực nghiệm tối đa thích họp để tránh làm thay đổi trạng thái của thuốc và gây ra những phản ứng mà không xảy ra ở điều kiện thường Ví dụ:

- Nguyên liệu < 60 °c,

- Viên nang, viên nén, dung dịch tiêm truyền < 60 °c,

- Thuốc đạn, thuốc phun sương < 30 °c,

- Các thuốc khác < 40 °c

Ánh sáng

Một số hoạt chất bị phân huỷ dưới tác dụng của ánh sáng thường, đa số các chất bị ảnh hưởng của tia cực tím trong bức xạ mặt trời

1.1.2.2- Yếu tô nội tại

- Sản phẩm của sự phân huỷ và tạp chất có trong nguyên liệu,

- Nước kết tữih: Trong quá trình kết tinh, dược chất có thể ở dạng khan hay hydrat hoá Trong quá trình sản xuất và bảo quản dưới tác động của một số yếu tố như nhiệt độ, dung môi hay áp suất, một phần nước kết tinh bị mất

đã làm giảm tính bền vững của dược chất do sự suy yếu của mạng lưói tinh thể

1.1.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚtJ ĐỘ Ổn ĐỊNH CỦA THUÔC

1.1.3.1- Phương pháp nghiên cứu lão hoá cấp tốc

Nguyên tắc

Phương pháp nghiên cứu lão hoá cấp tốc [2], [4], [21], [24]: ở đây nghiên cứu được bố trí để làm tăng tốc độ phân huỷ hoá học và thay đổi lý học của thuốc bởi các điều kiện bảo quản khắc nghiệt với mục đích theo dõi nhũng phản úng phân huỷ xảy ra, từ đó dự kiến tuổi thọ của thuốc ở điều kiện bảo quản bình thường Nguyên tắc của phương pháp đòi hỏi các yếu tố gây lão hoá vẫn phải nằm trong giới hạn không làm thay đổi cơ chế phản ứng phân huỷ cũng như không làm biến đổi trạng thái tập họp, Gấu trúc lý hoá của nguyên liệu thuốc hoặc các thành phẩm đã bào chế

7

Phát hiện nhanh mức độ phân huỷ của thuốc trong những công thức bào chế khác nhau vói mục đích lựa chọn được công thức bào chế thích họp.

- Dự đoán thời gian mà chế phẩm vẫn giữ được chất lượng khi bảo quản ở những điều kiện khác nhau, từ đó dự kiến tuổi thọ và hạn dùng của thuốc

- Lựa chọn điều kiện bảo quản thuốc [4], [15], [20], [22]

Thông thường điều kiện nghiên cứu lão hoá cấp tốc là nhiệt độ 40±2 °c

và độ ẩm không khí 75+5 %RH trong thòi gian 6 tháng

Cách tính độ ổn định của thuốc theo phương pháp lão hoá cấp tốc

Theo nguyên tắc Van Hoff, có thể tính toán gần đúng tuổi thọ của thuốc theo công thức sau đây [2], [19], [14], [23]:

Tuổi thọ thuốc = K X Tuổi tho ở điều kiện lão hoấ

, T ° accelerated - T ° normal

( — ) (AT/ )

vói A là hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng, thông thường chấp nhận bằng 2

và K là hệ số tốc độ suy giảm tuổi thọ thuốc.

Nghiên cứu theo phương pháp lão hoá cấp tốc nhằm mục đích:

Hộ số K phụ thuộc vào mức tăng nhiệt độ và trong phương pháp Van Hoff giá trị của hộ số K được chấp nhận theo bảng sau:

Ngoài cách tính gần đúng theo phương pháp Van Hoff, tác giả Kennon

L trong tạp chí J Phar Sci., 1964 cũng đua ra tư liệu tính thời gian tối đa và tối thiểu để dự đoán tuổi thọ của thuốc ở các nhiệt độ lão hoá khác nhau Kennon đã chọn năng lượng hoạt hoá trong phương trình Arrhenius

Khi tiến hành nghiên cún ở điều kiện bảo quản với nhiệt độ Tị ta có:

E là năng lưọiig hoạt hoá (kcal/mol),

R là hằng số khí (1,987 cal/°Cmol),

T là nhiệt độ tuyệt đối (K) = nhiệt độ thực nghiệm (°C) + 273,15 (°C)

