KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA PROBIOTIC LÊN HỆ VI SINH ĐƯỜNG RUỘT CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus Sauvage, 1878)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA PROBIOTIC LÊN HỆ VI SINH ĐƯỜNG RUỘT CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus Sauvage, 1878) Họ tên sinh viên: TRẦN ĐOÀN THẢO Ngành: NI TRỒNG THỦY SẢN Chun ngành: NGƯ Y Niên khóa: 2006 - 2010 Tháng 7/2010 KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA PROBIOTIC LÊN HỆ VI SINH ĐƯỜNG RUỘT CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus Sauvage, 1878) Tác giả TRẦN ĐOÀN THẢO Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Kỹ sư Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên ngành Ngư y Giáo viên hướng dẫn ThS VÕ VĂN TUẤN Tháng năm 2010 i CẢM TẠ Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm khoa Thủy sản Quý thầy cô trường, đặc biệt thầy cô khoa Thủy sản hết lòng dìu dắt, truyền đạt cho tơi kiến thức kinh nghiệm thật quý báu Đặc biệt thầy Võ Văn Tuấn giảng dạy, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức q báu để tơi hồn thành khóa luận Cơ Trương Phước Thiên Hồng, mơn Công nghệ Sinh học Môi trường, trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tận tình tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài Con xin cảm ơn cha mẹ người thân gia đình tạo điều kiện cho suốt q trình theo học trường Cuối tơi xin gửi lòng biết ơn đến bạn sinh viên ngồi lớp động viên, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài Do kiến thức chun mơn hạn chế, thời gian thực đề tài có hạn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót Vì vậy, tơi mong đóng góp ý kiến q thầy bạn để khóa luận hồn thiện Xin chân thành cảm ơn ii TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát đánh giá tác động probiotic lên hệ vi sinh đường ruột cá tra” tiến hành nhằm tìm hiểu tác động probiotic lên hệ vi sinh vật đường ruột cá tra khảo sát thành phần lồi vi sinh vật có ruột cá tra bố trí thí nghiệm Đề tài thực từ ngày 01/05/2010 đến 15/07/2010 Trại Thực Nghiệm Thủy Sản, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với yếu tố thức ăn điều kiện khác môi trường sống, cho ăn, quản lý chăm sóc Thí nghiệm cá tra có trọng lượng trung bình 20 g có chiều dài trung bình 12 cm Thí nghiệm gồm nghiệm thức (NT) lặp lại lần ( tương ứng lô) Liều lượng trộn probiotic tăng dần theo NT sau: ™ Nghiệm thức (NT0): không bổ sung probiotic ™ Nghiệm thức I (NTI): bổ sung ppt probiotic ™ Nghiệm thức II (NTII): bổ sung 10 ppt probiotic ™ Nghiệm thức III (NTIII): bổ sung 20 ppt probiotic Kết nghiên cứu cho thấy: ™ Mật độ vi khuẩn đường ruột cá tăng lên rõ rệt Cụ thể cá ăn thức ăn có trộn probiotic mật độ vi khuẩn đường ruột NT0 10 x 106 CFU/g ; NTI 31 x 106 CFU/g ; NTII 187 x 106 CFU/g ; NTIII 60 x 106 CFU/g ™ Thành phần loài vi sinh vật có đường ruột cá thay đổi qua lần kiểm tra Cụ thể là, lần kiểm tra thứ có lồi Klebsiella iii pneumoniae(1,65%); Klebsiella ozaenae(0,33%); Escherichia vulneris(8,25%); Shigella group (89,77%) Lần kiểm tra thứ hai có loài Klebsiella ozaenae (1,46%); Escherichia vulneris(18,16%); Pleisiomonas shigelloides (40,29%); Stenotrophomonas maltophilia (5,85%); Flavobacterium odoratum (28,18%); Burkholderia pseudomallei (4,18%); Sphingomonas paucimobilis (1,88%) Lần kiểm tra thứ ba có lồi Klebsiella pneumoniae (19,22%); Klebsiella ozaenae (0,08%); Flavobacterium odoratum (5,16%); Escherichia vulneris (4,16%); Sphingomonas paucimobilis(33,78%); Enterobacter agglomerans group (30,53%); Acinetobacter sp (7,07%) Tuy nhiên khơng nhận thấy có mặt vi sinh vật có probiotic trộn vào thức ăn ban đầu Do probiotic sử dụng thí nghiệm khơng cho hiệu việc cạnh tranh với hệ vi sinh vật đường ruột cá iv