Nghiên cứu công thức kem chứa tinh dầu dương cam cúc và chitosan

Do ảnh hưởng của môi trường sống hoặc do bệnh lý, nghề nghiệp… các bệnh về da có xu hướng ngày càng gia tăng. Bên cạnh các thuốc có tác dụng toàn thân, những sản phẩm sử dụng tại chỗ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh ngoài da. Trên thị trường hiện có nhiều sản phẩm có nguồn gốc hóa học như sulfamid, penicilline, kháng dị ứng, corticoid... tuy nhiên đa số các sản phẩm này có thể đem đến tác dụng phụ cho da sau một thời gian điều trị vì bệnh về da là những bệnh hay tái phát và phải điều trị lâu dài. Do đó các sản phẩm điều trị có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi vì tính an toàn và hiệu quả. Dương cam cúc là dược liệu có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm mạnh, từ lâu đã được dùng điều trị các bệnh ngoài da cho hiệu quả rất tốt. Trong khi đó, chitosan được chiết xuất từ vỏ tôm cua đã được chứng minh có khả năng tạo màng bảo vệ và hỗ trợ làm lành vết thương rất hiệu quả. Sự phối hợp hai nguồn nguyên liệu này có thể làm tăng tác dụng điều trị trong các bệnh về da. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu công thức kem chứa tinh dầu dương cam cúc và chitosan” được thực hiện nhằm góp phần nghiên cứu các sản phẩm điều trị ngoài da chất lượng, an toàn, có hiệu quả trị liệu cao từ các nguồn nguyên liệu trong tự nhiên. Đề tài đã tiến hành các nội dung cụ thể sau: Kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào tinh dầu dương cam cúc và chitosan. Xây dựng, tối ưu hóa công thức và kiểm tra chất lượng của chế phẩm. Nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC YẾN

NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC KEM CHỨA TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC VÀ CHITOSAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh-năm 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC YẾN

NGHIÊN CỨU CƠNG THỨC KEM CHỨA TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC VÀ CHITOSAN

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Anh Vũ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học “Nghiên cứu công thức kem chứa tinh dầu dương cam cúc và chitosan” em đã nhận được sự hướng dẫn và

giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè.

Xin gửi đến cô Th S Trần Anh Vũ lòng biết ơn sâu sắc, cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ hoàn thành tốt khóa luận và đúng tiến độ.

Cám ơn ban Giám đốc công ty Thorakao đã cung cấp nguyên liệu, tạo điều kiện cho khóa luận được hoàn thành.

Chân thành cảm ơn cô TS Nguyễn Thị Chung, cô đã hướng dẫn thiết kế và tối ưu hóa công thức.

Chân thành cảm ơn cô PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương và các cô tại Trung tâm Sâm - Dược Liệu đã hướng dẫn thực hiện các thử nghiệm dược lý.

Chân thành cảm ơn thầy Th S Phạm Đình Duy đã dành thời gian đánh giá, nhận xét và phản biện để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Vô cùng cám ơn thầy cô bộ môn Bào Chế, bộ môn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm, bộ môn Dược Liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho việc hoàn thành khóa luận.

Cảm ơn các bạn lớp Dược 2005 đã luôn quan tâm động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Nguyễn Ngọc Yến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

NỘI DUNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tinh dầu dương cam cúc 2

2.2 Chitosan 6

2.3 Tá dược sử dụng trong nghiên cứu công thức 14

2.4 Dạng bào chế nghiên cứu 15

2.5 Tổng quan các phương pháp thử tác dụng kháng viêm 16

2.6 Tổng quan về tối ưu hóa công thức 18

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng - hóa chất - thiết bị trong nghiên cứu 20