Ngoài ra có thể tứih toán tuổi thọ của thuốc từ các tư liệu thực nghiệm lão hoá cấp tốc dựa trên phương trình Arrhenius:

d \r\K _ E

dT ~ R T 2

_ 9 _

K t - E 1 1

từ đó ta có: lg ——= - ——(-;—37)

1

Đồ thị biểu diễn IgẢ^ theo giá trị — luôn là một đường tháng [19]

Bằng thực nghiệm, tính được K ở các giá trị nhiệt độ khác nhau Để có giá trị K chính xác, người ta thường áp dụng phương pháp bình phương tối

thiểu Từ hệ số K và nhiệt độ T, tính được E Dựng đồ thị lg K - / ( —) Từ đồ

thị, theo giá trị K ứng với nhiệt độ bảo quản thông thường (20-25 °C), người ta tính được thời gian t qua biểu thức quan hệ K ~ t Và t chính là tuổi thọ của

và độ ẩm không khí 60±5 %RH và trong thời gian 12 tháng

Phương pháp này nhằm đánh giá độ ổn định của thuốc trong điều kiện của vùng khí hậu dự kiến lưu hành

10

-+ Phương pháp nghiên cứu lão hoá cấp tốc có:

- Tương đối chính xác

Nhược điểm:- Đòi hỏi phải có phưoíig tiện máy móc bảo quản mẫu,

- Tuổi thọ xác định bằng phương pháp này chỉ có tính tạm thời.+ Phương pháp nghiên cún ở điều kiện bình thường có:

Nhược điểm: - Tốn nhiều thòi gian hơn phương pháp nghiên cứu lão hoá cấp

tốc

Ngoài hai phương pháp trên, người ta còn nghiên cứu độ ổn định của

thuốc ở những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ 5 °c, 50 °c hay 75 °C;

độ ẩm không khí « 7 5 %RH hoặc cao hơn; chịu tiếp xúc với ánh sáng vùng bước sóng 190-780 nm; hoặc m ở đồ bao gói khi thí nghiệm [20]

Một trong những khó khăn khi nghiên cứu độ ổn định của thuốc là kiểm soát yếu tố độ ẩm cho thí nghiệm Một số tác giả dùng dung dịch các chất hoà tan để duy trì độ ẩm không khí trong buồng vi khí hậu [15], [27] Một số dung dịch thường dùng được tóm tắt ở bảng 1.1

1.1.3.3- Đ ánh giá hai phưoìig pháp trên

Bảng 1.1: Một số dung dịch dùng để duy trì độ ẩm tương đối không khí trong

-1.1.4- ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHẾ PHAM 3B

Trong những năm gần đây, thị trường thuốc nước ta có rất nhiều loại thuốc có thành phần hỗn họp các vitamin Nhiều xí nghiệp dược trong nước đã sản xuất được, đồng thời nhiều công ty nước ngoài đã và đang nhập vào nước

ta những loại thuốc này dưói nhiều tên biệt dược khác nhau Độ ổn đinh của các chế phẩm này mới chỉ được nghiên cứu trong các hồ sơ đăng ký thuốc Việc nghiên cứu sâu các yếu tố ảnh hưởng cũng như các chất làm tăng độ ổn định của nó chưa được đầu tư nhiều Gần đây việc theo dõi hàm lượng chế phẩm 3B theo thời gian bắt đầu được một số cơ sở chú ý đến, đặc biệt là sự suy giảm hàm lượng vitamin B12

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm viên 3B bằng phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu 2k tâm trực giao Thông qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi muốn tìm hiểu khả năng ứng dụng của phương pháp tối ưu hoá thống kê cho việc đánh giá độ ổn định của thuốc

1.2- PHƯƠNG PHÁP BỒ TRÍ THÍ NGHIỆM TÔI Ưu

Trong thực tế sản xuất lưu hành sử dụng thuốc, chúng ta phải xác định các điều kiện bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm tương đối và thời gian bảo quản (trong một giới hạn nhất đinh nào đó) cùng các chi phí cần thiết đảm bảo các điều kiện ấy để hàm lượng hoạt chất còn lại là tối đa Những điều kiện cùng chi phí cần thiết đó được gọi là điều kiện bảo quản tối ưu