SUMMARY The topic of “ Surveying and evaluating the effects of probiotic supplements on intestinal microflora of tra fish ” was carried out in order to identify baterial microflora in the intestinal tract of tra fish and the effects of probiotic This study was conducted at the Experimental Farm, Nong Lam University from May 01, 2010 to July 15, 2010 The experiment was randomly arranged with treatments and replicates It was conducted on tra fish with average weight of 20g and an average body length was 12cm ™ Treatment : No Probiotic supplement ™ Treatment : ppt Probiotic supplement ™ Treatment : 10 ppt Probiotic supplement ™ Treatment : 20 ppt Probiotic supplement The results showed that the bacterial density in tra fish guts increased significantly In Treatment 0, the density of bacteria in the guts was 10 x 106 CFU/g In treatment 1, the density of bacteria in the guts was 31 x 106 CFU/g In treatment 2, the density of bacteria in the guts was 187 x 106 CFU/g In treatment 3, the density of bacteria in the guts was 60 x 106 CFU/g The bacterial microflora in the intestinal tract of tra fish included Klebsiella pneumoniae (1,65%), Klebsiella ozaenae (0,33%), Escherichia vulneris (8,25%); Shigella group (89,77%) (first test); Klebsiella ozaenae (1,46%), Escherichia vulneris(18,16%), Pleisiomonas shigelloides (40,29%), Stenotrophomonas maltophilia (5,85%), Flavobacterium odoratum (28,18%), Burkholderia pseudomallei (4,18%), Sphingomonas paucimobilis (1,88%) (second test); and Klebsiella (19,22%), Klebsiella ozaenae (0,08%), Flavobacterium v pneumoniae odoratum (5,16%), Escherichia vulneris (4,16%), Sphingomonas paucimobilis(33,78%), Enterobacter agglomerans group (30,53%), Acinetobacter sp (7,07%) (final test) However, there was no prove to support the presence of probiotic bacteria in the intestinal tract of tra fish So, we might conclude that this probiotic was ineffective in competitive inhibition of fish intestinal bacteria vi MỤC LỤC Trang Trang tựa CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii SUMMARY v MỤC LỤC vii Chương 1.1 Đặt Vấn Đề 1.2 Mục Tiêu Chương 2.1 Một số đặc điểm sinh học cá tra 2.1.1 Vị trí phân loại phân bố 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh thái 2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 2.1.6 Đặc điểm sinh sản 2.2 Sơ Lược Về Probiotic 2.2.1 Các khái niệm probiotic vii 2.2.2 Thành phần hình thức probiotic 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng hiệu probiotic 10 2.2.5 Phát triển probiotic ni trồng thủy sản 11 2.2.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic ngồi nước 11 2.3 Cấu Trúc Ruột Cá 12 2.4 Hệ Vi Khuẩn Đường Ruột 14 Chương 3.1 Đối Tượng Nghiên Cứu 16 3.1.1 Chế phẩm sinh học Probiotics 16 3.1.2 Cá tra 19 3.2 Thời Gian Và Địa Điểm Thực Hiện 19 3.3 Thiết Bị Hóa Chất 19 3.3.1 Dụng cụ trang thiết bị 19 3.3.2 Hóa chất 20 3.4 Môi Trường Nuôi Cấy 20 3.5 Phương Pháp Nghiên Cứu 21 3.5.1 Phương pháp thu mẫu 21 3.5.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc 21 3.5.3 Phân lập, làm vi khuẩn 22 viii 3.5.4 Phương pháp nhuộm Gram 23 3.5.5 Định danh phản ứng sinh hóa 24 Chương 4.1 Mật độ vi khuẩn 29 4.2 Định Danh Vi Khuẩn 30 Chương 5.1 Kết Luận 45 5.2 Đề Nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần số môi trường 51 Phụ lục 2: Thành phần thuốc thử dung dịch khác 60 Phụ lục 3: Các phương pháp thực đề tài 62 Phụ lục 4: Số liệu cá kiểm tra qua đợt 76 ix nồi cách thủy tan hết gelatin Rót hỗn hợp nhận vào ống nghiệm, ống – 10ml Khử trùng 0,5 atm 15 phút Cách cấy: cấy que cấy đầu nhọn theo lối cấy dâm sâu, ủ 300C/24 – 48 5.16.9 Đọc kết Nếu vi khuẩn ủ nhiệt độ 300C, để quan sát tượng hóa lỏng gelatin, phải đưa ống nghiệm nuôi cấy VK vào ủ lạnh vòng 10 phút, sau lấy