CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐỐN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TRẦN THỊ QUẾ Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐỐN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS PHẠM HÙNG VÂN TRẦN THỊ QUẾ Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học truyền đạt kiến thức, dạy dỗ suốt bốn năm qua Thầy Phạm Hùng Vân tận tình hướng dẫn tơi hồn thành đề tài mặt lý thuyết lẫn phương pháp tiến hành Các anh chị cơng ty Nam Khoa nhiệt tình giúp đỡ, dẫn thao tác cho tơi Gia đình cô Đông tạo điều kiện thuận lợi cho chỗ suốt trình thực tập Tồn thể bạn lớp DH06SH trường đại học Nơng Lâm ủng hộ, giúp đỡ mặt vật chất tinh thần Cuối xin chân thành cảm ơn cha mẹ, đấng sinh thành nuôi nấng dạy dỗ bên con, động viên lúc gặp khó khăn iii TĨM TẮT Trong chiến dịch kiểm sốt loại bỏ bệnh sởi khẳng định chẩn đốn phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng Phương pháp real time PCR thiết kế để chẩn đoán bệnh sởi mẫu phết mũi Đề tài sử dụng dãy pha loãng chủng virus vaccine sởi Schawarz (chủng vaccine sống, giảm độc lực) mẫu phết mũi (được thu thập từ người bình thường thả chủng vaccine biết trước nồng độ vào) để kiểm tra độ nhạy kit Tiến hành ly trích RNA, phiên mã ngược, khuếch đại gene N MV-cDNA, việc xác định số lượng gene virus mẫu thử so sánh với mẫu chuẩn chuẩn bị từ pha loãng plasmid chứa MV N gene, kit có độ nhạy cao cho virus sởi: giới hạn phát kit gần copy MV-cDNA/phản ứng Sự tương quan giá trị Ct nồng độ RNA virus tuyến tính từ 104–100 RNA copies/giếng phản ứng, mức độ biến động thí nghiệm thấp Hơn nữa, mẫu phết mũi âm tính chứng minh thực âm tính nhờ sử dụng chứng nội RNAse P (gene chủ nhà) Kết chứng minh kit có khả phát virus sởi, đạt yêu cầu iv SUMMARY Topic title “Detecting meseasle virus by real-time PCR” As measles control and elimination campaigns progress, laboratory confirmation of clinically diagnosed measles cases becomes increasingly important A real-time PCR assay for measles virus was designed for testing nasopharyngeal aspirate (NPA) samples In this study we used dilution series of live-attenuated MV Schawarz vaccine and NAP samples (collected from normal people and spiked known quantities of MV vaccine) to check the sensitivity of the test Extraction of RNA from these samples and then reverse transcription and MV-N gene ampication and calculation of virus genome number in these samples, by comparison with a standard curve prepared from dilutions of clone MV-N gene, indicated that the test was highly sensitive for measles virus: the limits of detection were determined to be approximately copy for each target RNA/reaction The relationship between Ct values and RNA concentration was linear within a range of 104–100 RNA copies/reaction, and intra- and inter-assay variability was low Furthermore, negative NPA samples were illustrated actually negative by using RNAse P internal control (gene keeping house) These results demonstrate that the kit is useful for rapid diagnosing measles and meets the qualitive control v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Nội dung thí nghiệm Chương TỔNG QUAN 2.1 Bệnh sởi 2.1.1 Lịch sử bệnh sởi 2.1.2 Giới