Trước hết, khi chưa quan tâm đến vấn đề chi phí (mà nội dung trong nghiên cứu này không đề cập tới được) thì để xác định được điều kiện bảo quản tối ưu, chúng ta phải nghiên cứu sự phụ thuộc của hàm lượng hoạt chất theo các điều kiện bảo quản, ví dụ như nhiệt độ, độ ẩm tương đối và thời gian bảo quản Các yếu tố này làm thay đổi hàm lượng hoạt chất không chỉ đơn thuần theo hiệu ứng của từng yếu tố riêng lẻ m à còn có hiệu ứng tương tác

Sẽ rất có ích cho việc nghiên cứu vấn đề ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện bảo quản lên hàm lượng hoạt chất trong dược phẩm bằng việc sử dụng

mô hình toán học: Việc nghiên cứu mối quan hệ giữa một bên là hàm lượng hoạt chất và bên kia là tổ họp của nhiều yếu tố điều kiện bảo quản, trên phương diện toán học thực chất là nghiên cứu một hàm số có nhiều biến số

Mô hình toán học trong trường họp này chính là tìm cách biểu diễn mối quan

hệ trên bằng một biểu thức toán

Gọi y là hàm lượng hoạt chất còn lại sau thời gian bảo quản x l, ở nhiệt

độ x 2 và độ ẩm tương đối x 3 Khi đó mối quan hệ giữa hàm lượng hoạt chất

còn lại là hàm mục tiêu và các yếu tố bảo quản là thời gian, nhiệt độ và độ ẩm (các yếu tố khác được giữ không đổi) được biểu diễn dưới dạng một hàm số 3 biến số:

Vì các yếu tố điều kiện chỉ được xem xét trong một giới hạn nào đó, cho nên ta có điều kiện hạn chế:

Bằng nghiên cứu thí nghiệm và xử lý toán học thống kê các kết quả,

chúng ta sẽ thu được cách biểu diễn gần đúng của hàm số ỵ = /(xl5 x z, x 3)

Nghiên cứu biểu thức gần đúng của hàm số bằng các phương pháp toán học chúng ta sẽ tìm được bộ biến số X ị * , x 2*, *3* xác định _ynrix tức là điều kiện bảo quản tối ưu:

-nghiệm không nhiều mà vẫn cho phép tìm được một qui luật hồi qui

ỵ = f(x v x 2, x 3) có độ tin cậy thống kê cao và có ý nghĩa thực tế [16], [ 17],

1.2.1- PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM T ố i ƯU 2K

Phương pháp bố trí thí nghiệm 2k cho nhiều (k) yếu tố là phương pháp

bố trí thí nghiệm tối ưu được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp được

tiến hành với việc thí nghiệm xác định y khi các yếu tố nhận một trong hai

giá trị hoặc thấp hoặc cao Phương trình hồi qui thu được sẽ phản ánh ảnh hưởng bậc một của các yếu tố Phương pháp bố trí thí nghiệm 2k như vậy đặc biệt hữu hiệu trong những trường họp mà người nghiên cứu có thể đoán trước rằng vai trò ảnh hưởng của các yếu tố là bậc một Vói k = 3 ,1TLÔ hình bố trí thí nghiêm 23 cho phép ta xây dụng phương trình hồi qui _y = f(x ], x 2, x 3) bậc một

-Bảng 1.2 trình bày mô hình bố trí thí nghiệm 23 đầy đủ Để tăng độ chính xác của thí nghiệm, các thí nghiệm được tiến hành theo một thứ tự ngẫu nhiên và mỗi thí nghiệm được làm lặp lại nhiều (n) lần Số thí nghiệm phải làm sẽ là N = 23.n , ví dụ khi làm thí nghiệm lặp lại 3 lần thì người nghiên cứu phải làm tất cả 23.3 = 24 thí nghiệm Trong những trường họp m à phương pháp

đo trong thí nghiệm có sai số lớn, tính lặp lại kém thì cần phải tăng số lần lặp của thí nghiệm cho nên con số thí nghiệm cần tiến hành tương đối lán Để rút bót số thí nghiệm phải làm, có thể áp dụng bố trí thí nghiệm 23 rút gọn, theo

đó người làm thí nghiệm chỉ làm vói một phần của 23 điều kiện tổ họp khác

2 zn

nhau (ví du bố trí thí nghiêm nửa 23 với tất cả —— thí nghiêm)