quan sát: _ Phản ứng dương tính: mơi trường gelatin trạng thái lỏng _ Phản ứng âm tính: mơi trường gelatin trạng thái đông đặc 3.4 Thử nghiệm khả sinh indol 5.16.10 Nguyên tắc Tryptophan acid amin bị oxi hóa số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Sản phẩm trung gian phản ứng oxi hóa tryptophan indolpyruvic acid IPA Phân tử sau bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin (deamination) thành indol hay theo hướng loại nhóm carboxyl (decarboxylation) thành skatol Tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin để tạo thành indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) Nhân pyrrol indol chứa nhóm CH2 kết hợp với nhân benzene p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Thử nghiệm dùng để phân biệt E Coli (+) với Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-) với loài Proteus khác (+), Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (thường -) Haemophilus haemoglobinophilus (+) H influenzae (-) với loài 66 Haemophilus khác (thường -), Pasteurella multocida (+) P pneumotropica (+) với P haemolytica (-) P urea (-) Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm Proteus rettgeri, (-) Serratia marcescens 5.16.11 Phương pháp tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm nước tryptone, môi trường kết hợp MIU (Motility Indol Urea), SIM (Sulfide Indol Motility)… cần kiểm tra lúc nhiều đặc tính sinh hóa cần thiết Hai loại thuốc thử sử dụng cho thử nghiệm thuốc thử Erlich thuốc thử Kovacs Sinh khối chủng cấy vào ống môi trường lỏng thuộc loại nêu trên, ủ nhiệt độ 370C 24 – 48 Trước bổ sung thuốc thử bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu Nhỏ giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ lớp dung môi hữu 5.16.12 Đọc kết Thử nghiệm (+) có xuất lớp màu đỏ bề mặt mơi trường; (-) có lớp màu vàng thuốc thử bề mặt môi trường Đôi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol, tạo 3.5 Thử nghiệm KIA, TSI 5.16.13 Nguyên tắc Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) môi trường TSI (Triple Sugar Agar) sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S chủng vi sinh vật Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa hai loại đường 1% lactose 0,1% glucose Tương tự, môi trường TSI có thành phần mơi trường KIA có thêm 1% sucrose (saccharose) Khả sử dụng hai nguồn đường glucose lactose 67 hay sử dụng glucose để thu lấy lượng cần cho tăng trưởng tùy thuộc vào di truyền chủng vi sinh vật theo dõi ống thạch chứa môi trường KIA Khi cấy chủng lên mơi trường này, có ba trường hợp xảy tăng trưởng chủng vi sinh vật thử nghiệm: sử dụng glucose, sử dụng glucose lactose, không sử dụng hai loại đường Khả vi sinh vật xác định thông qua đổi màu thị pH môi trường bề mặt bên môi trường ống thạch nghiêng _ Nếu vi sinh vật lên men glucose, sau 18 – 24 nuôi cấy phần môi trường bề mặt ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm phần sâu ống có pH acid Điều giải thích lượng glucose phần bề mặt mơi trường vi sinh vật oxy hóa hồn toàn thành H2O CO2 để thu lượng Để đáp ứng nhu cầu lượng cho tăng trưởng, vi sinh vật tiến hành dị hóa pepton mơi trường qua giải phóng NH3 làm phần bề mặt mơi trường có pH kiềm Ngược lại, phần sâu mơi trường có điều kiện oxy khơng đầy đủ, glucose lên men kỵ khí sinh acid hữu làm giảm pH môi trường Nếu mơi trường có chất thị đỏ phenol mặt thạch nghiêng có màu đỏ phần sâu có màu vàng _ Nếu vi sinh vật sử dụng glucose lactose, sau 18 – 24 ni tồn mơi trường trở nên có pH acid biến dưỡng đồng thời glucose lactose bề mặt môi trường giúp vi sinh vật đủ lượng để tăng trưởng mà không cần phải sử dụng đến pepton Tuy nhiên, kéo dài thời gian nuôi cấy 24 giờ, bề mặt mơi trường trở thành màu đỏ hết nguồn carbon vi sinh vật phải sử dụng đến