thiệu bệnh sởi 2.1.2.1 Khái niệm bệnh sởi 2.1.2.2 Biểu lâm sàng 2.1.2.3 Biến chứng 2.1.2.4 Đường truyền lây 2.1.2.5 Miễn dịch 2.1.2.6 Điều trị bệnh sởi 2.1.2.7 Phòng ngừa 2.1.3 Tình hình bệnh sởi giới 2.1.4 Tình hình bệnh sởi Việt Nam 2.2 Virus sởi (Measles virus – MV) 2.2.1 Phân loại, hình thái học cấu trúc 2.2.2 Vai trò protein MV vi 2.2.3 Quá trình chép MV (replication) 2.2.4 Thụ thể (receptor) MV 2.2.5 Sức chống chịu MV 2.2.6 Loài cảm nhiễm 2.2.7 Cơ chế sinh bệnh MV 2.2.8 Giới thiệu gene N MV 10 2.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sởi 10 2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 10 2.3.2 Xét nghiệm 10 2.3.3 Phân lập định danh virus 11 2.3.4 Huyết học 11 2.3.5 ELISA gián tiếp 11 2.3.6 Phương pháp RT-PCR 12 2.4 Phương pháp real-time PCR 12 2.4.1 Phương pháp PCR 12 2.4.1.1 Nguyên lý 12 2.4.1.2 Thành phần phản ứng PCR 12 2.4.1.3 Các giai đoạn phản ứng PCR 12 2.4.1.4 Tối ưu hóa PCR 13 2.4.2 RT - PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 13 2.5.7 Real-time PCR 14 2.5.7.1 Máy real-time PCR 15 2.5.7.2 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR (amplification graph) 15 2.5.7.3 Biểu đồ chuẩn real-time PCR 16 2.5.4 Hóa chất thuốc thử cho real-time PCR 18 2.5.4.1 Real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn 18 2.5.4.2 Real-time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 18 2.5.4.3 Real-time PCR sử dụng Molecular Beacon probe 20 2.5.5 Phân tích liệu Real-time PCR 21 2.5.5.1 Định lượng tuyệt đối 21 2.5.5.2 Định lượng tương đối 21 2.6 Loại trừ nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại 21 vii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian thực đề tài 23 3.2 Vật liệu 23 3.2.1 Mẫu 23 3.2.2 Hóa chất 23 3.2.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết RNA 23 3.2.2.2 Hóa chất tổng hợp cDNA 23 3.2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng real – time PCR 23 3.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 24 3.3.1 Dụng cụ thiết bị dùng cho ly trích RNA 24 3.3.2 Dụng cụ thiết bị dùng cho tổng hợp cDNA 25 3.3.3 Dụng cụ thiết bị dùng cho Real – time PCR 25 3.4 Phương pháp xác định đánh giá độ nhạy quy trình 25 3.5 Phương pháp thí nghiệm 26 3.5.1 Ly trích RNA tồn phần 26 3.5.1.1 Xử lý mẫu 26 3.5.1.2 Ly trích RNA 28 3.5.2 Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên 28 3.5.3 Thực phản ứng real-time PCR 29 3.5.4 Phân tích kết real time PCR 31 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết 32 4.1.1 Kết khảo sát chủng vaccine sởi 32 4.1.2 Khảo sát độ nhạy kit dãy pha loãng chủng vaccine sởi 33 4.1.3 Khảo sát độ nhạy kit mẫu phết mũi 36 4.2 Thảo luận 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CDC : Centers for Disease Control and Prevention cDNA : complementary DNA Ct : threshold cycle dATP : deoxyadenine triphosphate dCTP : deoxycytocine triphosphate dGTP : deoxyguanine triphosphate dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate dTTP : deoxythymidine triphosphate dUTP : deoxyuracil triphosphate DEPC : diethyl pyrocarbonate DNA : deoxyribonucleic acid E% : PCR efficiency Kb : Kilo base KDa : Kilo Dalton ELISA : Enzyme link Immunosorbent Assay mRNA : messenger RNA MV : Measles virus