Bảng 1.2: Mô hình bố trí thí nghiệm tối ưu 23 đầy đủ

Ghi chú: Các thí nghiệm được tiến hành theo thứ tự ngẫu nhiên, ký hiệu khác:

(-1) ứng vói giá trị thấp; (+1) ứng với giá trị cao (x) thể hiện tương tác của 2 hay 3 yếu tố

(-l)x (+ l)= (-l); (-l)x (-l )=(+!); (+ l)x (+ l)= (+ l)

15

-1.2.2- PHƯƠNG PHÁP BÔ TRÍ THÍ NGHIỆM T ố i ư u 2K TÂM TRựC GIAO

Để tăng mức độ phù họp của phương trình hồi qui, trong một số trường hợp người ta dùng mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao là mô hình mở rộng của mô hình bố trí thí nghiêm 2k Phương trình hồi qui thu được sẽ phản ánh ảnh hưởng bậc hai của các yếu tố Theo mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao, ngoài các thí nghiệm cơ sở (mức ±1) như ở mô hình bố trí thí nghiệm 2k, người ta làm thêm các thí nghiêm ở tâm (mức 0) và ở các điểm cánh sao (mức ± a) trên trục toạ độ của yếu tố Với k = 3, mô hình bố trí thí nghiệm 23 tâm trực giao cho phép ta xây dưng phương trình hồi qui

công thức (1.7) Để bố trí thí nghiệm có tính trực giao khi k = 3 thì a = 1,215

v ầ ọ = 0,7302.

Bảng 1.3 trình bày m ô hình b ố trí th í nghiêm 23 tâm trưc giao Theo m ô hình bố trí thí nghiệm này, do số thí nghiệm cần phải làm lớn nên thí nghiệm chỉ làm một lần, riêng thí nghiệm ở tâm được lặp lại nhiều (n) lần Cũng như trong mô hình 23, các thí nghiệm được tiến hành theo một trật tụ’ ngẫu nhiên [6], [16], [17]

16

-Bảng 1.3: Mô hình bố trí thí nghiệm tối ưu 23 tâm trực giao

Ghi chú: Các thí nghiệm được tiến hành theo thứ tự ngẫu nhiên, ký hiệu khác:

(-1) ứng vói giá trị thấp; (+1) ứng với giá trị cao,(0) ứng với giá trị ở tâm (trung bình),

(x) thể hiện tương tác của 2 hay 3 yếu tố (-l)x (+ l)= (-l); (-l)x (-l)= (+ l); (+ l)x (+ l)= (+ l)

% t

[ C H g - M

V c-Ặci '

Trong nghiên cứu luận văn này, chúng tôi áp dụng mô hình bố trí thí nghiệm 23 tâm trực giao nói trên để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt

độ, độ ẩm và thời gian bảo quản lên hàm lượng của thuốc

1.3- PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B 1? B6 VÀ B 12 TRONG CÁC CHÊ PHẨM VIÊN

1.3.3- PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

Phương pháp sắc-ký lỏng hiệu năng cao cho phép định lượng đổng thời các vitamin nhanh, chính xác, hiệu quả cao [5], [11], [12]

1.3.3.1- Nguyên tắc định lượng

Dung dịch hỗn họp vitamin được đưa qua van tiêm mẫu và được một dung môi động kéo qua cột phân tách nhờ một bơm cao áp Tại cột xảy ra quá

18

-trình tách các vitamin trong hỗn hợp dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không tan được vào nhau, luôn tiếp xúc vói nhau: Một pha tĩnh (nằm trong cột tách) luôn giữ lại trong cột các vitamin khác nhau, và một pha động (dung môi động) chảy qua cột luôn rửa giải các vitamin ra khỏi cột với các mức độ manh yếu khác nhau Kết quả là các vitamin khác nhau sẽ ra khỏi cột với các thời gian khác nhau tạo ra sự phân tách Cơ chế được biểu diễn bằng phương trình sau [7]:

s w + nM(a) = s(a) + nM(m)trong đó:

S(m) là phân tử chất tan trong pha động,

S(a) là phân tử chất tan ở bề mặt pha tĩnh a,

M(m) là phân tử pha động trong pha động,

M(a) là phân tử pha động ở bề mặt pha tĩnh a

Pha tĩnh và pha động phải được lựa chon sao cho hệ số hệ số phân bố của các vitamin phải khác nhau thì mói tạo ra sự phân tách

Hệ số phân bố K được tính theo công thức [5]:

C(s) là nồng độ vitamin trong pha tĩnh,

C(m) là nồng độ vitamin trong pha động,

là thể tích pha tĩnh chứa trong cột,

W(s) là khối lưọíig pha tĩnh chứa trong cột,

V (m) là tổng thể tích của pha động chứa trong cột.

