XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%) CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

Thí nghiệm được tiến hành để xác định liều gây chết 50% số cá tra thí nghiệm LD50 của vi khuẩn E.ictaluri bằng phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa... Từ những lý do trên, lại được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%)

CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG

PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

Ngành: Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên ngành: Ngư Y

Niên khóa: 2006-2010 Sinh viên thực hiện: LÝ ĐỨC TRỌNG

Tháng 07/2010

XÁC ĐỊNH LD 50 (LETHAL DOSE 50%)

CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY

NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

Tác giả

LÝ ĐỨC TRỌNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Nuôi Trồng Thuỷ Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 7 năm 2010

CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:

Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ cả về tinh thần lẫn vật chất cho con trong suốt quá trình học tập

Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt những kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập

Chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh và anh Đỗ Viết Phương đã hướng dẫn chúng tôi hoàn thành tốt Luận văn này với tất cả trách nhiệm và lòng nhiệt thành

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 32 đã luôn ở bên chúng tôi, chia sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua

Chúng tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn

TÓM TẮT

Đề tài ” Xác định LD 50 của Edwardsiella ictaluri trên cá tra bằng

phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa” được thực hiện bắt đầu từ

25/02/2010 đến 30/05/2010 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Thí nghiệm được tiến hành để xác định liều gây chết 50% số cá tra thí nghiệm (LD50) của vi khuẩn E.ictaluri bằng phương

pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa

Thí nghiệm 1:

+ Tỉ lệ cá chết tích lũy ứng với các mật độ vi khuẩn gây nhiễm 0 CFU/10 g cá, 1,1

x 108 CFU/10 g cá, 1,1 x 107 CFU/10 g cá, 1,1 x 106 CFU/10 g cá, 1,1 x 105CFU/10 g cá, 1,1 x 104 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 85%, 45%, 22,5%, 2,5%, 2,5%

+ Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 1,04 x 107 CFU/10 g cá (theo Reed – Muench), 1,00 x 107 CFU/10 g cá (theo phân tích propit) và 0,8 x 107 CFU/10 g cá (theo phương trình hồi quy tuyến tính - R2 là 0,928)

Thí nghiệm 2:

+ Tỉ lệ cá chết ứng với các mật độ vi khuẩn 0 CFU/10 g cá, LD50 CFU/10 g cá, 5 x

LD50 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 60%, 82%

2.1.4 Điều kiện môi trường sống 4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 4

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản 4

2.3.4 Triệu chứng và bệnh tích 8 2.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh 9 2.3.6 Phương pháp phòng và trị bệnh 9 2.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá Tra 9 2.4.1 Phương pháp tiêm 9 2.4.2 Phương pháp ngâm 10 2.4.3 Phương pháp nuôi chung 10 2.4.4 Phương pháp đường tiêu hóa 10 2.5 Sơ Lược Về LD50 11

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến LD50 11 2.5.3 Phương pháp xác định LD50 theo Reed và Muench (1938) 11 2.5.4 Một số nghiên cứu về LD50 của E ictaluri 12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm 14 3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu 14

3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm 19 3.3.6 Phương pháp cấy phân lập 20 3.3.7 Phương pháp cấy thuần 20 3.3.8 Phương pháp định danh sơ bộ 20 3.3.8.1 Phương pháp nhuộm gram 20 3.3.8.2 Thử nghiệm khả năng di động 21 3.3.8.3 Thử nghiệm Catalase 21 3.3.8.4 Thử nghiệm Oxidase 21 3.3.9 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR) 22 3.3.9.1 Thử nghiệm LDC bằng kit định danh IDS 14 GNR 23 3.3.9.2 Thử nghiệm di động bằng kit định danh IDS 14 GNR 23 3.3.10 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá 23 3.3.11 Phương pháp tính LD50 24 3.3.12 Phương pháp xử lí số liệu 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 26

4.1 Các chỉ tiêu môi trường 26 4.2 Kết Quả Thí Nghiệm 1 27 4.2.1 Trọng lượng cá thí nghiệm 27 4.2.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng 27 4.2.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá 28 4.2.4 Kết quả định danh vi khuẩn 28 4.2.5 Triệu chứng và bệnh tích 31

4.2.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm 36

4.3 Kết quả thí nghiệm 2 40 4.3.1 Trọng lượng cá thí nghiệm 2 40 4.3.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng 40 4.3.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá 40 4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn 41 4.3.5 Triệu chứng và bệnh tích 41

4.3.6 Tỷ lệ cá chết 42 4.3.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm ở thí nghiệm 2 45

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LD50 Lethal Dose 50%

BNP Bacillacy Necrosis of Pangasius

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

VP Voges-poskauer

ONPG O-Nitrophenyl β – D Galactopyrannoside

PAD Phenyl Alanin Deaminnase

LDC Lysin decarboxylase

DO Dissolve Oxygen

TSA Tryptic Soy Agar

PCR Polymerase Chain Reaction CFU Colony Forming Unit

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn

gây nhiễm thí nghiệm 1 15 Bảng 3.2: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn

gây nhiễm thí nghiệm 2 16 Bảng 3.3: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng 22 Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường của quá trình thí nghiệm 26 Bảng 4.2: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thức

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá của các

nghiệm thức thí nghiệm 1 28

Bảng 4.4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E ictaluri

bằng test định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa 29 Bảng 4.5: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong thí nghiệm 1 34

Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm E ictaluri (%) trong cơ thể cá còn sống

Bảng 4.10: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá

theo lý thuyết và theo thực tế 41 Bảng 4.11: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong

Bảng 4.12: Tỷ lệ chết theo tính toán và theo thực tế 43

Bảng 4.13: Tỷ lệ nhiễm E ictaluri trong cơ thể cá còn sống thí nghiệm 2 46

Hình 4.2: Hình dạng của vi khuẩn E ictaluri

Hình 4.3: Kết quả định danh E ictaluri bằng

test định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa 31 Hình 4.4: Cá thí nghiệm 1 bị xuất huyết các gốc vây và mang

sau 9 ngày gây nhiễm E ictaluri 32 Hình 4.5: Cá thí nghiệm xuất hiện các đốm mủ trắng

trên gan thận lách ở ngày thứ 9 33

Hình 4.6: Cá thí nghiệm 2 xuất hiện các đốm mủ trắng

trên gan thận lách ở ngày thứ 5 42

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các

nghiệm thức thí nghiệm 1 trong 14 ngày gây bệnh 35 Biểu đồ 4.2: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ chết

và nồng độ gây nhiễm 38 Biểu đồ 4.3: Đồ thị tương quan giữa độ pha loãng và tỷ lệ chết 39 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các

nghiệm thức thí nghiệm 2 trong 14 ngày gây bệnh 44

Sản phẩm chế biến từ đối tượng cá tra nuôi đã cho thấy vai trò chiến lược quan trọng của mình trong cơ cấu ngành thủy sản Việt Nam Theo Hiệp Hội Chế Biến Và Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (VASEP), trong 5 tháng đầu năm 2009 kim ngạch xuất khẩu cá tra lên đến 477 triệu đô la Mỹ, trong khi đó kim ngạch xuất khẩu tôm chỉ đạt

441 triệu đô la Mỹ Dự kiến trong toàn năm 2010, kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ vượt ngưỡng 1,5 tỉ đô la Mỹ

Tuy nhiên, bên cạnh những kết quả ấn tượng về sản lượng, kim ngạch xuất khẩu

và thị phần trên thị trường thế giới, nghề nuôi cá tra Việt Nam vẫn còn đó rất nhiều bất cập tồn đọng, như vấn đề quản lý nghề nuôi còn chưa tốt, thiếu đồng bộ, giá cả sản phẩm thất thường, người nuôi vẫn còn thiếu những hỗ trợ kĩ thuật cần thiết nhưng đáng quan ngại nhất trong số đó chính là vấn đề dịch bệnh, đặc biệt là dịch bệnh gan thận mủ

do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra

Hàng năm, dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra do Edwardsiella ictaluri vẫn gây ra

những thiệt hại rất to lớn cho nghề nuôi cá tra đồng bằng sông Cửu Long Bệnh này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1992 (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007), nguyên nhân bùng phát dịch bệnh chủ yếu là do vùng nuôi phát triển tự phát không theo quy hoạch, mật độ nuôi ngày càng cao nhưng thiếu các biện pháp quản lý phòng ngừa dịch bệnh Trước đây, bệnh thường xảy ra chỉ khoảng 1 – 2 lần/ năm, nhưng hiện nay bệnh có thể xảy ra gần như quanh năm

Về tác nhân gây bệnh, vi khuẩn E ictaluri có độc lực rất mạnh và có thể lây

truyền qua nhiều đường Trong đó, con đường truyền lây qua đường tiêu hóa rất quan trọng và nguy hiểm cho cá tra nhưng hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này Do đó, việc xác định được liều vi khuẩn cần thiết có thể dẫn đến biểu hiện bệnh gan thận mủ ở cá tra thông qua con đường tiêu hóa là rất cần thiết Từ những lý do trên, lại được sự phân công và hỗ trợ của Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định LD50 của Edwardsiella

ictaluri trên cá tra bằng phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa”

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn thức ăn có chứa vi khuẩn, từ đó xác định LD50 của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.3 Nội Dung Đề Tài

- Tiến hành gây cảm nhiễm cá tra với vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp gây

nhiễm qua đường tiêu hóa

- Quan sát triệu chứng bệnh tích và ghi nhận tỷ lệ cá chết

- Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn

- Khảo sát tỷ lệ cá chết, tính LD50 và đưa ra kết luận

 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá tra có đầu rộng, dẹp bằng, mõm ngắn Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia làm bốn đám nhỏ mỏng chia làm đường vòng cung Có hai đôi râu, râu mép ngắn kéo dài chưa đến gốc vây ngực

Thân thon dài, không vảy, màu sắc đen xám trên mặt lưng của đầu và thân, bụng màu trắng bạc, phần chót đuôi hơi đỏ, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng của đầu cá tra lớn hơn cá basa

Đường bên kéo dài hoàn toàn theo chiều dọc của thân và phân nhánh bắt đầu từ mép trên của lỗ mang đến gốc vây đuôi, mặt sau của gai vi lưng và vi ngực có răng cưa

Cá khi còn nhỏ thì phần lưng của đầu và thân có màu xanh lục Ngoài ra, cá còn

có hai sọc màu xanh lục chạy dài theo chiều dọc của thân, sọc này lợt dần và mất đi khi

cá lớn

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

Cá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh Cá sống chủ yếu ở thủy vực nước ngọt, cũng có thể sống ở nước lợ với nồng độ muối thấp

Oxy hòa tan: Số lượng hồng cầu trong máu cá tra nhiều hơn trong máu các loài

cá khác Chúng có cơ quan hô hấp phụ, có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường thiếu oxy hòa tan Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho cá là 3 – 6mg/L Nhiệt độ: 26 – 30oC (ở 15oC cường độ bắt mồi giảm nhưng cá vẫn sống Ở 39oC

cá bơi lội không bình thường)

pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo hoạt động chậm chạp, khi pH =

11 cá lờ đờ và có biểu hiện mất nhớt)

Độ mặn: Cá có thể chịu đựng được độ mặn từ 8 – 10o/oo, tuy nhiên cá chủ yếu sống ở nước ngọt

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá sau khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống Vì vậy, chúng có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và trong quá trình ương nuôi nếu không được cho ăn đầy

đủ Trong quá trình ương giống, chúng ăn động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệng

và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong điều kiện thiếu thức

ăn, chúng có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như: Mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật Trong ao nuôi, cá tra có thể thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vật đáy, …

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản

Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá càng tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm

2.1.6.2 Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (sinh dục thứ cấp), nên nếu chỉ nhìn hình dạng bên ngoài thì khó có thể phân biệt được cá đực hay cá cái Ở thời

kỳ thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá cái gọi là buồng trứng hay noãn sào Tuyến sinh dục đực, cái của cá tra có thể được phân biệt từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều Các giai đoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có màu hồng chuyển dần sang trắng sữa Hệ số thành thục của cá tra trong tự nhiên (P = 8 – 11 kg) được khảo sát vào khoảng 1,76 đến 12,74 (cá cái) và từ 0,73 đến 2,1 (cá đực) (Nguyễn Văn Trọng, 1994) Trong bể nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5%