3.2 Kiểm nghiệm nguyên liệu 21

3.3 Nghiên cứu công thức bào chế kem thuốc 23

3.4 Phương pháp thử tác dụng kháng viêm 25

3.5 Bố trí thí nghiệm và tối ưu hóa công thức 28

3.6 Thử nghiệm tính kháng viêm của thành phẩm 30

3.7 Phương pháp kiểm tra chất lượng kem 31

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

4.1 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu 33

4.2 Nghiên cứu công thức bào chế kem thuốc 35

4.3 Bố trí thí nghiệm và tối ưu hóa công thức 38

4.4 Kết quả thử tác dụng kháng viêm của thành phẩm 41

4.5 Kiểm tra chất lượng của kem thuốc 42

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO iv

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thiết bị nghiên cứu 20

Bảng 3.2 Thành phần - tỉ lệ tá dược trong các hệ thăm dò 23

Bảng 3.3 Nồng độ tinh dầu dương cam cúc và chitosan khảo sát 24

Bảng 3.4 Các yếu tố khảo sát 29

Bảng 3.5 Mô hình bố trí thí nghiệm 29

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu thăm dò hệ tá dược 35

Bảng 4.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh dầu dương cam cúc và chitosan trong tác dụng kháng viêm 37

Bảng 4.8 Các yếu tố khảo sát 38

Bảng 4.9 Mô hình bố trí thí nghiệm 38

Bảng 4.10 Kết quả trung bình hiệu lực kháng viêm ở mức cơ bản 38

Bảng 4.11 Tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box-Willson 39

Bảng 4.12 Hiệu lực kháng viêm của chế phẩm và thuốc đối chiếu 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc bisabolol oxide A 3

Hình 2.2 Cấu trúc bisabolol oxide B 3

Hình 2.3 Cấu trúc α-bisabolol 3

Hình 2.4 Cấu trúc của chamazulen 3

Hình 2.5 Cấu trúc matricin ( proazulen) 3

Hình 2.6 Cấu trúc chitosan 6

Hình 4.7 Sắc ký đồ tinh dầu dương cam cúc 33

Hình 4.8 Phản ứng màu của test Van Wisselingh 35

Hình 4.9 Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng viêm của lô dùng chế phẩm so với lô dùng thuốc đối chiếu 41

Hình 4.10 Sắc kí đồ của tinh dầu dương cam cúc trong chế phẩm 43

Sơ đồ 3.1 Tóm tắt qui trình điều chế kem thuốc theo phương pháp trộn đều nhũ hóa 25

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Do ảnh hưởng của môi trường sống hoặc do bệnh lý, nghề nghiệp… các bệnh về da có xu hướng ngày càng gia tăng Bên cạnh các thuốc có tác dụng toàn thân, những sản phẩm sử dụng tại chỗ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh ngoài da Trên thị trường hiện có nhiều sản phẩm có nguồn gốc hóa học như sulfamid, penicilline, kháng dị ứng, corticoid tuy nhiên đa số các sản phẩm này có

thể đem đến tác dụng phụ cho da sau một thời gian điều trị vì bệnh về da là những bệnh hay tái phát và phải điều trị lâu dài Do đó các sản phẩm điều trị có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi vì tính an toàn và hiệu quả

Dương cam cúc là dược liệu có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm mạnh, từ lâu đã được dùng điều trị các bệnh ngoài da cho hiệu quả rất tốt Trong khi đó, chitosan được chiết xuất từ vỏ tôm cua đã được chứng minh có khả năng tạo màng bảo vệ và hỗ trợ làm lành vết thương rất hiệu quả Sự phối hợp hai nguồn nguyên liệu này có

thể làm tăng tác dụng điều trị trong các bệnh về da Vì vậy đề tài “Nghiên cứu

công thức kem chứa tinh dầu dương cam cúc và chitosan” được thực hiện nhằm

góp phần nghiên cứu các sản phẩm điều trị ngoài da chất lượng, an toàn, có hiệu quả trị liệu cao từ các nguồn nguyên liệu trong tự nhiên Đề tài đãõ tiến hành các nội dung cụ thể sau:

- Kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào tinh dầu dương cam cúc và chitosan

- Xây dựng, tối ưu hóa công thức và kiểm tra chất lượng của chế phẩm

- Nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG - HÓA CHẤT - THIẾT BỊ TRONG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Tinh dầu dương cam cúc: Nhóm nghiên cứu của Đại Học Y dược TPHCM - Đạt tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) về cảm quan, tỉ trọng, hàm lượng… theo tài liệu [15]

- Chitosan do công ty mỹ phẩm Lan Hảo (Thorakao) cung cấp - TCCS

- Các tá dược điều chế kem thuốc (olivem 1000, oliwax…) - TC B&T

- Súc vật thử nghiệm kháng viêm: Chuột nhắt trắng, phái đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 gam) được cung cấp bởi Viện

Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang

Thiết bị nghiên cứu

Bảng 3.1 Thiết bị nghiên cứu

Máy đo thể tích chân chuột Plethysmometer 7140 Ý

Hóa chất – dung môi dùng trong nghiên cứu

- Các chất chuẩn: guaiazulen, bornyl acetat, borneol do hãng Merk cung cấp

- Kem đối chiếu dùng trong thử nghiệm kháng viêm: Kem CC05 – do Promat’s Int (Pháp) sản xuất chứa tinh dầu dương cam cúc, số lô 6585, hạn dùng: đến năm 2012

- Dung môi: benzen, ethyl acetat, toluen (Trung Quốc)

- Thuốc thử: dung dịch lugol, anisaldehyd, kali cromat

KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU

Kiểm nghiệm tinh dầu dương cam cúc

3.1.1.1 Cảm quan

Chất lỏng màu xanh dương đậm, mùi đặc trưng

3.1.1.2 Định tính

Định tính bằng phương pháp hóa học

Hòa 0,25 g của dimethylaminobenzandehyd trong 5 ml acid phosphoric, 45 ml acid acetic và 45 ml nước Chuyển 2,5 ml của dung dịch này và 0,1 ml của dịch thử cho vào

ống nghiệm Đun cách thủy trong 2 phút, làm lạnh Thêm 5 ml hexan, lắc nhẹ, xuất hiện lớp ngăn cách có màu xanh da trời

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng [15], [17].

- Bản mỏng silicagel GF 254 bản nhôm tráng sẵn

- Dung dịch thử: Lấy 0,5 ml tinh dầu nguyên liệu hòa trong 0,5 ml toluen

- Dung dịch chuẩn: Hòa 1 mg borneol, 1 ml bornyl acetat và 0,4 ml guaiazulen trong 1 ml toluen

- Dung môi khai triển: benzen:ethyl acetat (9:1)

- Khoảng khai triển: 10 cm

- Thuốc thử phát hiện: Hòa 0,5 ml anisaldehyd và 10 ml acid acetic băng, thêm

85 ml methanol, lắc đều Thêm từ từ 5 ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều

- Tiến hành: Chấm khoảng 10 μl dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên bản mỏng

- Phát hiện: Phun thuốc thử phát hiện anisaldehyd đã pha ở trên, sấy ở nhiệt độ 100-105 0C trong 5-10 phút, quan sát dưới ánh sáng thường Nhận xét về màu sắc và Rf các vết của mẫu thử so với mẫu đối chiếu

Kiểm nghiệm chitosan

3.1.1.3 Cảm quan

Bột trắng mịn, không mùi, không vị

3.1.1.4 Định tính

Chitosan đã sử dụng là dạng có khả năng hòa tan trong nước tạo thành dịch gel trong suốt Hòa tan 0,01 g chitosan trong 10 ml nước được dịch A, dùng dung dịch A thực hiện các phản ứng định tính

- Test Van Wisselingh: Đây là test đặc hiệu cho chitosan Lấy 1ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt lugol, dung dịch có màu nâu, thêm 2 giọt H2SO4 10% dung dịch chuyển sang màu đỏ tím [5], [31]

- Phản ứng với kali cromat: Cho 1 ml kali cromat 5% vào 5 ml dung dịch A, xuất hiện kết tủa vàng [4]

NGHIÊN CƯÚ CÔNG THỨC BÀO CHẾ KEM THUỐC

Nghiên cứu thăm dò

Thăm dò hệ tá dược

Khảo sát một vài hệ tá dược dựa trên sự đánh giá về thể chất mong muốn và độ bền để chọn ra hệ tá dược xây dựng công thức kem thuốc

- Qui ước thông số đánh giá về thể chất theo mức độ mong muốn

0: không như mong muốn 1: trung bình 2: như mong muốn

- Độ bền được tính theo thời gian tách lớp của kem (phút)

Bảng 3.2 Thành phần - tỉ lệ tá dược trong các hệ thăm dò

Tá dược Hệ A Nồng độ khảo sát (%) Hệ B Hệ C Hệ D

3.1.1.5 Khảo sát tác dụng kháng viêm của tinh dầu dương cam cúc và

chitosan

Sau khi đã lựa chọn hệ tá dược, điều chế một số công thức chứa tinh dầu dương cam cúc và chitosan để xác định có nên kết hợp chitosan vào công thức hay không, và sơ bộ đánh giá về tác dụng điều trị của sự phối hợp này