RNA : Ribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction rpm : round per minute RT – PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction UNG : Uracil-DNA Glycosilase SQ : Starting quantity TE : Tris - EDTA Tm : melting temperature TN1 : Thí nghiệm TN2 : Thí nghiệm V : Volume WHO : World Health Organization ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần MV TQ PCR master mix cho 20 PCR mix 24 Bảng 3.2 Thành phần RNAse P TQ master mix cho 20 PCR mix 24 Bảng 4.1 Số lượng copy cDNA ban đầu mẫu chủng vaccine 33 Bảng 4.2 Số lượng copy ban đầu dãy pha loãng chủng vaccine MV 35 Bảng 4.3 Giá trị Ct SQ mẫu thử RNAse P tương ứng mẫu (TN1) 38 Bảng 4.4 Giá trị Ct mẫu thử (tiếp theo) RNAse P tương ứng mẫu 38 x Hình 3.4 Nguyên tắc hoạt động thuốc thử tổng hợp cDNA Phương pháp: Trong tube PCR 0.2ml có chứa sẵn μl NKRT+RTmix ngâm đá, cho vào 15 μl mẫu trích biệt RNA Sau tổng hợp cDNA cách ủ ống phản ứng máy luân nhiệt theo bước sau: Sản phẩm cDNA dùng để thực phản ứng real-time PCR 3.5.3 Thực phản ứng real-time PCR Nguyên tắc: Sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn đặc hiệu dài khoảng 145 bp vùng gene N MV-cDNA Mẫu dò Taqman (đầu 5’ gắn kênh màu huỳnh quang FAM) gắn đặc hiệu vào sản phẩm PCR đích, mồi xi ngược gắn vào DNA đích Taq polymerase tổng hợp mạch từ dNTP tự cắt Taqman probe trình tổng hợp làm phát huỳnh quang, tín hiệu thu nhận lại Ngồi mẫu phết mũi chạy thêm hệ thống RNAse P mix RNAse P thuộc gene người, trình ly trích RNA MV ta ly trích RNA 29 người (trong có RNAse P, RNAse P gọi gene chủ nhà - gene keeping house) RNAse P mix chứa cặp mồi probe đặc hiệu với RNAse P, RNAse P khuếch đại song song với gene N MV (giúp kiểm sốt mẫu thử có đủ khơng, hệ thống tách chiết RNA tốt hay khơng, kiểm sốt có ức chế hay không) Phương pháp - Cho 20 μl MV TQ PCR mix vào low – profile white tube (các tube giữ đá bào hay khay lạnh) Đối với mẫu thử mẫu phết mũi, ta chạy thêm hệ thống RNAse P, cho 20 μl RNAse P mix vào low profile white tube tương ứng khác - Cho μl mẫu cDNA từ bệnh phẩm chứng âm (được tổng hợp từ RNA giai đoạn trên) vào low – profile white tube chứa sẵn PCR mix Mẫu phết mũi việc cho μl cDNA mẫu vào MV TQ mix ta cho thêm μl mẫu vào RNAse P mix tương ứng - Các mẫu chuẩn MV DNA chuẩn: vortex thật mẫu chuẩn cho vào ba tube PCR chứa 20 μl MV TQ mix, tube độ pha loãng MV DNA chuẩn - Chạy real-time PCR: bật máy real time 15 phút trước chạy trương trình luân nhiệt Cho tất tube PCR mix vào buồng ủ nhiệt máy Cài đặt chương trình chạy máy theo chu kỳ nhiệt độ: (Máy chụp hình giai đoạn nhiệt độ 600C) Chọn vị trí giếng mà tube phản ứng đặt vào Đặt tên mẫu Chọn kênh màu huỳnh quang FAM Chọn thể tích phản ứng 25 μl Lưu chương trình chạy máy kết 30 3.5.4 Phân tích kết real time PCR - Giám sát độ nhạy phương pháp nguy ngoại nhiễm - Giám sát xác thao tác pipetting để đánh giá xác kết định lượng qua định đường chuẩn - Định số lượng copies ban đầu có giếng mẫu thử - Đánh giá độ nhạy phương pháp 31 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết 4.1.1 Kết khảo sát chủng vaccine sởi Mẫu chuẩn 1, 2, Mẫu Chứng âm Hình 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu chủng MV vaccine Hình 4.2 Biểu đồ chuẩn mẫu chuẩn mẫu 32 Bảng 4.1 Số lượng copy cDNA ban đầu mẫu chủng vaccine Mẫu C(t) SQ (copies/phản ứng) -2 MV10 28,93 2,63 x 102 MV10 21,55 4,40 x 104 Chứng âm N/A N/A Mẫu chuẩn 20,38 1,00 x 105 Mẫu chuẩn 23,66 1,00 x 104 Mẫu chuẩn 27,02 1,00 x 103 N/A: âm tính (hay ngưỡng phát hiện) Hình 4.1 Các giếng chuẩn có đường biểu diễn khuếch đại dương tính chứng âm đường biểu diễn khuếch đại âm tính (nằm đường nền) Điều chứng tỏ: (1) Quá trình tách chiết khơng bị ngoại nhiễm bị nhiễm chéo mẫu (2) PCR mix đủ nhạy cảm giếng chuẩn có đường khuếch đại vượt qua đường Mẫu có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua đường nền, chứng tỏ PCR mix đủ nhạy để phát chủng virus vaccine mẫu Các thơng số biểu đồ chuẩn (hình 4.2) E = 100% R2 = Quá trình khuếch đại đạt hiệu suất 100%, tức sau chu kỳ số lượng DNA tăng gấp đơi Mức độ tuyến tính đường chuẩn cao (có độ dốc -3,32) Chứng minh phản ứng đạt tối ưu, sẵn sàng thực thí nghiệm Ngồi E R2 chứng tỏ thao tác pippeting xác, đảm bảo xác kết định lượng Mặc dù đề tài có ý nghĩa định lượng tương đối, định lượng xác có ý nghĩa xác định độ nhạy kit, kiểm tra thao tác tiến hành tốt hay không Qua bảng 4.1 hàm lượng chủng vaccine sởi sau hồn ngun độ pha lỗng 100 4,4 x 104 copies thể tích phản ứng, tức 4,4 x 104 x 71 copies virus ml (71 hệ số liên quan đến độ thu hồi sau tách chiết mẫu thể tích mẫu tách chiết), sở để tiến hành để tiến hành thí nghiệm (xác định điểm cuối - endpoint dãy pha loãng MV vaccine thả chủng virus vào mẫu phết mũi để thử độ nhạy kit) 4.1.2 Khảo sát độ nhạy kit dãy pha loãng chủng vaccine sởi Do tiến hành dãy pha loãng nên mẫu chuẩn lấy giảm xuống nồng độ để tín hiệu huỳnh quang mẫu không bị đè xuống 33 Mẫu chuẩn 1, 2, Chứng âm Hình 4.3 Biểu đồ khuếch đại mẫu chuẩn chứng âm Hình 4.4 Biểu đồ chuẩn mẫu chuẩn dãy pha loãng chủng vaccine sởi 34 100 10-1 10-2 10-3 10-4 Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại dãy MV vaccine pha loãng Bảng 4.2 Số lượng copy ban đầu dãy pha loãng chủng vaccine MV Mẫu C(t) SQ (copies/giếng) SQ (copies/ml)* 100 20,54 6,49 x 104 4,61 x 106 10-1 25,1 2,75 x 103 1,95 x 105 10-2 29,77 1,08 x 102 7,67 x 103 -3 10 33,08 1,09 x 10 7,74 x 102 -4 10 36,47 1,04 x 10 7,38 x 101 10-5 N/A N/A N/A -6 10 N/A N/A N/A 10-7 N/A N/A N/A Chứng âm N/A N/A N/A Mẫu chuẩn 23,27 1,00 x 10 7,10 x 105 Mẫu chuẩn 26,5 1,00 x 10 7,10 x 104 Mẫu chuẩn 29,91 1,00 x 102 7,10 x 103 N/A: âm tính hay ngưỡng phát * Được tính tốn theo công thức SQ (copies/ml) = SQ (copies/giếng) x 71, với 71 hệ số thu hồi sau tách chiết mẫu Các giếng chuẩn có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua đường chứng âm đường biểu diễn khuếch đại âm tính (nằm đường nền) (hình 4.3) Qua hình 4.4 hai thơng số E% R2 đạt lý tưởng (E = 100%, R2 = 1), đảm bảo kết định lượng xác Hình 4.5: mẫu có đường biểu diễn khuếch đại cách đều, mẫu dương tính đường biểu diễn khuếch đại vượt qua đường nền, mẫu âm tính (hay ngưỡng phát hiện) đường biểu diễn nằm đường Các mẫu pha loãng theo hệ số 10, qua bảng giá trị ta thấy nồng độ RNA virus thể tích phản ứng 35 giảm theo hệ số 10 (sự tương quan giá trị Ct nồng độ RNA virus tuyến tính từ 104–100 RNA copies/giếng phản ứng), chứng tỏ thao tác ly trích tốt, kit