Trong tự nhiên cá tra không sinh sản ở Việt Nam Đến mùa sinh sản, chúng di

cư ngược dòng sông Mêkông đến bãi đẻ nằm trên sông Mêkông từ Sanbo đến Campuchia

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch Cá

có tập tính di cư, đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở vùng sông của Việt Nam

Cá đẻ trứng dính vào các giá thể, thường là rễ của loài cây ven sông Gimenila aiatica, sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn

Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu trứng (sức sinh sản tuyệt đối) Sức sinh sản tương đối của cá tra có trọng lượng 3,2 kg là 139.000 trứng/ kg thể trọng Cá đẻ trứng dính, trứng sắp đẻ có đường kính 1mm, sau khi trương nước có thể đạt 1,5 – 1,6 mm

sống là một thể thống nhất Cá tôm mắc bệnh là kết quả tác dụng lẫn nhau giữa cơ thể và môi trường sống (Bùi Quang Tề, 2006)

Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc bệnh

và chết Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc một bộ phận, cơ quan nào làm ảnh hưởng đến chức năng sinh lý bình thường của cơ thể sinh vật được gọi là bệnh

Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia làm 2 loại bệnh: Bệnh truyền nhiễm

và bệnh không truyền nhiễm

Bệnh truyền nhiễm do: Vi khuẩn, nấm, virus Tính chất lây truyền mạnh và có thể tạo thành những ổ dịch lớn, gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm độc hóa học

Bệnh không truyền nhiễm do: Môi trường, dinh dưỡng, độc tố (Dung, 2005)

2.3 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra

2.3.1 Sơ lược về bệnh

Bệnh mủ gan được ghi nhận đầu tiên xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacillacy Necrosis of Pangasius) (Dung và ctv, 2005) Bệnh này gây hại nghiêm trọng về kinh tế trên cá tra nuôi thâm canh

Bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ, chất lượng nước biến động, nước chảy mạnh

cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm Khả năng đề kháng đối với mầm bệnh giảm vì thế bệnh dễ dàng bộc phát, trong một vụ nuôi bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 - 4 lần Tỷ lệ hao hụt lên đến 10 - 50% tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và vệ sinh ao (Từ Thanh Dung, 2005) Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát triển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh Long, sau đó lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

Bệnh do E ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao Bệnh có thể lây

trực tiếp từ cá sang cá thông qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh,

cá chết

E ictaluri có thể lây từ ao này sang ao khác qua lưới, vợt hay một số dụng cụ

khác dùng chung giữa các ao Tuy nhiên, nếu các dụng cụ này được phơi nắng trực tiếp thì có khả năng giết chết vi khuẩn

Chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người cũng góp phần làm lây lan mầm bệnh

2.3.2 Tác nhân gây bệnh

Ban đầu vi khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides được cho là tác

nhân gây bệnh (Trần Thị Minh Tâm và ctv, 2003) Về sau tác nhân gây bệnh được xác

định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung và ctv, 2003)

Đặc điểm của E ictaluri: E ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là

trực khuẩn gram âm kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose E ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Newton và ctv, 1989) Chức năng của

chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng quan trọng trong việc

nâng cao tính kháng đối với kháng sinh của E ictaluri Vi khuẩn phát triển chậm trên

môi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trên môi trường thạch BHIA tại 28 – 300C, phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C Khi

trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E

ictaluri (như Aeromonas.sp) thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E ictaluri phát

triển rất chậm (Shotts và Walman, 1990)

gian ngắn, khoảng 8 ngày (Hawke, 1979) Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong bùn đến

95 ngày ở 25 oC(Plumb và Quinlan, 1986)

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng gây bệnh tự nhiên trên nhiều loài

cá như bệnh viêm ruột và nhiễm trùng máu trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke,

1979, Hawke và ctv., 1981), cá dao xanh Eigemannia virescens (Kent và Lyons, 1982),

cá danio Danio devano (Waltman và ctv., 1985), và cá trê Clarias batrachus

(Kasornchandra và ctv., 1987)

2.3.3 Đường lây truyền của E ictaluri vào cơ thể cá

E ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:

+ Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi, đến dây thần kinh khứu giác, đến màng não, rồi sau đó tiếp tục đến hộp sọ và da (Morrision

và Plumb, 1994) Vi khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc

mũi ở lớp màng nhầy Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E

ictaluri trên bề mặt màng nhầy và trong biểu mô

+ E ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa Đầu tiên vi khuẩn qua

đường miệng, phát triển ở ruột, gan, thận và cơ, sau 2 tuần gây cảm nhiễm làm ruột trương to, đầy hơi (Francis – Floyd và ctv., 1987) Bằng con đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu

+ E ictaluri cũng xâm nhập qua mang Một số thí nghiệm đã chứng minh trong

suốt quá trình ngâm, vi khuẩn sống thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn, sau đó gia tăng ở gan và ít phát triển ở thận sau, ruột và não (Nusbaum và Plumb, 1996)

2.3.4 Triệu chứng và bệnh tích

Triệu chứng: Cá bệnh có xu hướng tập trung ở đầu nguồn nước hoặc hai mặt của

ao, tách đàn, treo mình lơ lửng trong tầng nước, bơi lội và hô hấp chậm hơn bình thường, các phản ứng kích thích thường chậm chạp, cá bị mất thăng bằng và bơi xoay vòng Cá

bỏ ăn ngay sau khi nhiễm khuẩn

Bệnh tích: Theo Từ Thanh Dung và ctv (2003), cá tra bị nhiễm bệnh do E

ictaluri có những triệu chứng và bệnh tích điển hình nhất là: Gan, thận, lách sưng và

hoại tử Nếu bệnh nặng có thể phát triển thành các đốm mủ trắng có đường kính từ 1 – 3

mm khắp trên bề mặt của các cơ quan này

2.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh

Phân lập vi khuẩn trong môi trường BHIA hoặc môi trường TSA có bổ sung 5% máu (cừu, thỏ) Đĩa cấy ủ ở nhiệt độ 28 – 30OC trong 48 giờ Dùng KIT API 20E hoặc Nam Khoa để định danh

