Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy sinh hóa tự động

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 tại Khoa xét nghiệm Bệnh viện 74 trung ương nhằm mục tiêu Kiểm định một số đặc tính của máy AU680 Beckman Coulter đối chiếu với kết quả do nhà sản xuất đã công bố và những quy định theo CLIA.

THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

1 Tên đề tài: Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động

Beckman Coulter AU680 tại Khoa xét nghiệm Bệnh viện 74 trung ương

2 Thời gian thực hiện: 08 tháng

Từ tháng 3 năm 2018

đến tháng 10 năm 2018

3 Cấp quản lý: Cấp cơ sở

4 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Nguyễn Bá Vương

Chuyên môn: Cử nhân xét nghiệm

Chức vụ: Kỹ thuật viên trưởng khoa

Khoa, phòng: Xét nghiệm

Địa chỉ: Khoa xét nghiệm- Bệnh viện 74 Trung ương

Điện thoại: 0944434242 Email: bavuong1108@gmail.com

5 Các cán bộ tham gia nghiên cứu:

1 Họ tên: Ths.Trương Công Thứ Đơn vị: khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn

2 Họ tên:BSCKI Cao Thanh Thủy Đơn vị: khoa Xét nghiệm

6 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Kiểm định một số đặc tính của máy AU680

Beckman Coulter đối chiếu với kết quả do nhà sản xuất đã công bố và những quy định theo CLIA.

7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng quan tình hình nghiên cứu

thuộc lĩnh vực của đề tài Nêu được tính cấp thiết của nghiên cứu

Ngày nay, chất lượng xét nghiệm là mục tiêu hàng đầu của các phòng xétnghiệm Khi một phương pháp xét nghiệm mới được áp dụng hay thiết bị xétnghiệm mới được đưa vào hoạt động hay tại các khoảng thời gian nhất định đánh giáhiệu năng phương pháp đang sử dụng, Để đảm bảo chất lượng các xét nghiệm, phòngxét nghiệm phải tiến hành thẩm định phương pháp xét nghiệm hay thẩm định giá trị sửdụng

Các phương pháp đo lường luôn bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên Sai số

hệ thống luôn xảy ra theo một hướng và làm cho tất cả các kết quả xét nghiệm caohơn hoặc thấp hơn giá trị thực Tổng sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống được cho

là sai số toàn bộ cho phép của phòng xét nghiệm – đây là thông số đo lường hiệunăng phương pháp và là quan trọng nhất để đánh giá xem liệu sai số kỹ thuật củaphương pháp đó có chấp nhận được hay không Dữ liệu độ chính xác và độ xácthực nếu xem xét riêng rẽ là không đủ để đánh giá hiệu năng phương pháp xétnghiệm Chất lượng xét nghiệm được đo đạc bằng “thang đo six sigma” Do vậy,sigma là phương pháp tiếp cận tốt nhất cho các phòng xét nghiệm lâm sàng.

Hiện nay, Bộ Y tế đã ban hành Quyết định số 2429/QĐ-BYT ngày 12/06/2017

về việc ban hành Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học Trong

hồ sơ của Bộ tiêu chí hay hồ sơ của tiêu chuẩn ISO15189:2012 cũng đòi hỏi phòngxét nghiệm phải tiến hành thẩm định các phương pháp được triển khai trên các hệthống thiết bị xét nghiệm mới được đưa vào phân tích tại phòng xét nghiệm

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Thẩm định phương pháp xét nghiệm trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680 tại Khoa xét nghiệm Bệnh viện 74 trung ương”.

7.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

7.1.1.1 Khái niệm thẩm định phương pháp:

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấpbằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêucầu đặt ra Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giáchất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích

Hiện nay nhiều thuật ngữ khác nhau được sử dụng để chỉ khái niệm trên nhưđịnh trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng của phươngpháp, phê duyệt phương pháp Tất cả các thuật ngữ này đều là cách gọi khác nhaucủa thẩm định phương pháp (method validation)

7.1.1.2 Thẩm định phương pháp gồm :

Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn: Các phương pháp thử theo tiêu chuầnquốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới nhưTCVN, ISO,

Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn: Các phương pháp do PXN tự xâydựng, phương pháp theo hướng dẫn của NSX thiết bị, phương pháp theo tạp chí, tài

liệu chuyên ngành,

7.1.1.3 Yêu cầu của thẩm định phương pháp:

Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn: Phải có kết quả thẩm định của phươngpháp tiêu chuẩn và kết quả này phải phù hợp với yêu cầu của PXN PXN cần đảmbảo có thể đạt được các thông số được mô tả trong phương pháp tiêu chuẩn

Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn: Đối với phương pháp không tiêuchuẩn thì thẩm định phương pháp là một yêu cầu bắt buộc phải thực hiện đi kèmvới việc phát triển phương pháp mới và áp dụng các phương pháp không tiêu chuẩnvào thực hiện thành thường quy

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve)

- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ)

- Độ lệch/độ đúng (Bias/Trueness)

- Độ chụm (Precision)

- Độ chính xác (Accuracy)

- Độ ổn định của phương pháp (Robustness/Ruggedness)

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trongPXN, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của PXN,…Từng trườnghợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau

7.1.1.4.1 Đánh giá khoảng tuyến tính:

Khoảng tuyến tính (Linearity range) của một phương pháp phân tích làkhoảng nồng độ mà ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được vànồng độ chất phân tích hay chính là các kết quả xét nghiệm nhỏ nhất và lớn nhất cóthể đủ tin cậy để thông báo

Khoảng tuyến tính còn được gọi là khoảng đo lường phân tích: là khoảng giátrị đo của thiết bị có thể sử dụng để báo cáo trực tiếp, không đòi hỏi phải pha loãnghay cô đặc mẫu xét nghiệm

Đỗi với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác

định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính đặc biệt quan trọng với 2điểm là giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – điểm thấp nhất) và giới hạntuyến tính (upper limit of reportable range – điểm cao nhất).

Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn cónồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của trị số đo được vào nồng độ Vẽđường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộccho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vàonhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và phươngpháp phân tích được sử dụng Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác nhau

do sự khác nhau về tính chất lý hóa Trong khi các phương pháp phân tích khácnhau ảnh hưởng lớn đến độ dài ngắn của khoảng tuyến tính

7.1.1.4.2 Đánh giá độ chính xác (độ chụm):

Độ chụm là mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiện độc lập trên cùngmột mẫu và trong cùng điều kiện thực hiện; được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn(SD) và hệ số biến thiên (CV) Cho thông tin liên quan đến sai số ngẫu nhiên

Vật liệu sử dụng: chất chuẩn, chất chứng, mẫu trộn

Độ chụm ngắn hạn (độ lặp lại) 2 mức QC, chạy lặp lại 20

Tiêu chuẩn chấp nhận của độ chụm (theo CLIA):

+ Độ chụm ngắn hạn ≤0.25 TE A

+ Độ chụm dài hạn ≤0.33 TE A

7.1.1.4.3 Đánh giá độ xác thực:

Độ xác thực là mức độ gần đúng giữa kết quả một phép đo và giá trị thật của chất

đo Cho thông tin liên quan đến lỗi hệ thống

Vật liệu sử dụng: các mẫu đã biết trước giá trị: chất chuẩn, mẫu ngoại kiểm, QC

Số lượng mẫu: tối thiểu 20 mẫu (xác nhận phương pháp)/40 mẫu (thẩm địnhphương pháp) có giá trị nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp

Mỗi mẫu chạy 2 lần với phương pháp xét nghiệm/phương pháp tham chiếu(phương pháp so sánh).

Tiến hành phân tích trong tối thiểu là 5 ngày

Xây dựng phương trình tương quan giữa kết quả của phương pháp cần xác nhận vàkết quả tham chiếu:

+ Kết quả tham chiếu đặt trên trục x, kết quả phương pháp cần thẩm định/xác nhận đặt trên trục y

+ Xác định phương trình tương quan: y = ax + b với hệ số tương quan r.Trong đó:

y là kết quả của phương pháp xét nghiệm cần xác nhận;

x là kết quả của phương pháp tham chiếu

a là độ dốc (slope)

b là giao điểm của đồ thị với trục tung

Sử dụng Excel (Data Analysis) để tính toán a, b và vẽ biểu đồ tương quan

Xác định độ lệch (Bias): Bias =

True Value: Giá trị thực (giá trị đích): Từ HDSD của nhà sản xuất

Xác định sai số tổng (TE):

