CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI MEASLES VIRUS – MV BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ QUẾ

Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 7/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN VIRUS SỞI (MEASLES VIRUS – MV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

9 Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức, dạy dỗ tôi trong suốt bốn năm qua

9 Thầy Phạm Hùng Vân đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài cả về mặt lý thuyết lẫn phương pháp tiến hành

9 Các anh chị trong công ty Nam Khoa đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ dẫn thao tác cho tôi

9 Gia đình cô Đông đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về chỗ ở trong suốt quá trình thực tập

9 Toàn thể các bạn lớp DH06SH trường đại học Nông Lâm đã ủng hộ, giúp đỡ tôi

về mặt vật chất và tinh thần

9 Cuối cùng con xin chân thành cảm ơn cha mẹ, đấng sinh thành nuôi nấng dạy

dỗ con cũng như luôn bên con, động viên con mỗi lúc gặp khó khăn

N gene, chỉ ra rằng bộ kit có độ nhạy cao cho virus sởi: giới hạn phát hiện của bộ kit gần như là 1 copy MV-cDNA/phản ứng Sự tương quan giữa giá trị Ct và nồng độ RNA virus tuyến tính từ 104–100 RNA copies/giếng phản ứng, và mức độ biến động trong thí nghiệm là thấp Hơn nữa, những mẫu phết mũi âm tính được chứng minh thực sự là âm tính nhờ sử dụng chứng nội tại RNAse P (gene chủ nhà) Kết quả chứng minh bộ kit có khả năng phát hiện virus sởi, đạt yêu cầu

SUMMARY

Topic title “Detecting meseasle virus by real-time PCR”

As measles control and elimination campaigns progress, laboratory confirmation of clinically diagnosed measles cases becomes increasingly important A real-time PCR assay for measles virus was designed for testing nasopharyngeal aspirate (NPA) samples In this study we used dilution series of live-attenuated MV Schawarz vaccine and NAP samples (collected from normal people and spiked known quantities of MV vaccine) to check the sensitivity of the test Extraction of RNA from these samples and then reverse transcription and MV-N gene ampication and calculation of virus genome number in these samples, by comparison with a standard curve prepared from dilutions of clone MV-N gene, indicated that the test was highly sensitive for measles virus: the limits of detection were determined to be

approximately 1 copy for each target RNA/reaction The relationship between Ct

values and RNA concentration was linear within a range of 104–100 RNA copies/reaction, and intra- and inter-assay variability was low Furthermore, negative NPA samples were illustrated actually negative by using RNAse P internal control (gene keeping house) These results demonstrate that the kit is useful for rapid diagnosing measles and meets the qualitive control