Phản ứng miễn dịch: Phản ứng ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA Dùng kĩ thuật PCR nhưng phức tạp và đòi hỏi kĩ thuật cao

Chọn cá giống khỏe mạnh và được kiểm tra kĩ không có mầm bệnh Vận chuyển cá giống đúng kĩ thuật

2.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá

Hiện nay, để gây cảm nhiễm nhân tạo cho cá, thường có các phương pháp sau đây: Phương pháp tiêm, phương pháp ngâm, phương pháp nuôi chung và phương pháp đường tiêu hóa

2.4.1 Phương pháp tiêm

Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp tiêm là phương pháp gây bệnh bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cá qua đường tiêm Thông thường, tiêm vi khuẩn vào xoang bụng hoặc cơ lưng Phương pháp này làm cho cá bệnh nhanh do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu

Hiện nay, phương pháp tiêm được xem như là phương pháp gây bệnh phổ biến nhất trong các thí nghiệm với đối tượng cá da trơn Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hành

tiêm vi khuẩn E ictaluri trên cá tra ở các mật độ 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, cá tra thí nghiệm bắt đầu chết sau 3 ngày với các tỷ

lệ chết tương ứng là 93,55%, 95,65%, 97,4%, 99,77% Theo Williams và Lawrence

(2005) sử dụng mật độ vi khuẩn E ictaluri R4383WT tăng dần 5,2 x 103 cfu/mL; 5,2x

104 cfu/mL và 5,2x 105 cfu/mL tiêm trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus giống, trong

khoảng nhiệt độ nước 26oC cũng gây chết cá với tỷ lệ lần lượt là 67,2%, 100% và 100%

Trong khi đó E ictaluri WT tiêm với mật độ 5,7 x 103 cfu/mL; 5,7 x 104 cfu/mL; 5,7 x

105 cfu/mL; 5,7 x 106 cfu/mL gây chết cá với tỷ lệ là tăng dần từ 63,5% đến 100%

2.4.2 Phương pháp ngâm

Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp ngâm là phương pháp gây bệnh bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thông qua mang, mũi, đường bên Phương pháp này tiến hành bằng cách ngâm cá trong một thể tích nước cố định có pha

vi khuẩn trong một khoảng thời gian xác định

Cùng với phương pháp tiêm, phương pháp ngâm cũng là một phương pháp được áp dụng rất phổ biến trong các thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo với đối tượng

cá da trơn Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hành ngâm vi khuẩn E ictaluri trên cá tra ở

các mật độ 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL, cá tra thí nghiệm bắt đầu chết sau 6 ngày với các tỷ lệ chết tương ứng là 1,35%, 2,75%,

12,6%, 66,9% Theo Williams và Lawrence (2005) sử dụng E ictaluri R4383 WT và E

ictaluri R4383 HM với mật độ 7 x 107 cfu/mL và 7,2 x 107 cfu/mL ngâm trên cá da trơn

Mỹ, kết quả cho thấy tỷ lệ cá chết lần lượt là 85% và 90%

2.4.3 Phương pháp nuôi chung

Là phương pháp gây bệnh bằng cách nuôi chung cá thí nghiệm với cá đã nhiễm bệnh từ trước Trong quá trình nuôi, cá thí nghiệm sẽ bị lây nhiễm từ cá bệnh thông qua tiếp xúc và môi trường nước Hiện nay phương pháp này vẫn chưa được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm gây cảm nhiễm với đối tượng cá tra

2.4.4 Phương pháp đường tiêu hóa

Là phương pháp gây bệnh bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thí nghiệm qua con đường tiêu hóa Theo phương pháp này, vi khuẩn sẽ được trộn với thức

ăn rồi đưa vào ống tiêu hóa của cá bằng dụng cụ chuyên biệt Cũng như phương pháp nuôi chung, hiện nay vẫn chưa có nhiều những nghiên cứu về việc áp dụng phương pháp này trên đối tượng cá tra

2.5 Sơ Lược Về LD 50

2.5.1 Định nghĩa

LD50 ( Lethal dose 50%) là kí hiệu liều chết một nửa, nghĩa là lượng thuốc cần thiết để gây chết 50% cá thể thí nghiệm, được tính bằng mg hoạt chất/kg trọng lượng

cơ thể Người ta thường chia làm ba nhóm:

Loại thuốc có độ độc mạnh khi LD50 = 100 mg/kg thể trọng

Loại thuốc có độ độc trung bình khi LD50 = 100 đến 300 mg/kg thể trọng

Loại thuốc ít độc khi có LD50 trên 300 mg/kg thể trọng

Như vậy, độ độc càng cao thì trị số LD50 càng nhỏ

Trong trường hợp khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên cá bằng vi khuẩn,

LD50 được hiểu là lượng vi khuẩn cần thiết để gây chết 50% số cá thí nghiệm, được

tính bằng CFU/ đơn vị trọng lượng cá

Mỗi loại thuốc khác nhau thì có trị số LD50 khác nhau

Liều LD50 giữa các sinh vật khác nhau cũng khác nhau và cũng có thể khác nhau giữa cá thể đực và cá thể cái

Liều LD50 của thuốc đối với cơ thể còn phụ thuộc vào cách thức xâm nhập của thuốc vào cơ thể Cùng một loại thuốc với cùng một cơ thể, khi xâm nhập qua miệng vào đường ruột tác động có thể khác xâm nhập qua da, vì vậy liều LD50 qua miệng cũng

có thể khác liều LD50 qua da

Là phương pháp thường được sử dụng tính toán trong các thí nghiệm để chuẩn

độ virus, vi khuẩn bảo hộ 50% động vật thí nghiệm và liều gây chết 50% động vật thí nghiệm

Trên thực tế thường khó tìm ra độ pha loãng của canh trùng với liều gây chết 50% động vật thí nghiệm, do đó phải tìm giữa hai nồng độ pha loãng để có tỷ lệ gây chết 50%

Độ pha loãng của canh trùng thường pha loãng gấp 10 lần: 10-1,…, 10-9, 10-10

Theo Mai Trâm (2008), khi gây cảm nhiễm bằng cách ngâm cá tra với các mật

độ vi khuẩn E ictaluri là 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 ×

105 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõi tính được LD50 là 2,34 × 105 cfu/mL (theo Reed – Muench) và 3,09 × 105 cfu/mL (theo phương trình tương quan hồi quy tuyến tính) Khi

gây cảm nhiễm bằng cách tiêm cá tra với các mật độ vi khuẩn E ictaluri là 5,5 × 103

cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõi tính được LD50 là 2,13 × 104 cfu/mL (theo Reed – Muench) và 1,86 × 104 cfu/mL (theo phương trình tương quan hồi quy tuyến tính)

Hảo và Thắng (2008), đã tiến hành gây cảm nhiễm cá tra có trọng lượng

khoảng 30 g bằng phương pháp tiêm E ictaluri, trong thí nghiệm cá tại các nghiệm thức được tiêm 0,2 mL vi khuẩn E ictaluri với những nồng độ khác nhau Kết quả sau cùng

của thí nghiệm cho phép xác định được liều LD50 là 2,5 × 104 cfu/mL

Theo Plumb và ctv (1987), khi tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên cá nheo Châu Âu (Silurus glanis) và cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) bằng phương

pháp tiêm, sau 15 ngày theo dõi đã tính được LD50 của 2 loài trên lần lượt là 5,4 × 106cfu/mL và 7,1 × 104 cfu/mL

Theo Groff và ctv (1990), khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên cá hồi

Bắc Mỹ ở các mật độ vi khuẩn tương ứng là 4 × 106 cfu/mL, 4 × 107 cfu/mL, 4 × 108cfu/mL, sau thí nghiệm tính được LD50 là 3,4 × 107 cfu/mL

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm

Đề tài được thực hiện bắt đầu từ 25/02/2010 đến 30/05/2010 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

Dụng cụ xay, nghiền để làm nhuyễn thức ăn, ray lọc để làm mịn thức ăn

Ống tiêm được tháo kim tiêm và gắn vào một đoạn ống cao su để đưa hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn vào dạ dày cá tra

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Thức ăn viên dành cho cá tra, kích cỡ viên thức ăn dành cho cá giống (1 mm)

3.2.2.2 Môi trường

Môi trường tăng sinh: Môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB)

Môi trường nuôi cấy: Brain Heart Infusion Agar (BHIA)

3.2.3 Đối tượng thí nghiệm

3.2.3.1 Cá thí nghiệm

Cá tra giống khỏe mạnh, sạch bệnh có trọng lượng 10 – 25 g Cá đã được ương nuôi từ giai đoạn cá bột tại Trại thực nghiệm Khoa Thủy sản, trường Đại Học Nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2.3.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn E ictaluri được phân lập và bảo quản tại phòng thí nghiệm Bệnh Học

Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định LD 50 của E ictaluri trên cá tra

Thí nghiệm được bố trí thành 6 nghiệm thức: 1 nghiệm thức đối chứng (dung dịch thức ăn không chứa vi khuẩn) và 5 nghiệm thức gây nhiễm (dung dịch thức ăn có chứa vi khuẩn có độ pha loãng từ 100 đến 10-4) Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn của mỗi nghiệm thức được thể hiện thông qua bảng 3.1

Bảng 3.1: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn gây nhiễm thí nghiệm 1

Nghiệm thức Thức ăn mịn (g) Nước cất (mL) Huyền dịch vi khuẩn (mL)

Mỗi nghiệm thức có 4 lần lập lại, ở mỗi lần lập lại có 10 cá

Liều gây nhiễm: 0,2 mL hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn/ 10 g cá

Cá được chứa trong các bể kính có kích thước 0,4 x 0,3 x 0,3 m, lượng nước trong bể chiếm ¾ thể tích bể

Cá được chuyển vào bể 2 ngày trước khi tiến hành gây nhiễm cho quen với điều kiện mới

Thí nghiệm được tiến hành trong 14 ngày và trong suốt 14 ngày thí nghiệm hoàn toàn không cho cá ăn Mỗi ngày tiến hành thay 20 % lượng nước trong bể

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định liều 5 x LD 50 của E ictaluri trên cá tra

Thí nghiệm được bố trí thành 3 nghiệm thức: 1 nghiệm thức đối chứng (dung dịch thức ăn không chứa vi khuẩn) và 2 nghiệm thức gây nhiễm (gây nhiễm cho cá với liều LD50 và 5 x LD50, với LD50 xác định được từ thí nghiệm 1) Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn của mỗi nghiệm thức được thể hiện thông qua bảng 3.2

Bảng 3.2: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn gây nhiễm thí nghiệm 2

Nghiệm thức Thức ăn mịn (g) Nước cất (mL) Huyền dịch vi khuẩn (mL)

Mỗi nghiệm thức có 4 lần lập lại, ở mỗi lần lập lại có 10 cá

Liều gây nhiễm: 0,2 mL hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn/ 10 g cá

Cá được chứa trong các bể kính có kích thước 0,4 x 0,3 x 0,3 m, lượng nước trong bể chiếm ¾ thể tích bể

Cá được chuyển vào bể 2 ngày trước khi tiến hành gây nhiễm cho quen với điều kiện mới

Thí nghiệm được tiến hành trong 14 ngày và trong suốt 14 ngày thí nghiệm hoàn toàn không cho cá ăn Mỗi ngày tiến hành thay 20 % lượng nước trong bể

3.3.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi

+ Các chỉ tiêu chất lượng nước: Các chỉ tiêu như NH3, pH, DO được đo mỗi ngày một lần vào lúc 7 giờ 30 phút sáng Với nhiệt độ, tiến hành đo hai lần một ngày vào lúc 7 giờ 30 phút sáng và 2 giờ chiều