TE = |Bias| + Z*SD

+ Nếu: TE = SE+RE = Bias + 1.65*SD

TE là tổng biến đổi của 95% dữ liệu của cùng quần thể so với giá trị thực.+ Nếu: TE = SE + RE = Bias + 1.96 *SD

TE là tổng biến đổi của 97.5% dữ liệu của cùng quần thể so với giá trị thực.TEA : Sai số toàn bộ cho phép (TEA=Total allowable error)

7.1.1.4.4 Đánh giá hiệu năng phương pháp:

Sử dụng thang đo sigma (Six – Sigma Metrics): Six sigma là phương pháp đo

lường chất lượng và cải tiến chất lượng được Motorola phát triển từ những năm

1980 Phương pháp Sigma có thể áp dụng khi kết quả của một quá trình có thể đolường được Six – Sigma Metrics cung cấp thông tin nhiều hơn cho 1 phương pháp,được đánh giá thể hiện qua các số liệu sigma từ 1 đến 6 Khi sigma tăng, tính nhấtquán và bảo đảm của các thử nghiệm được cải thiện, do đó làm giảm chi phí vậnhành

Sigma = [(%TEA - % Bias)/%CV]

Hình 2: Đồ thị six – sigma biểu thị điểm hoạt động (operating point) tương

ứng với giá trị sigma của phương pháp

Đánh giá:

Tương ứng với các giá trị sigma là hiệu năng của phương pháp:

+ Sigma = 6 (hoặc cao hơn): Hiệu năng có thể coi là đẳng cấp quốc tế(World class) (tương ứng với 34 lỗi/1 triệu xét nghiệm)

+ Sigma = 5: Hiệu năng phương pháp là tuyệt vời (excellent) (tương ứng với

230 lỗi/1 triệu xét nghiệm)

+ Sigma = 4: Hiệu năng phương pháp là tốt (good) (tương ứng với 6210 lỗi/1triệu xét nghiệm)

+ Sigma = 3: Hiệu năng phương pháp có thể coi là chấp nhận được (tươngứng với 66.800 lỗi/1 triệu xét nghiệm)

+ Sigma = 2: Phương pháp đó có hiệu năng kém (tương ứng với 308.000lỗi/1 triệu xét nghiệm)

+ Sigma = 1: Phương pháp đó không chấp nhận được (tương ứng với690.000 lỗi/1 triệu xét nghiệm)

Như vậy, công cụ sigma rất hữu ích cho việc hướng dẫn thiết lập 1 chiếnlược kiểm soát kết quả nội kiểm tương ứng với các mức giá trị sigma khác nhau

7.1.2 Các phương pháp xét nghiệm hóa sinh cơ bản:

Hiện nay, các xét nghiệm hóa sinh được tiến hành trên các máy xét nghiệm hóasinh tự động chủ yếu sử dụng 2 phương pháp: đo quang, điện cực chọn lọc ion

7.1.2.1 Phương pháp đo quang:

Nguyên tắc cơ bản: Khi ánh sáng đi qua dung dịch chất phân tích, các photon trong tia sáng sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử trong dung dịch Sự giảm cường độ

chùm tia sáng tỉ lệ với nồng độ của dung dịch chất phân tích Đo sự giảm cường độ ánh sáng, từ đó xác định nồng độ của mẫu thử

Cơ sở của phương pháp là các định luật về hấp thụ ánh sáng

Định luật Lamber- Beer:

Tt = I0 x 10 –aCl

Một số đại lượng về hấp thụ ánh sáng:

+ Độ thấu quang T: T = Tt / I0 = 10 –aCl + Độ hấp thụ quang A( hay còn gọi là mật

độ quang OD) :

A = OD = lg 1/T = lg 1/ 10 –aCl = lg10aCl = aCl

* Phép đo điểm cuối (End point):

Phép đo điểm cuối là một phép đo phức hợp màu tốc độ phản ứng tuyến tính với thời gian, phản ứng kết thúc hoàn toàn sau một thời gian nhất định

C mẫu thử = MĐQ mẫu thử x C mẫu chuẩn = MĐQ mẫu thử x K

MĐQ mẫu chuẩn

* Phép đo 2 điểm (two point, Fixtime):