_ 19 _

Để tách hỗn họp vitamin tan trong nước, hầu hết các tài liệu đều giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng đảo pha, tức là dùng một pha tĩnh không phân cực (như các hạt polimer, hydrocacbon ) và pha động là dung môi phân cực (như nước, methanol ).

Để tách các vitamin, ngoài việc dựa vào hệ số phân bố của chúng trong pha tĩnh và pha động, nhiều tài liệu còn giới thiệu chương trì nil phối họp sắc

ký tạo cặp ion dựa trên nguyên tắc các ion vitamin được tạo cặp ion với ion trái dấu anion, đã thêm vào trong pha động để tạo cặp ion đi qua cột dưới dạng cặp ion không ion hoá phân cực (thường dùng natri heptansulphonat hoặc natri octansulphonat) [7]

Kỹ thuật này thường được dùng cho sắc ký lỏng đảo pha với pha tĩnh là silicagel được alkyl silan hoá

Sau khi các vitamin được tách ra khỏi hỗn hợp và đi ra khỏi cột, chúng lần lượt được phát hiện bởi detector quang phổ tử ngoại Detector chuyển túi hiệu sang máy tính ta sẽ nhận được sắc ký đồ và thông tin đinh tính (thòi gian lưu) và đinh lượng (diện tích hoặc chiều cao pic)

Với việc tiến hành đo song song mẫu thử và mẫu chuẩn hỗn họp vitamin trong cùng điều kiện ta sẽ đinh tính được các vitamin dựa vào sự giống nhau về thời gian lưu của từng vitamin tưoĩig ứng trong mẫu thử và mẫu chuẩn, và tính được hàm lượng các vitamin trong mẫu thử dựa vào công thức:

+ Với thuốc viên:

-trong đó

s và s là diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử và mẫu chuẩn,

a là lượng cân bột viên đem thử (g),

mv là khối lượng trung bìn h của viên (g),

1 Theo Dươc điển Mỹ - USP 23:

ii) Định lượng vitamin Br

- Cột L] theo USP 23 (15 cm X 4,6 ram; 5 |im),

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến bước sóng 550 nm,

- Dung môi động: Methanol + Nước (35+65),

21

Tốc độ dòng 0,5 ml/phút,

- Thể tích tiêm 20 ịil,

- Nồng độ dung dịch tiêm 1 |ig/ml

2 Theo tài liêu của Viên Kiểm nghiêm Viẽt Nam

Định lượng đồng thời các vitamin Bị, Bn, B6, B r , c , p p

- Cột Lichrosorb RP18 (250 X 4 mm; 5 hoặc 10 Ịxm),

- Detector quang phổ tử ngoại bước sóng 280 nm đo Bj, B2, B6, c , pp và bước sóng 361 nm đo B12,

- Dung môi động: 1,1 g Natri Heptaiisulphonat cho 1 lít hỗn họp gồm

Acetonitril + Methanol + dd Diethylamin 2% + dd Acid Acetic 2% (2 + 3

Đó là khoảng tuyến tính được khảo sát của các vitamin, tuỳ theo tỷ lệ hàm lượng vitamin trong chế phẩm mà pha dung dịch đem đo cho phù họp Thông thường dung dịch có nồng độ vitamin B6 từ 20-50 ỊUg/ml

Các thuốc hỗn họp vitamin phổ biến hiện nay có tỷ lệ hàm lượng các vitamin c , B6, Bj, B đều cho phép đo được đồng thời trên một sắc ký đồ với chương trình trên, riêng vitamin B12 vì hàm lượng quá thấp so vói các vitamin

khác nên phải đo trên sắc ký đổ riêng biệt với chương trình có thay đổi là detector đặt bước sóng 361 nm, tốc độ dòng 2 ml/phút.