+ Tỷ lệ chết của các nghiệm thức

+ Triệu chứng và bệnh tích của cá trong 14 ngày thí nghiệm

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria trên các đĩa môi trường BHIA, bằng que cấy vòng trong môi trường vô trùng Sau đó đem ủ ở nhiệt độ

300C trong 48 giờ

Tạo huyền dịch vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc trên các đĩa môi trường đã cấy Chọn những khuẩn lạc rời, to, dùng que cấy vòng chuyển khuẩn lạc vào các ống nghiệm tiệt trùng đã chuẩn bị, tiếp theo pha thêm nước muối sinh lí để tạo thành dung dịch chứa 10 mg khuẩn lạc vi khuẩn/1 mL nước muối sinh lí

Hình 3.1: Thao tác cân khuẩn lạc vi khuẩn

3.3.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn

Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn có trong huyền dịch sau khi tăng sinh ta lấy huyền dịch đã tăng sinh pha loãng theo hệ số 10 để tạo thành các dung dịch có độ pha loãng từ 10-1 - 10-9

Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 mL dung dịch nhỏ lên đĩa thạch đã chuẩn bị (ở mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần), sau đó dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, đem ủ ở 300C trong 48 giờ

Từ số khuẩn lạc tại mỗi nồng độ tương ứng ta suy ra số tế bào vi khuẩn có trong huyền dịch (chỉ đếm ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250)

3.3.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

Sử dụng phương pháp gây nhiễm thực nghiệm thông qua đường tiêu hóa

Sử dụng một số ống tiêm đặc biệt dùng để bơm hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn vào

dạ dày cá Cách thiết kế như sau: Dùng một đoạn ống nhựa mềm dài khoảng 10 cm, có đường kính 1,8 mm Ống nhựa này được gắn vào đầu một ống tiêm loại 5 mL đã tháo bỏ kim tiêm, hai thành phần này phải được cố định bằng keo chuyên dụng để đảm bảo sự chắc chắn trong quá trình gây nhiễm Bên cạnh đó, đầu ống nhựa cũng phải được mài mòn để tránh gây thương tổn bên trong thực quản của cá khi gây nhiễm

Hình 3.2: Ống tiêm dùng để bơm hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn vào dạ dày của cá

Chuẩn bị hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn: Tiến hành nghiền thức ăn viên thành dạng

mịn, sau đó thêm nước tạo dạng dịch lỏng và cho huyền dịch vi khuẩn E ictaluri với

mật độ xác định vào dịch lỏng thức ăn theo tỷ lệ 3,3 g thức ăn + 14,7 mL nước + 2 mL huyền dịch vi khuẩn (các mật độ của huyền dịch vi khuẩn có độ pha loãng khác nhau ứng với từng nghiệm thức)

Trước khi gây nhiễm, cá được gây mê bằng MS 222

Sau khi gây mê cá, nhanh chóng dùng ống tiêm có gắn ống nhựa bơm hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn vào dạ dày cá với liều lượng 0,2 mL/10 g cá Sau khi bơm thức ăn vào cá, dùng bông tẩm cồn sát trùng đầu ống nhựa trước khi tiến hành đối với cá kế tiếp

Hình 3.3: Thao tác gây nhiễm cho cá

Cá sau khi được bơm hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn được chuyển ngay vào xô nước có sục khí để cá hồi tỉnh, sau đó chuyển cá vào bể kính thí nghiệm

3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

Ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể sau khi gây nhiễm Ghi nhận tỷ lệ cá chết

ở mỗi bể Khi phát hiện cá chết trong bể, tiến hành quan sát, ghi nhận các biểu hiện bên ngoài của cá sau đó giải phẩu quan sát các biểu hiện bên trong, cấy phân lập để xác định nguyên nhân gây chết Những cá có dấu hiệu lờ đờ, ngửa bụng được xem như cá chết

3.3.6 Phương pháp cấy phân lập

Dùng kéo và kẹp mở xoang bụng của cá bằng 3 đường cắt (1 đường xuất phát từ phía sau lỗ hậu môn cắt song song với đường bụng và 1 đường xuất phát từ phía sau lỗ hậu môn song song với đường bên Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên) Khi giải phẩu cần phải cẩn thận tránh mũi kéo gây tổn hại các cơ quan bên trong Sau khi cắt xong tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong Dùng 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn lau sạch phần máu và dịch xoang bụng (nếu có) Quan sát và ghi nhận biểu hiện của các nội quan Tách lấy cơ quan cần phân lập Đặt lên 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn, sau đó sát trùng mặt ngoài của cơ quan này Cắt ngang 1 phần của cơ quan này Chấm cơ quan này lên môi trường thạch đã được chuẩn bị sao cho mặt vừa mới cắt tiếp xúc với mặt thạch Thao tác này phải được tiến hành nhanh và gần ngọn lửa đèn cồn để hạn chế việc tạp nhiễm Từ vết chấm, đem cấy ria trên thạch Đem đĩa thạch

đã được cấy đi ủ trong tủ ủ với nhiệt độ 300C trong 48 giờ

3.3.7 Phương pháp cấy thuần

Từ các khuẩn lạc thu được sau khi cấy phân lập từ cá bệnh ta tiến hành cấy thuần Mục đích là để tạo được các chủng vi khuẩn thuần để tiến hành định danh lại tác nhân gây chết cá

Cách tiến hành:

+ Chọn khuẩn lạc đặc trưng Sau đó, cấy ria trên môi trường thạch đã được chuẩn bị sẵn Thao tác này phải tiến hành nhanh tránh tạp nhiễm

+ Đặt các đĩa thạch đã cấy xong vào tủ ủ ở 300C trong 24 - 48 giờ

3.3.8 Phương pháp định danh sơ bộ

3.3.8.1 Phương pháp nhuộm gram

Phương pháp thực hiện:

+ Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lí lên lame

+ Dùng que cấy vòng đã khử trùng để nguội, chọn lấy 1 khuẩn lạc riêng

lẻ Chuyển khuẩn lạc sang lame nơi có nước muối sinh lí Dùng que cấy vòng trang đều tạo thành vết bôi để khô tự nhiên trong không khí