pepton _ Nếu vi sinh vật không sử dụng hai nguồn carbon này, pepton sử dụng để biến dưỡng thu lượng vật chất cần cho tăng trưởng vi sinh vật Tuy nhiên, pepton biến dưỡng điều kiện hiếu khí nên tượng kiềm hóa mơi trường diễn phần bề mặt môi trường phần trở nên có màu đỏ Trong đó, phần mơi trường sâu ống nghiệm khơng có tượng đổi màu 68 Trong trường hợp nêu trên, lên men đường tạo sản phẩm khí khí tích tụ bên thành bọt khí hay làm vỡ thạch Trường hợp sử dụng môi trường TSI, tượng liên quan đến sử dụng nguồn carbon xảy tương tự Thử nghiệm khả sinh H2S thực đồng thời hai môi trường thành phần mơi trường có chứa sodium thiosulphate Vi sinh vật khử sulfate khử hợp chất để giải phóng H2S Khí H2S tạo phát dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS H2S ion Fe2+ thị ferric ammonium citrate diện môi trường 5.16.14 Phương pháp tiến hành Môi trường KIA hay TSI pha chế, hấp khử trùng chuyển vào ống nghiệm vô trùng để tạo ống thạch nghiêng cho đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm phần sâu có chiều cao khoảng 2,5cm Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng vào sâu vào phần sâu ống thạch nghiêng tránh chạm đáy ống, sau ria bề mặt thạch nghiêng Sau cấy giống, ống thạch nghiêng ủ 370C từ 18 – 24 Ghi nhận màu, sinh khí phần sâu, màu mặt thạch nghiêng, tạo thành màu nâu FeS 5.16.15 Đọc kết _ Thử nghiệm khả sử dụng đường: xem mục nguyên tắc _ Thử nghiệm sinh H2S: thử nghiệm (+) xuất tủa màu nâu đen bên môi trường, (-) không xuất tủa nâu đen 3.6 Thử nghiệm Nitratase (khử nitrate) 5.16.16 Nguyên tắc Các vi sinh vật có khả khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác khử nitrate thành nitrite nitơ phân tử Sự khử nitrate gọi phản nitrate 69 hóa, diễn điều kiện khơng có oxy phân tử Đây cách biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp kỵ khí Hầu hết vi sinh vật khử nitrate vi sinh vật hiếu khí tùy ý, thực q trình khử nitrate mơi trường khơng có diện oxy phân tử Sản phẩm cuối khử nitrite (NO2-); ammonia (NH3), nitơ phân tử (N2), hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO) tùy thuộc vào loài vi sinh vật điều kiện mơi trường Hoạt tính nitratase định tính dựa tạo thành nitrite cạn kiệt nitrate Nitrite tạo từ nitrate phản ứng với sulphanilamide N-napthylethylenediamine hydrochloride pH acid cho hợp chất có màu hồng Tuy nhiên nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa nitrite thành hợp chất khác nên có diện nitratase môi trường không xuất màu hồng Trường hợp này, tiến hành kiểm chứng cạn kiệt nitrate bụi kẽm kim loại: nitrate phản ứng với bụi kẽm tạo màu hồng Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm Serratia marcescens, (-) Acinetobacter lwoffi 5.16.17 Phương pháp tiến hành Có thể thực thử nghiệm số cách sau: _ Cách 1: môi trường sử dụng ống môi trường lỏng Nitrate Broth Cấy sinh khối chủng ủ 370C qua đêm _ Cách 2: dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần, khuếch tán dày đặc chủng vật thử nghiệm vào ống nghiệm chứa dung dịch sodium nitrate 0,01M đệm phosphate 20mM pH 7,0 vô trùng Ủ ống 370C 24 _ Cách 3: nhỏ vài giọt dung dịch sodium nitrat 1% vào dịch nuôi cấy nuôi cấy vào cuối log pha Ủ nhiệt độ 370C Sau thời gian ủ, acid hóa mơi trường cách bổ sung vài giọt HCl 1N, sau bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide 0,2% 0,5ml N- napthylethylenediamine hydrochloride bảo quản tủ lạnh để định tính nitrite Khi phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng nhỏ bụi kẽm để định tính nitrate 70 5.16.18 Đọc kết Thử nghiệm nitratase (+) có xuất màu hồng định tính nitrite sulphanilamide N-napthylethylenediamine hydrochloride Trường hợp khơng có màu hồng xuất hiện, tiếp tục định tính nitrate bụi kẽm Nếu phản ứng định tính nitrate cho màu hồng (do diện