Bảng 3.3 Nồng độ tinh dầu dương cam cúc và chitosan khảo sát

Công thức tinh dầu dương cam cúc Nồng độ khảo sát (%) chitosan

Phương pháp điều chế kem

Kem thuốc được điều chế bằng cách tạo ra nhũ tương D/N theo phương pháp trộn đều nhũ hóa 2 pha dầu và nước sau khi đun nóng

Mỗi thí nghiệm điều chế khối lượng 250 g thành phẩm Đun chảy và phối hợp olivem

1000, oliwax LC, chất tạo đặc, đun đến nhiệt độ 65 0C Đun nóng nước đến 70 0C rồi cho tween 20, propylen glycol, chitosan, chất bảo quản vào và khuấy đều

Phối hợp tướng dầu vào tướng nước, khuấy với tốc độ 2500 vòng/phút trong khoảng thời gian qui định, để nhiệt độ hạ còn khoảng 50 0C, thêm tinh dầu dương cam cúc vào, tiếp tục khuấy cho tới nguội và chuyển vào máy đồng nhất hóa

Kiểm tra bán thành phẩm, đóng gói [1], [13]

Sơ đồ 3.1 Tóm tắt qui trình điều chế kem thuốc theo phương pháp trộn đều nhũ hóa

PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM

Phương pháp thử tác dụng kháng viêm bằng cách gây phù trên chân chuột nhắt trắng bằng formalin, được áp dụng để đánh giá các công thức trong quá trình nghiên cứu và chế phẩm cuối cùng [12]

- Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng, phái đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi,

trọng lượng trung bình 22 ± 2 gam) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột được để ổn định ít nhất 3 ngày trước khi thử nghiệm

- Tiến hành

Chuột được chia làm các lô (mỗi lô từ 5-20 con tùy thí nghiệm) như sau:

Lô chuột chứng có gây viêm nhưng không được điều trị

Các lô chuột thử có gây viêm và được điều trị bằng các mẫu kem thuốc cần kiểm tra

Hòa tan tướng nước (70-75 0 C)

Trộn đều nhũ hóa

Hòa tan tướng

dầu (65-70 0 C)

Các chất tan trong dầu

(oliwax LC, olivem1000,

chất tạo đặc)

Các chất tan trong nước (tween 20, propylen glycol, chitosan, chất bảo quản, nước cất)

Tinh dầu dương cam cúc (50 0C)

Xử lý tuýp

Đồng nhất hóa

Đóng tuýp

KN bán thành phẩm

Chuột được tiêm dưới da 0,02 ml formalin 2% vào gang bàn chân phải sau vào ngày 1,

3, 5 Chân trái không tiêm làm chứng

Các lô chuột được bôi mẫu thử vào gang bàn chân phải 30 phút sau khi tiêm formalin ở ngày 1, 3, 5 và lần thứ hai vào lúc 3 giờ chiều cùng ngày Vào các ngày khác chuột được bôi mẫu thử 2 lần/ngày lúc 9 giờ sáng và 3 giờ chiều Các lô thử nghiệm được bôi mẫu thử liên tục trong 6 ngày

Lô chứng cũng được tiêm formalin nhưng không được bôi gì

Đánh giá mức độ viêm bằng cách đo độ phù bàn chân chuột bằng thước kẹp Palmer (bề ngang và bề dày chân chuột) hoặc đo thể tích chân chuột bằng thiết bị

Plethysmometer vào sáng ngày thứ bảy Tiến hành đo 3 lần và lấy giá trị trung bình

- Tính toán kết quả

Mức độ tăng bề ngang, bề dày và thể tích chân chuột biểu thị mức độ viêm và được tính theo công thức:

X% = Số đo bề ngang chân phải – số đo bề ngang chân tráiSố đo bề ngang chân trái x100

Y% = Số đo bề dày chân phải – số đo bề dày chân trái x100

Số đo bề dày chân trái

Z% = Số đo thể tích chân phải – số đo thể tích chân tráiSố đo thể tích chân trái x100