+ Sau khi vết bôi đã khô ta cố định mẫu bằng cách hơ thật nhanh mẫu qua ngọn lửa đèn cồn 3 – 4 lần Không được hơ quá nóng vì sẽ làm các tế bào co lại + Phủ dung dịch crystal violet lên vết phết, để 1 phút Rửa bằng nước và nghiêng lame cho ráo nước

+ Phủ dung dịch lugol lên vết phết, để 1 phút Rửa bằng nước

+ Nhúng lame vào cồn 95% khoảng 30 giây Rửa bằng nước

+ Phủ dung dịch fuschin lên vết phết, để 30 giây Rửa bằng nước

+ Để khô và quan sát dưới vật kính dầu

3.3.8.3 Thử nghiệm Catalase

Phương pháp thực hiện: Nhỏ một giọt thuốc thử catalase lên lame Dùng pipet pasteur lấy khuẩn lạc cần xác định Trộn đều khuẩn lạc với thuốc thử, để yên và đọc kết quả

Cách đọc kết quả: Trong 10 giây, nếu thấy có sủi bọt khí thì kết quả là dương tính (+), còn không thấy bọt khí là âm tính (-)

3.3.8.4 Thử nghiệm Oxidase

Phương pháp thực hiện: Đặt đĩa giấy thử Oxidase lên trên 1 cái lame, nhỏ lên trên đĩa giấy một giọt nước sạch Dùng pipet Pasteur chạm vào khuẩn lạc đã chọn Phết khuẩn lạc này trên đĩa giấy thử Oxidase

Cách đọc kết quả: Trong vòng 60 giây nếu đĩa giấy thử oxidase chuyển sang màu tím đen thì kết quả là dương tính (+), nếu không thấy đổi màu là âm tính (-)

3.3.9 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR)

Trong đề tài này do vi khuẩn dùng để gây bệnh là E ictaluri là một loại trực

khuẩn gram âm nên chúng tôi tiến hành định danh các chủng vi khuẩn nghi ngờ bằng bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR) Đây là một hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh các trực khuẩn gram âm, bằng cách sử dụng mã định danh

Bộ định danh này bao gồm các phản ứng: Oxidase, lên men Glucose, khử Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thủy giải Esculin, sinh H2S, sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động Trong bộ định danh này có một ống thạch để thử tính di động và một ống thạch mềm khác dùng để thử phản ứng LDC, một

lọ chứa các đĩa giấy để thử phản ứng Oxidase Một bảng nhựa gồm 10 giếng có chứa các đĩa giấy đã được tẩm hóa chất dùng để thử các phản ứng sinh hóa còn lại Các giếng này được đánh số từ 1 – 10 và được xếp theo thứ tự được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng

Số thứ tự giếng Đĩa giấy sinh hóa

1 Lên men Glucose

7 Thủy giải Esculin

8 Sinh Indol và sinh H2S

9 Voges-poskauer (VP)

10 Sử dụng Malonate

3.3.9.1 Thử nghiệm LDC bằng kit định danh IDS 14 GNR

Trong bộ định danh này thử nghiệm LDC được xác định trên môi trường thạch mềm Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn cần định danh, dùng pipet hút 0,01 mL huyền dịch

vi khuẩn nhỏ vào môi trường thử

Đọc kết quả:

(+) môi trường giữ màu tím hoặc vàng nhạt

(-) môi trường chuyển màu vàng

3.3.9.2 Thử nghiệm di động bằng kit định danh IDS 14 GNR

Trong bộ định danh này thử nghiệm di động được xác định trên môi trường thạch đứng Dùng que cấy thẳng đã được tiệt trùng lấy một khuẩn lạc rời có thời gian phát triển từ 18 – 24 giờ, mở nắp môi trường và cấy đâm thẳng xuống đáy chai môi trường, không cho que cấy chạm đáy của ống môi trường, đóng nắp môi trường lại và để trong

tủ ấm có nhiệt độ 300C Thao tác này phải tiến hành nhanh và gần ngọn lửa đèn cồn để không bị tạp nhiễm

Đọc kết quả:

(+) vi khuẩn mọc và lan nhòe đường cấy

3.3.10 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá

Mục đích: Kiểm tra tình hình sức khỏe của cá nuôi Việc kiểm tra kí sinh trùng được tiến hành định kì

+ Kiểm tra ngoại kí sinh: Dùng lame cạo lấy nhớt ở nhiều vị trí khác nhau trên cơ thể cá: Da, vây,… Sau đó gạt nhẹ nhớt cạo được lên một lame khác, nhỏ lên đó 1 hoặc 2 giọt nước sạch rồi dàn mỏng lớp nhớt trên lame, đậy lamelle lên và quan sát dưới kính hiển vi

+ Kiểm kí sinh trùng ở cung mang: Dùng kéo cắt bỏ nắp mang Cắt riêng từng cung mang, nhúng sơ qua một đĩa nước đã chuẩn bị trước để rửa bớt máu Đặt từng cung mang lên lame, quan sát dưới kính hiển vi từ bội giác nhỏ đến bội giác lớn

+ Kiểm tra nội kí sinh: Mổ cơ thể cá quan sát ruột và túi mật tìm giun tròn Đối với ruột ta dùng kéo mổ dọc để tìm giun tròn

- Tính số cá chết ở mỗi nghiệm thức, sau đó cộng dồn từ thấp đến cao

- Tính số cá sống ở mỗi nghiệm thức, sau đó cộng dồn từ thấp đến cao

- Tính tỷ lệ chết của cột cá chết và cột cá sống cộng dồn

- Tính khoảng cách tương ứng (pd: proportionate distance) giữa 2 độ pha loãng

có tỷ lệ chết cao hơn 50% và tỷ lệ chết thấp hơn 50% gần nhất

pd = [(>50%) – 50%]/[(>50%) – (<50%)]

logLD50 = [log(>50%)] + [log(10-1)*pd] = y

Ö LD50 = 10y

Ö Liều gây chết 50% cá thí nghiệm:

= (nồng độ vi khuẩn trong huyền phù ban đầu)*10y

(Y) và độ pha loãng vi khuẩn (X) sẽ được quy đổi sang giá trị Y’ và X’ như sau:

- Quy đổi Y sang Y’= arcsin √Y

- Quy đổi X sang X’= lgX

Sau đó các giá trị X’ và Y’ được biểu diễn theo phương trình tương quan hồi quy: Y’=aX+b bằng phần mềm MiniTab Khi Y =50% thì Y’ = arcsin√50 và X = 10X’

- LD50 = (nồng độ vi khuẩn trong huyền phù) x 10X’

+ Phương pháp phân tích probit bằng phần mềm Minitab 15.21

- Quy đổi số liệu theo lg (đối với các mật độ vi khuẩn gây nhiễm) và theo arcsin√ (đối với tỷ lệ cá chết tích lũy)

- Sử dụng phần mềm MiniTab 15.21 để tìm ra mối tương quan giữa tỷ lệ chết

và độ pha loãng của vi khuẩn, từ đó tính được LD50

- LD50 = (nồng độ vi khuẩn trong huyền phù ban đầu)*10y (với y là độ pha loãng ứng với tỷ lệ chết 50%)

3.3.12 Phương pháp xử lí số liệu

Xử lí số liệu bằng phần mềm Minitab 15.21 For Windows

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các chỉ tiêu môi trường

Các chỉ tiêu môi trường của quá trình thí nghiệm được thể hiện thông qua bảng 4.1

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường của quá trình thí nghiệm

Chỉ tiêu Khoảng dao động Nhiệt độ (0C) 25 – 26,5

DO (mg/L) 2,5 – 4

NH3(ppm) 0,003 – 0,009 + Nhiệt độ: Trong quá trình theo dõi thí nghiệm, nhiệt độ nước dao động từ 25 – 26,50C ở các nghiệm thức Kết quả này cho thấy nhiệt độ nước trong các bể thí nghiệm

là khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong giới hạn chịu đựng của cá tra Đồng thời đây

cũng là khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và gây bệnh của vi khuẩn E ictaluri

trên cá thí nghiệm

+ pH: Qua quá trình theo dõi thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng pH ở các nghiệm thức dao động trong khoảng 7,1 – 7,4 Như vậy pH trong quá trình thí nghiệm cũng nằm trong khoảng giới hạn chịu đựng của cá thí nghiệm

+ Hàm lượng ôxy hòa tan (DO): Hàm lượng ôxy hòa tan trong suốt thời gian thí nghiệm ở các nghiệm thức dao động từ 2,5 – 4 mg/L, đây là hàm lượng ôxy hòa tan thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá tra

+ NH3: Theo Meade (1989; trích dẫn bởi Nguyễn Phú Hòa, 2000), nồng độ NH3

thích hợp trong môi trường nuôi cá nước ngọt là nhỏ hơn 0,1 ppm Hàm lượng NH3 mà chúng tôi kiểm tra được trong thời gian thí nghiệm dao động trong khoảng 0,003 – 0,009

ppm Như vậy hàm lượng NH3 này thấp hơn nhiều so với chỉ tiêu NH3 trong môi trường nuôi cá nước ngọt của Meade, nghĩa là giá trị này rất thích hợp cho sự phát triển của cá thí nghiệm Sở dĩ hàm lượng NH3 trong quá trình thí nghiệm dao động tương đối thấp là

vì trong suốt quá trình thí nghiệm chúng tôi không cho cá ăn

Như vậy trong suốt quá trình thí nghiệm các chỉ tiêu chất lượng nước đều dao động trong khoảng thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá thí nghiệm

4.2 Kết Quả Thí Nghiệm 1

4.2.1 Trọng lượng cá thí nghiệm

Trước khi tiến hành gây nhiễm chúng tôi tiến hành cân trọng lượng cá ở mỗi nghiệm thức Trọng lượng trung bình của các nghiệm thức được thể hiện qua bảng 4.2

Bảng 4.2: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thức thí nghiệm 1

Nghiệm thức Số lần lập lại (cá) Trọng lượng trung bình (g)

4.2.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

Trước khi cá được chuyển lên phòng thí nghiệm để chuẩn bị thí nghiệm, chúng tôi tiến hành kiểm tra kí sinh trùng đối với nguồn cá này với số lượng 15 cá Kết quả cho thấy rằng cá hoàn toàn khỏe mạnh, không nhiễm kí sinh trùng

4.2.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá

Chúng tôi tiến hành pha dung dịch gốc bằng cách cân 10 mg khuẩn lạc hòa trong

1 mL nước muối sinh lí để tạo thành dung dịch gốc Từ dung dịch gốc này chúng tôi tiến

hành pha loãng theo hệ số 10 để tạo thành các dung dịch vi khuẩn với các mật độ khác

nhau Trộn các dung dịch vi khuẩn này với thức ăn mịn và nước để tạo thành hỗn hợp

dung dịch thức ăn và vi khuẩn để tiến hành gây nhiễm cho cá

Sau khi cấy trang để đếm số lượng khuẩn lạc của dung dịch gốc chúng tôi tính

được mật độ vi khuẩn trong bình gốc là 5,5 x 109 CFU/mL Mật độ vi khuẩn gây nhiễm

cho cá của các nghiệm thức được thể hiện thông qua bảng 4.3

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá của các nghiệm thức thí nghiệm 1

Nghiệm thức

Mật độ vi khuẩn trong dung dịch ban đầu (CFU/mL)

Mật độ vi khuẩn trong hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn (CFU/mL)

Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá (CFU/10 g cá)

4.2.4 Kết quả định danh vi khuẩn

Trong suốt 14 ngày thí nghiệm, khi có cá chết chúng tôi tiến hành cấy phân lập

và tái định danh lại tác nhân gây chết đối với cá Kết quả cho thấy rằng các mẫu cấy

phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách cá bệnh đều thu được những khuẩn lạc tròn, đường

kính 0,5 – 2 mm Khuẩn lạc có màu trắng đục, tâm có màu hơi vàng, mép khuẩn lạc có

dạng răng cưa đều