Phép đo 2 điểm là phép đo phức hợp màu tốc độ phản ứng không tuyến tính vớithời gian, không xác định được thời điểm kết thúc của phản ứng (t1 = 30s và t2 =90s)

∆A = A2 - A1 Trong đó ∆A là hiệu số mật độ quang

C mẫu thử = MĐQ mẫu thử x C mẫu chuẩn = ∆A mẫu thử x K

MĐQ mẫu

chuẩn

* Phép đo động học enzym (kinetic):

Là phép đo nhiều điểm, tốc độ phản ứng tuyến tính với thời gian có tác dụng đomật độ quang của sản phẩm tạo thành, hoặc đo sự giảm dần của nồng độ cơ chất Thông thường đo ở 5 thời điểm: t1 = 30s, t2 = 45s, t3 = 60s, t4 = 75s, t5 = 90s

Lấy hiệu số mật độ quang giữa hai thời điểm:

∆A1 = A2 - A1

∆A2 = A3 - A2

∆A3 = A4 - A3

∆A4 = A5 - A4

Tính trung bình mật độ quang giữa các thời điểm

∆Ā= ∆A1 + ∆A2 + ∆A3 + ∆A4

4

C mẫu thử = ∆Ā x K

7.1.2.3 Phương pháp điện cực chọn lọc ion:

Phương pháp đo điện thế dựa trên việc đo lường hiệu điện thế giữa 2 điệncực Một điện cực đo lường tiếp xúc với ion trong dung dịch Điện thế giữa điệncực này và điện cực chuẩn sẽ thay đổi khi nồng độ ion trong dung dịch thay đổi.Phương pháp đo điện thế thích hợp cho việc đo lường các ion (chất điện giải) như

Na+ , K+ , Cl-

Phương pháp điện cực chọn lọc ion dựa trên nguyên lý của kỹ thuật đo điệnthế, sự chênh lệch điện thế giữa điện cực chuẩn và điện cực chỉ thị (điện cực đolường) tỷ lệ thuận với nồng độ của ion được đo lường Một điện cực chọn lọc ion

lý tưởng bao gồm một màng mỏng có khả năng thẩm thấu một loại ion đặc hiệu.Với sự có mặt của ion đặc hiệu, màng sẽ tạo ra một hiệu điện thế tỷ lệ với sự hoạtđộng của ion đó Có 4 loại màng điện cực chọn lọc chính hay được sử dụng: điệncực màng rắn, điện cực màng thủy tinh, điện cực màng lỏng, điện cực hợp chất.Màng thủy tinh được chế tạo có tính chọn lọc với ion Na+ và loại bỏ các cationkhác Màng valinomycin được dùng cho đo lường K+ có thể loại bỏ hiệu quả Na+ vàcác ion nhiễu khác Thành phần đặc trưng của phương pháp định lượng Cl- là điệncực bạc – clorua bạc hoặc sulfide bạc

Phương pháp điện cực chọn lọc ion có thể trực tiếp hoặc gián tiếp Phương

pháp trực tiếp không đòi hỏi pha loãng mẫu bệnh phẩm, đo lường ion trong huyếttương chứ không phải trong tổng thể tích Vì vậy, các chất hòa tan như lipid,protein khi tăng cao sẽ không ảnh hưởng đến phép đo Phương pháp gián tiếp chỉcần một lượng mẫu nhỏ Khi pha loãng sẽ dựa trên thể tích toàn phần, vì thế khilipid máu cao hoặc protein máu cao sẽ ảnh hưởng đến kết quả

7.1.3 Giới thiệu máy xét nghiệm sinh hóa Beckman Coulter AU680:

Máy xét nghiệm hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680( AU680) là hệ thống xét nghiệm tốc độ cao, năng suất, hiệu quả và tiết kiệm tối đa chi phí cho PXN AU680 được thiết kế cho các phòng xét nghiệm và bệnh viện vừa và lớn để đáp ứng nhu cầu tăng nhanh về áp lực thời gian và năng suất

Hình: Máy xét nghiệm hóa sinh tự động Beckman Coulter AU680

Sự linh hoạt của thiết kế cho phép máy hoạt động độc lập hoặc kết nối với hệ

thống labo tự động Tính năng truy cập ngẫu nhiên đạt tốc độ cao 800 xét nghiệm quang/ giờ( 1200 xét nghiệm với bộ điện giải ISE), và khả năng cài đặt 63 loại xét nghiệm trên máy Hai hệ thống lấy mẫu: Một hệ thống lấy mẫu hiệu quả cao, đáp ứng cho việc nạp mẫu liên tục với một số lượng lớn mẫu và một hệ thống lấy mẫu cho chế độ chạy cấp cứu.