X%: mức độ tăng bề ngang chân chuột

Y%: mức độ tăng bề dày chân chuột

Z%: mức độ tăng thể tích chân chuột

Tác dụng ức chế phù (hiệu lực kháng viêm) được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân của lô chuột thử thuốc so với mức độ tăng của lô chứng và được tính theo công thức

Y’ % = Z%chứngZ% – Z%thử x 100

chứng

Y’%: Hiệu lực kháng viêm (tỉ lệ giảm mức độ phù bàn chân chuột)

- Đánh giá kết quả

Kết quả được tính theo số trung bình ở mỗi lô chuột trong quá trình thăm dò xây dựng công thức

Dùng phép thống kê Mann-Whitney của phần mềm minitab 14.0 để so sánh hiệu lực kháng viêm giữa các lô với lô chứng và giữa các lô với nhau P < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê

* Thông số chính để đánh giá mức độ viêm của chân chuột là dựa vào thể tích chân chuột, đo bề dày và bề ngang là thông số hỗ trợ thêm.

BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ TỐI ƯU HÓA CÔNG THỨC

Việc bố trí thí nghiệm và tối ưu hóa công thức trong đề tài được thực hiện theo phương pháp bố trí thí nghiệm yếu tố đầy đủ với các bước như sau:

- Xác định thông số tối ưu

y: hiệu lực kháng viêm (%)

- Các yếu tố cố định

Phương pháp điều chế

Tỉ lệ và thành phần tá dược

Phương pháp gây viêm và phương pháp đánh giá mức độ phù chân chuột

- Các yếu tố biến thiên

X1: Nồng độ chitosan trong chế phẩm (1 - 3%)

X2: Nồng độ tinh dầu dương cam cúc trong chế phẩm (0,1 - 0,3%)

Mỗi yếu tố có 2 mức biến đổi Ximax và Ximin

Mức cơ bản: Xoi = (Ximax + Ximin) / 2

Khoảng biến đổi ∆Xi = (Ximax - Ximin) / 2

Mã hóa các yếu tố

Xi (biến thật) => xi (biến mã hóa)

Biến mã hóa có hai mức: ximax = +1 (hay +)

ximin = -1 (hay -)

Bảng 3.4 Các yếu tố khảo sát

Yếu tố biến thiên X i (%) X oi (%) X imin (%) X imax (%) ∆X i (%)

Nồng độ tinh dầu

- Ma trận bố trí thí nghiệm

Với k = 2 các biến x1, x2 Mỗi biến có 2 mức Số thí nghiệm bố trí là 22 = 4

Bảng 3.5 Mô hình bố trí thí nghiệm

N x 0 x 1 x 2

Đo các thông số y ở mỗi thí nghiệm

- Xác định phương trình hồi qui bậc nhất

y = b0 + 



k

i 1

bixi với hệ số hồi qui bi = N1 



N

n 1

xiu.yu

- Kiểm tra ý nghĩa của hệ số hồi qui

Hệ số bi chỉ có ý nghĩa khi có một độ lớn nhất định so với độ lệch chuẩn S Nếu không đạt thì coi như hệ số đó là không đáng kể (# 0)

Để kiểm tra dựa vào test T (test student )

Thực hiện 5 thí nghiệm ở điều kiện cơ bản với 5 lô chuột

Đo các thông số y ở mỗi thí nghiệm

Tính S2

y =

1 N

) y y (

0

u u





0 là số thí nghiệm lặp lại ở mức cơ bản)

S2

i

b =

N

S y2

=> Sb (N là số thí nghiệm ở quy hoạch)

Tính TTN theo công thức TTNbi = |bi|: Sb i

Tra bảng student: TLT = T(p, f) (Với p: xác xuất 0,95 hay 0,99; f = N0-1)

So sánh TTN và TLT

Nếu TTN > TLT thì hệ số bi là đáng kể và được giữ lại trong phương trình hồi quy

Nếu TTN < TLT thì hệ số bi là không đáng kể và loại bỏ đi

- Kết luận phương trình hồi qui

- Tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box-Willson (tiến theo gradient)

Công thức chung : S = Ci bi ∆Xi

Các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện đến khi y bắt đầu xấu đi thì dừng

Ximới = Xoi + Ci bi ∆Xi

- Nhận xét kết quả thực nghiệm thu được và xác định công thức tối ưu Điều kiện tối ưu của quá trình là điều kiện ở thí nghiệm nào cho thông số y tốt nhất