3 Theo phương pháp của Viên Kiểm nghiêm Malaysia

- Cột Spherisorb C8 (250 X 4,6 mm),

- Detector quang phổ tử ngoại bước sóng 280 ran,

- Dung môi động: Trộn 1,08 g natri heptasulphonat + 2,0 g kali clorid + 2,0

ml propylenglycol 400 +10,0 ml acid acetic băng + 1 3 0 ml methanol +nước vừa đủ 1000 ml,

- Tốc độ dòng 2,0 ml/phút,

- Thể tích tiêm 20 jul

23

-PHẦN 2: NỘI DUNG, ĐÔÌ TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CÚtJ

2.1- NỘI DƯNG NGHIÊN c ứ u

- Sử dụng mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ cũng như tương tác giữa chúng đến sự suy giảm hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm,

- ứ ig dụng mô hình bố trí thí nghiệm 2k tâm trực giao để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và thòi gian đến độ ổn định của chế phẩm 3 vitamin Bj, B6 và B12

2.2- ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

Viên bao phim B l, B6, BI 2

2.3.1- PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

- Đinh lượng vitamin B, và B6 theo phương pháp của Viện kiểm nghiệm Malaysia,

- Định lượng vitamin Bp theo phương pháp của Dược điển Mỹ 23 ơ iú n g tôi tiến hành định lượng lại vitamin B12 chuẩn bằng phương pháp quang phổ tử ngoại trước khi tiêm dung dịch này

Cách xử lý mẫu

Xử lý mẫu đ ể đinh lượng vitamin Bị và Bổ theo tài liêu Viên Kiểm nghiệm

Malaysia:

Mau thử: Lấy lượng bột viên tương đương 1/4 viên hoà tan vừa đủ 50 ml vói

acid acetic 1,3%, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc và màng lọc minipore 0,45 |im

24

-Mấu chuẩn: Lấy các chất chuẩn B, và B6 vód lượng tươiig ứng 1/4 viên hoà tan

trong acid acetic 1,3% vừa đủ 50 ml

Xử lý mẫu đ ể định lượng vitamin B12 theo USP 23:

Mẩu thử: Lấy một lượng bột viên chứa khoảng 100 |ig vitamin B12 thêm 100

St X m c X C%ch X (độ pha loãng m ẫu thử) X m X 100%

s c X mt X (độ pha loãng mẫu chuẩn) X (hàm lượng vitamin ghi trên nhãn)

Tính hàm lượng % vitamin B12:

St X D 361 X (độ pha loãng m ẫu thử) X m X 100%

St X m t X 207 X (hàm lượng vitam in ghi trên nhãn)trong đó:

St và Sc là diện tích peak của mẫu thử và mẫu chuẩn,

ĩrĩ là khối lượng trung bình viên,

207 là E\ của vitamin B12 ở bước sóng 361 nm

2.3.2- XỬ LÝ TOÁN THỐNG KÊ SÔ LỆU THÍ NGHỆM THEO MÔ HÌNH 2K

TÂM TRỰC GIAO

Trước tiên cần nghiên cứu lựa chọn dải biến thiên của các yếu tố trong

25

-khảo sát Các yếu tố đó sẽ được m ã hoá theo công thức (1.7) và mô hình bố trí thí nghiệm được thiết lập theo bảng 1.3 Dựa vào bảng 1.3, tiến hành làm tùng

thí nghiệm xác định giá trị hàm mục tiêu y theo một phương pháp tin cậy Tại

các điểm cơ sở và điểm cánh sao, mỗi thí nghiệm làm một lần Tại điểm tâm, làm thí nghiệm lặp lại nhiều lần, giá trị hàm mục tiêu trung bình được ghi nhận cho thí nghiệm thứ 15 trong bảng 1.3

Cần lưu ý là ngoài những yếu tố khảo sát trong thí nghiệm, các yếu tố khác cần được kiểm soát không thay đổi giá trị trong quá trình xác đinh hàm

Để thuận tiện cho mô tả tính toán, đưa thêm vào mô hình biến yếu tố đã

mã hoá x0 ứng vói số hạng tự do b0 trong phương trình hồi qui và x0n = 1 (n=l,N)