nitrate) thử nghiệm nitrate (-); ngược lại, khơng chuyển màu thử nghiệm nitratase (+) 3.7 Thử nghiệm Oxidase 5.16.19 Nguyên tắc Thử nghiệm xác định diện hệ enzyme oxidase vi sinh vật Thành viên quan trọng hệ thống cytochrome oxidase chuỗi truyền điện tử hơ hấp hiếu khí với O2 chất nhận điện tử sau nên diện lồi vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy ý Số chủng loại cytochrome tế bào thay đổi tùy thuộc vào loài vi sinh vật Hoạt tính cytochrome oxidase phát nhờ thuốc thử p-phenylenediamine Trong điều kiện có diện cytochrome c khử tế bào, thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương Chủng dùng làm đối chứng (+) Pseudomonas aeruginosa, (-) Acinetobacter lwoffi 5.16.20 Phương pháp tiến hành Thử nghiệm thực phương pháp sau: _ Cấy sinh khối chủng lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ nhiệt độ thích hợp 24 – 48 Nhúng mảnh giấy lọc vào dung dịch 1% tetramethylp-phenylenediamine dihydrochloride oxalate Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối, dàng lên vị trí có thuốc thử giấy lọc Quan sát ghi nhận xuất màu xanh dương vài phút 71 _ Cấy sinh khối chủng lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ nhiệt độ thích hợp 24 – 48 Nhỏ lên sinh khối vài giọt loại thuốc thử pha 1% p-aminodimethylaniline oxalate 1% α-napthol ethanol Quan sát ghi nhận xuất màu xanh dương vài phút 5.16.21 Đọc kết Ở hai trường hợp nên trên, thử nghiệm oxidase (+) xuất màu xanh dương đậm, khơng có xuất màu xanh phản ứng âm tính () Một số điểm cần lưu ý thử nghiệm sử dụng dịch nuôi cấy lâu cho kết khơng xác Ngồi hoạt tính oxidase bị kìm hãm đường Do vậy, chủng có khả lên men đường sinh acid cần cấy vào mơi trường khơng đường trước dùng sinh khối cho thử nghiệm oxidase 3.8 Thử nghiệm MR (Methyl Red) 5.16.22 Nguyên tắc Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa khác biệt khả tạo trì sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền mơi trường trình lên men glucose Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ diện môi trường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị có màu thay đổi khác tùy dãy pH hay nồng độ ion H+: đỏ pH thấp 4,4, màu cam vùng pH 5,0 – 5,8, màu vàng pH 6,0 Hàm lượng ion H+ phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 H2 đường chuyển hóa đường loài vi sinh vật Đối với vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường xác định khoảng 18 – 24 Tuy nhiên vi sinh vật tạo acid môi trường từ chúng bắt đầu tăng trưởng Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính tích lũy acid mơi trường ngày nhiều độ pH môi trường ngày giảm; ngược lại, trường hợp vi sinh vật cho phản ứng MR (-) tiếp tục chuyển hóa sản 72 phẩm có tính acid tạo thành sản phẩm trung tính làm cho pH mơi trường chuyển dần phía trung tính Thử nghiệm MR phụ thuộc lớn vào thời gian nuôi cấy thường tiến hành thời gian khoảng – ngày 370C Thử nghiệm giúp phân biệt E Coli (+) với Klebsiella (-); Enterobacter aerogenes (-) với Enterobacter cloacea (-); Yersinia spp (+) với lồi Bacillus Gram âm khác khơng thuộc đường ruột (-); xác định Listeria monocytogenes (+) Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm Proteus rettgeri, (-) Serratia marcescens 5.16.23 Phương pháp tiến hành Thử nghiệm thực ống môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que cấy vòng cấy lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc chủng môi trường KIA, ủ 370C khoảng – ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0,02% hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản 40C) vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết 5.16.24 Đọc kết Thử nghiệm MR (+) mơi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử; () có màu vàng Trường hợp màu da cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống ngày thực lại thử nghiệm 3.9 Thử nghiệm VP (Voges-Proskaue) 5.16.25 Nguyên tắc Ở vi sinh vật, biến dưỡng lượng phương thức lên men từ glucose qua đường phân tạo chất trung gian chủ yếu pyruvic acid Để khôi phục dự trữ NAD+ tế bào phục vụ cho đường đường phân, lồi vi sinh vật, sau pyruvic acid tiếp tục chuyển hóa theo đường sinh hóa khác tạo sản phẩm lên men cuối khác Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung lên men sinh hỗn hợp acid acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 73 CO2 Họ chia thành hai nhóm nhóm khơng sinh 2,3-butanediol (ví dụ E Coli) nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ Klebsiella, Enterobacter) Phân tử 2,3-butanediol chuyển hóa qua lại thành acetoin: điều kiện có oxy mơi trường có tính kiềm, 2,3-butanediol bị oxy hóa thành acetoin nhờ xúc tác enzyme 2,3- butanediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin bị khử thành 2,3butanediol hoạt tính enzyme diacetyl reductase Ngồi ra, acetoin bị oxy hóa thành diacetyl Như vậy, có oxy pH kiềm, 2,3- butanediol bị chuyển hóa thành acetoin, đến lượt acetoin bị oxy hóa thành diacetyl, chất tham gia vào phản ứng tạo màu thử nghiệm VP Như vậy, thử nghiệm VP giúp phân biệt loài Enterobacteriaceae dựa oxy hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl Sự oxy hóa acetoin thành diacetyl tăng cường nhờ xúc tác α- naphthol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ Trong thuốc thử Koblentz O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine Thử nghiệm VP dùng để phân biệt Klebsiella pneumonia (+) Enterobacter (+) với E Coli (-), phân biệt số loài Klebsiella, để xác định Listeria monocytogenes (+) Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm Serratia marcescens (-) Proteus rettgeri 5.16.26 Phương pháp tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm VP mơi trường lỏng Clark-Lubs (mơi trường MR-VP), có pH 6,9 Dùng que cấy vòng cấy vào ống mơi trường MRVP sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz cấy nhiều sinh khối) từ khuẩn lạc chủng ủ 18 – 24 môi trường KIA TSI Ủ yên ống môi trường 370C 24 – 48 đến 10 ngày cần thiết Một số lồi Enterobacter hafniae có kết thử nghiệm VP không ổn định 370C cho (+) 25 – 300C Do vậy, trường hợp nghi ngờ nên tiến hành ủ 74 ống môi trường song song hai điều kiện nhiệt độ Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Có loại thuốc thử VP là: _ Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A 5% α-naphthol cồn tuyệt đối, dung dịch B 40% KOH NaOH _ Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A 5% α-naphthol cồn 95%, dung dịch B 0,3% creatine 40% KOH NaOH _ Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3% creatine 40% KOH NaOH Khi sử dụng loại thuốc thử có thành phần, trước tiên nhỏ giọt dung dịch A, sau nhỏ giọt dung dịch B Đối với thuốc thử thành phần, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường Lắc nhẹ ống phút để oxy hóa acetoin Đọc kết sau 20 phút chậm Trước sử dụng nên kiểm tra thuốc thử chủng đối chứng E Coli (VP -) Enterobacter cloacea (VP +) 5.16.27 Đọc kết Thử nghiệm VP (+) có màu đỏ bề mặt môi trường, (-) bề mặt môi trường không đổi màu 3.10 Thử nghiệm tính di động 5.16.28 Nguyên tắc Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi tiên mao (flagella) có nhiều vi khuẩn hình que, số vi khuẩn hình cầu Khả di động dùng để phân biệt vi sinh vật Khả quan sát dựa vào tăng trưởng di động vi sinh vật vào bên mơi trường thạch mềm Ngồi triphenyltetrazolium chloride (TTC) bổ sung vào môi trường để giúp phát dễ dàng vị trí diện tế bào vi sinh vật môi trường hợp chất vào bên tế bào bị khử thành formazan có màu đỏ 75 Thử nghiệm dùng để phân biệt Salmonella spp (+) với S pullorum (-), S gallinarium (-) số trực khuẩn