ly trích khuếch đại tốt Qua bảng 4.2 thấy độ pha loãng 10-4 độ pha loãng cuối máy real-time đọc tín hiệu huỳnh quang (tức copy thể tích phản ứng, hay 71 copies 1ml mẫu thử) Như PCR mix đủ nhạy cảm để khuếch đại copy DNA đích giếng phản ứng Nói cách khác độ nhạy kit thử chủng virus copy giếng phản ứng hay 71 copies/ml mẫu thử 1.1.3 Kết khảo sát độ nhạy kit mẫu phết mũi Mẫu dương tính Mẫu âm tính chứng âm Hình 4.6 Đường biểu diễn khếch đại số mẫu phết mũi Hình 4.7 Biểu đồ chuẩn mẫu chuẩn mẫu thử (TN1) 36 Mẫu chuẩn 1, 2, RNAse P mẫu Mẫu âm tính Hình 4.8 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu âm tính RNAse P mẫu Mẫu chuẩn 1, 2, RNAse P mẫu Mẫu dương tính Hình 4.9 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu dương tính RNAse P mẫu (TN1) 37 Bảng 4.3 Giá trị Ct SQ mẫu thử RNAse P tương ứng mẫu (TN1) Mẫu Độ pha loãng C(t) MV 10-5 10-1 -5 10 -4 N/A SQ (copies/giếng) MV - cDNA N/A C(t) RNAse P 35,32 23,64 7,52 x 103 37,12 N/A N/A 34,52 35,61 29,58 1,88 x 10 1,23 x 102 34,24 36,11 chứng âm N/A 38,21 Mẫu chuẩn 23,21 N/A 1,00 x 104 Mẫu chuẩn 26,59 1,00 x 103 10 10-2 1,00 x 102 Standartd 29,85 N/A: âm tính hay ngưỡng phát Bảng 4.4 Giá trị Ct mẫu thử (tiếp theo) RNAse P tương ứng mẫu Mẫu Độ pha C(t) MV SQ (copies/giếng) C(t) RNAse P loãng MV - cDNA 10-3 33,95 5,42 x 100 34,86 -4 10 35,76 1,55 x 10 34,12 10-2 27,44 4,91 x 102 N/A 10 11 12 Chứng âm 10-4 10-1 37,48 22,35 N/A 4,69 x 10-1 9,42 x 103 N/A 35,02 37,47 35,44 Mẫu chuẩn 23,07 1,00 x 104 Mẫu chuẩn 26,47 1,00 x 103 1,00 x 102 Mẫu chuẩn 29,71 N/A: âm tính hay ngưỡng phát Các giếng chuẩn có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua đường chứng âm đường biểu diễn khuếch đại âm tính (nằm đường nền), chứng minh trình tách chiết khuếch đại khơng bị ngoại nhiễm (Hình 4.6) Qua biểu đồ chuẩn, thơng số E% R2 đạt yêu cầu Đảm bảo định lượng xác để xác định độ nhạy kit xác Đối với chứng âm mẫu âm tính: mẫu âm tính mẫu chọn vào giếng mẫu thấy đường biểu diễn nằm đường nền, tiếp tục chọn vào giếng chạy 38 RNAse P mix tương ứng thấy có đường biểu diễn vượt qua đường (hình 4.8) Nếu mẫu âm tính có đường biểu diễn khuếch đại RNAse P nằm đường chứng tỏ PCR bị ức chế (mẫu có chất ức chế làm ức chế phản ứng PCR, ly trích khơng tốt làm RNA nguyên nhân làm RNAse P có đường biểu diễn khuếch đại âm tính) Đối với mẫu dương tính, đường biểu diễn khuếch đại vượt qua đường nền, chọn giếng chạy RNAse P tương ứng có thêm đường biểu diễn RNAse P vượt qua đường (hình 4.9) Tất mẫu có đường biểu diễn RNAse P dương tính trừ mẫu số Mẫu 9, ly trích RNA (mẫu có đường biểu diễn khuếch đại, Ct = 27,44, SQ = 4,91 x 102) nhiên RNAse P đường biểu diễn khuếch đại âm tính Chứng tỏ q trình lấy mẫu khơng lấy tế bào người Do tiến hành thí nghiệm thả chủng virus vaccine vào, nên ly trích RNA MV, RNA người khơng có, RNAse P khơng có Như hệ thống RNAse P hoạt động tốt mẫu phết mũi Trong 12 mẫu thử có mẫu sử dụng làm chứng âm, mẫu dương tính mẫu ngưỡng phát (phù hợp với nồng độ chủng vaccine đưa vào mẫu phết mũi) Qua bảng giá trị ta thấy hầu hết mẫu có giá trị SQ phù hợp với độ pha loãng mẫu Riêng mẫu số độ pha lỗng 10-3 có SQ = 5,42 copies /giếng phản ứng, so với nồng độ virus đưa vào (từ 101 đến