+ Rack Sample: Có thể chứa cùng một lúc 300 mẫu bệnh phẩm và việc nạp mẫuđược thực hiện trong suốt quá trình xét nghiệm khi cần thiết

+ Rack STAT: Có thể chứa được 22 mẫu cho chế độ chạy cấp cứu Nó được thiết kế cho việc giữ lạnh mẫu bệnh phẩm và mẫu QC

AU680 phát hiện tắc, phát hiện va chạm đầu probe và phát hiện bọt khí, mẫu bị đông và bảo vệ đầu probe tránh va chạm Khi mẫu bị vón cục với những sợi fibrin được phát hiện, máy báo động và tự động dừng để tránh va chạm với ống đựng mẫu

Hệ thống truy nhập thông minh và hệ thống ISE tốc độ cao: AU680 kết hợp hệ thống truy nhập ngẫu nhiên thông minh với 4 đầu probe, hóa chất di chuyển tự do giữa 2 luồng cuvet phân phối vào hai khay hóa chất Hệ thống sẽ nhanh chóng lựa chọn điều kiện tốt nhất để phân phối mẫu tương ứng với những yêu cầu xét nghiệm

đã yêu cầu cho mỗi mẫu

7.1.4 Các kỹ thuật định lượng các thông số nghiên cứu trên máy xét nghiệm hóa sinh tự động AU680:

7.1.4.1 Nguyên lý định lượng Glucose bằng phương pháp GOPD

- Glucose + H2O GOD Acid gluconic + H2O2 ( GOD: Gluco Oxy Dase)

2 H2O2 + Phenol + 4 amino-Antipyrin POD Quinonemin + 4H2O

( Peroxydase)

Đậm độ màu của phức hợp tạo thành tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong huyếtthanh và được xác định ở bước sóng 505 nm.

7.1.4 2 Nguyên lý định lượng Ure bằng phương pháp động học UV

Với sự có mặt của nước và urease, ure sẽ bị thủy phân sinh ra amoniac và carbondioxide Amoniac sinh ra kết hợp với 2-oxoglutarat và NADH dưới sự có mặt củaglutamate dehydrogenase( GLDH) để tạo thành glutamat và NAD+ Sự giảm độ hấpthụ quang của NADH theo đơn vị thời gian tại bước sóng 340 nm tỷ lệ với nồng độure trong mẫu thử

Ure + H2O urease 2 NH4+ + CO3

2-2- Oxoglutarate + 2 NH4+ GLDH 2L- Glutamate + 2 NAD+ + 2H2O

7.1.4 3 Nguyên lý định lượng Creatinin bằng phương pháp Jaffe động học

Creatinin + Acid pycric NaOH Creatin pycrat

( Vàng chanh) ( vàng da cam)

Đậm độ màu đỏ da cam tỷ lệ thuận với nồng độ creatinin trong huyết thanh vàđược xác định ở bước sóng 500 nm bằng phép đo động học 2 điểm( two pointkinetic)

7.1.4.4 Nguyên lý định lượng Albumin bằng phương pháp Bromocresol green

Albumin huyết thanh tác dụng với Bromocresol green( BCG) trong môi trườngcủa dung dịch đệm Succinate PH4.2 tạo phức hợp màu xanh lục

Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ Albumin huyết thanh ở bước sóng 620 nmbằng phép đo điểm cuối

7.1.4 5 Nguyên lý đo hoạt độ Alanin Transaminase ALT( GPT)

A.Alanin + α Cetoglutaric ALT A Pyruvic + Glutamic

A Pyruvic + NADH2 LDH A Lactic + NAD+

Phức hợp tạo thành trong quá trình phản ứng có độ đục giảm dần, được xác định