Gram (-) khác; Vibrio (+) với Actinobacillus (-); E Coli sinh (+) với E Coli (-); Enterobacter (thường +) với Klebsiella (-); Bacillus anthracis (-) với Bacillus spp Khác (thường +) Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm Serratia marcescens, (-) Acinetobacter lwoffi 5.16.29 Phương pháp tiến hành Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar Môi trường đun tan, phân phối thành dung tích 5ml vào ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng 1200C 15 phút Các ống môi trường làm nguội trạng thái đứng bảo quản – 100C Trường hợp sử dụng TTC môi trường để phát vị trí tế bào, dung dịch 1% TTC nước lọc vơ trùng qua màng lọc 0,45μm, sau bổ sung vào môi trường thạch mềm hấp khử trùng thành nồng độ 0,05g/l trước làm đông môi trường Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng sau ủ nhiệt độ thích hợp 18 – 24 mơi trường KIA hay mơi trường thích hợp khác Chủng cấy cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào môi trường ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm Các ống môi trường ủ 370C 24 – 48 giờ, (-) ủ tiếp 21 – 250C đến ngày Thực song song việc ủ điều kiện tương tự ống môi trường không cấy vi sinh vật dùng làm ống đối chứng Do nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến khả di động vi khuẩn nên cần thiết nên thực đồng thời việc ủ ống môi trường cấy chủng hai điều kiện nhiệt độ khác 5.16.30 Đọc kết _ Trường hợp môi trường thạch mềm: thử nghiệm (+) vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm đục môi trường xung quanh; (-) vi sinh vật mọc dọc theo đường cấy môi trường xung quanh Ở ống đối chứng khơng có vi sinh vật tăng trưởng, mơi trường 76 _ Trường hợp môi trường thạch mềm có TTC: thử nghiệm (+) vi sinh vật tạo vùng đục màu đỏ lan tỏa vào môi trường hai bên đường cấy; (-) vi sinh vật tạo thành vùng màu đỏ dọc theo đường cấy Ở ống đối chứng khơng có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường 77 PHỤ LỤC Số liệu cá kiểm tra qua đợt Bảng 4.2: Số liệu cá kiểm tra đợt Ký hiệu Chiều dài Trọng lượng Trọng lượng STT mẫu thân (cm) thân (g) ruột (g) 01 DC1 15 39,18 2,85 02 DC2 15 37,20 2,40 03 DC3 14 34,28 2,18 04 NT I.1 12 29,68 2,38 05 NT I.2 12 29,63 1,52 06 NT I.3 13 38,49 2,11 07 NT II.1 15 37,34 2,42 08 NT II.2 14 38,12 3,09 09 NT II.3 13 28,27 2,12 10 NT III.1 13 29,45 3,47 11 NT III.2 14 34,87 2,86 12 NT III.3 13 36,80 2,97 78 Bảng 4.3: Số liệu cá kiểm tra đợt Ký hiệu `Chiều dài Trọng lượng Trọng lượng STT mẫu thân (cm) thân (g) ruột (g) 01 DC1 18 71,00 2,90 02 DC2 20 71,30 3,00 03 DC3 20 87,00 3,51 04 I.1 17 78,00 3,36 05 I.2 18 77,00 3,40 06 I.3 17 73,00 3,15 07 II.1 18 74,00 2,67 08 II.2 20 77,26 3,98 09 II.3 18 69,00 3,35 10 III.1 18 71,00 3,18 11 III.2 17 66,00 4,35 12 III.3 18 67,00 3,30 79 Bảng 4.4: Số liệu cá kiểm tra đợt Ký hiệu Chiều dài Trọng lượng Trọng lượng STT mẫu thân (cm) thân (g) ruột (g) 01 DC1 21 106,69 5,51 02 DC2 20 97,00 3,94 03 DC3 21 100,00 5,44 04 I.1 19 79,00 3,90 05 I.2 20 87,00 4,38 06 I.3 23 152,00 4,40 07 II.1 19 112,00 5,00 08 II.2 20 103,00 5,66 09 II.3 21 117,60 6,91 10 III.1 19 91,00 4,46 11 III.2 20 113,20 5,93 12 III.3 17 66,00 2,40 80 ... Đề tài Khảo sát đánh giá tác động probiotic lên hệ vi sinh đường ruột cá tra tiến hành nhằm tìm hiểu tác động probiotic lên hệ vi sinh vật đường ruột cá tra khảo sát thành phần loài vi sinh vật... tài Khảo sát đánh giá tác động probiotic lên hệ vi sinh đường ruột cá tra 1.2 Mục Tiêu Khóa luận thực nhằm mục tiêu: - Đánh giá ảnh hưởng vi c bổ sung chế phẩm sinh học ( probiotic) lên hệ vi. ..KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA PROBIOTIC LÊN HỆ VI SINH ĐƯỜNG RUỘT CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus Sauvage, 1878) Tác giả TRẦN ĐỒN THẢO Khóa luận đệ trình