Các hệ số phương trình hồi qui được xác định như sau:

nữ - 1A-1chỉ số 0 ký hiệu cho thí nghiệm tại tâm, lặp lại k=l , n0

Khi ttính > tbảng tra theo độ tin cậy thống kê p = 0,95 và số bậc tự do

f = n0- l thì hệ số là có ý nghĩa: Lúc này thành phần ứng với hệ số đó lớn hơn

27

Để đánh giá tính phù họp của phương trình hổi qui thu nhận được với thực nghiệm, ta dùng chuẩn phân phối F (Fisher) Sau khi loại bỏ khỏi phương trình hồi qui các hệ số không có ý nghĩa như đã đánh giá trên đây, tính giá trị

hàm mục tiêu ỳ (n=l,N ) theo phương trình hổi qui Việc loại bỏ hệ số không

có ý nghĩa ra khỏi phương trình hồi qui chỉ có nghĩa là thành phần ứng với hệ

số đó nhỏ hơn sai số thí nghiệm

Xác định phương sai dư của mô hình như sau:

trong đó L là số số hạng còn lại trong phương trình hổi qui sau khi đã loại bỏ các hê số không có ý nghĩa và N là số th í nghiệm của m ô hình:

Điều kiện để phương trình hồi qui phù họp với thực nghiệm là Ftính < Fbin tra theo độ không tin cậy thống kê a = 1 - p = 0,05 và bậc tự do

f, = N-L và fo = n0- 1: Lúc này sai khác giữa giá trị hàm mục tiêu tính theo

N = 23 + 2.3 + 1 = 15

(2.15)

28

-phương trình hổi qui và giá trị hàm mục tiêu xác đinh được từ thực nghiệm không có ý nghĩa thống kê, nghĩa là phương trình hồi qui thu được mô tả đúng thực nghiệm [6], [16].

29

-PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CÚXJ VÀ BÀN LUẬN

3.1- CHỌN LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MAU

3.1.1- CHỌN LẤY MẪU

Mẩu được lấy ngay sau khi xuất xưởng Mẫu là viên bao phim vitamin

Bj, B6 và B12 với hàm lượng nhãn là 125 mg, 125 mg và 250 |ig tương ứng:

- Số đăng ký: V N A -1342-98

- Số k iểm soát: 060699

- Nơi sản xuất: Xí nghiệp dược phẩm Trưng ương I

3.1.2- HÀM LƯỢNG BAN ĐẦU CỦA MAU

90,0 - 110,0 % 101,27 %

3.1.3- BẢO QUẢN MẪU

Mẫu sau khi thu nhận được xếp vỉ trong hộp giấy và sau đó được đưa vào bảo quản theo tổ họp các điều kiên thí nghiệm tối ưu 23 tâm trực giao

Mẫu được bảo quản trong các bình có chứa dung dịch đảm bảo duy trì

độ ẩm thích họp Bình được đặt vào trong phòng điều hoà hoặc tủ sấy có nhiệt

kế theo dõi nhiệt độ và thường xuyên theo dõi độ ẩm bằng ẩm kế

30

-3.2- TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

3.2.1- MÁY MÓC VÀ DỤNG c ụ

Đ ã sử dụng các dụng cụ sau đây:

- Buồng thí nghiệm có điều hoà không khí,

- Tủ sấy: Susarka - Ba Lan: SU-22, N° 2858, 220 VAC, 50 Hz,

- Bình thuỷ tin h k ín cùng dung dịch m uối tạo độ ẩm cần thiết [14], [27] + dd NaCl bão hoà tạo độ ẩm 75 %RH,

+ dd NaCl gần bão hoà tạo độ ẩm 73 %RH,

+ dd KoS0 4 gần bão h o à tạo độ ẩm 95 % RH,

+ dd K ,S 04 bão hoà tạo độ ẩm 97 %RH,

+ dd KC1 bão hoà tạo độ ẩm 85 %RH

Đ ã sử dụng các máy phân tích sau đây:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

+ Bơm cao áp: Bin Pump G1312, Serial N° 72001638,

+ Detector: GI 315A - DAD - Serial N° 72002803,

+ Bộ phận tiêm mẫu: 20 |il - G1328A Man Inj DE 54001223,

+ Máy in HP Laser Jet 6L,

+ Cột RP 8 (10 n) 250 X 4,6 mm,

+ Cột RP 18 (10 |i) 200 X 4,6 mm,

+ Chưong trình xử lý dữ liệu Hewlett Packard Brio,

+ Dung môi cho HPLC,

+ Thuốc thử: Tinh khiết, phân tích