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.2.1 Mục tiêu chung 1

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Nội dung thí nghiệm 2

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Bệnh sởi 3

2.1.1 Lịch sử bệnh sởi 3

2.1.2 Giới thiệu bệnh sởi 4

2.1.2.1 Khái niệm bệnh sởi 4

2.1.2.2 Biểu hiện lâm sàng 4

2.1.2.3 Biến chứng 5

2.1.2.4 Đường truyền lây 5

2.1.2.5 Miễn dịch 5

2.1.2.6 Điều trị bệnh sởi 6

2.1.2.7 Phòng ngừa 6

2.1.3 Tình hình bệnh sởi trên thế giới 6

2.1.4 Tình hình bệnh sởi ở Việt Nam 6

2.2 Virus sởi (Measles virus – MV) 7

2.2.1 Phân loại, hình thái học và cấu trúc 7

2.2.2 Vai trò của các protein của MV 7

2.2.3 Quá trình sao chép của MV (replication) 8

2.2.4 Thụ thể (receptor) của MV 9

2.2.5 Sức chống chịu của MV 9

2.2.6 Loài cảm nhiễm 9

2.2.7 Cơ chế sinh bệnh của MV 9

2.2.8 Giới thiệu về gene N của MV 10

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sởi 10

2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 10

2.3.2 Xét nghiệm cơ bản 10

2.3.3 Phân lập và định danh virus 11

2.3.4 Huyết thanh học 11

2.3.5 ELISA gián tiếp 11

2.3.6 Phương pháp RT-PCR 12

2.4 Phương pháp real-time PCR 12

2.4.1 Phương pháp PCR 12

2.4.1.1 Nguyên lý 12

2.4.1.2 Thành phần phản ứng PCR 12

2.4.1.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12

2.4.1.4 Tối ưu hóa PCR 13

2.4.2 RT - PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 13

2.5.7 Real-time PCR 14

2.5.7.1 Máy real-time PCR 15

2.5.7.2 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR (amplification graph) 15

2.5.7.3 Biểu đồ chuẩn của real-time PCR 16

2.5.4 Hóa chất và thuốc thử cho real-time PCR 18

2.5.4.1 Real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn 18

2.5.4.2 Real-time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 18

2.5.4.3 Real-time PCR sử dụng Molecular Beacon probe 20

2.5.5 Phân tích dữ liệu Real-time PCR 21

2.5.5.1 Định lượng tuyệt đối 21

2.5.5.2 Định lượng tương đối 21

2.6 Loại trừ nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 23

3.2 Vật liệu 23

3.2.1 Mẫu 23

3.2.2 Hóa chất 23

3.2.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết RNA 23

3.2.2.2 Hóa chất tổng hợp cDNA 23

3.2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng real – time PCR 23

3.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 24

3.3.1 Dụng cụ và thiết bị dùng cho ly trích RNA 24

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị dùng cho tổng hợp cDNA 25

3.3.3 Dụng cụ và thiết bị dùng cho Real – time PCR 25

3.4 Phương pháp xác định và đánh giá độ nhạy của quy trình 25

3.5 Phương pháp thí nghiệm 26

3.5.1 Ly trích RNA toàn phần 26

3.5.1.1 Xử lý mẫu 26

3.5.1.2 Ly trích RNA 28

3.5.2 Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên 28

3.5.3 Thực hiện phản ứng real-time PCR 29

3.5.4 Phân tích kết quả real time PCR 31

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả 32

4.1.1 Kết quả khảo sát trên chủng vaccine sởi 32

4.1.2 Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên dãy pha loãng chủng vaccine sởi 33

4.1.3 Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên mẫu phết mũi 36

4.2 Thảo luận 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

RT – PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần của MV TQ PCR master mix cho 20 PCR mix 24

Bảng 3.2 Thành phần của RNAse P TQ master mix cho 20 PCR mix 24

Bảng 4.1 Số lượng copy cDNA ban đầu của mẫu chủng vaccine 33

Bảng 4.2 Số lượng copy ban đầu của dãy pha loãng chủng vaccine MV 35

Bảng 4.3 Giá trị Ct và SQ của 6 mẫu thử cùng RNAse P tương ứng của mẫu (TN1) 38

Bảng 4.4 Giá trị Ct của 6 mẫu thử (tiếp theo) cùng RNAse P tương ứng của mẫu 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh sởi 4

Hình 2.2 Cấu trúc measles virus (MV) và cơ chế nhân lên của MV 8

Hình 2.3 Máy real – time PCR 15

Hình 2.4 Biểu đồ khuếch đại real – time PCR 16

Hình 2.5 Biểu đồ chuẩn 17

Hình 2.6 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe 19

Hình 2.7 Cơ chế phát huỳnh quang của Molecular Beacon probe 20

Hình 3.1 Cách pha loãng MV vaccine 27

Hình 3.2 Cách lấy mẫu phết mũi 27

Hình 3.3 Tạo mẫu giả lập 27

Hình 3.4 Nguyên tắc hoạt động của bộ thuốc thử tổng hợp cDNA 29

Hình 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu chủng MV vaccine 32

Hình 4.2 Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và mẫu 32

Hình 4.3 Biểu đồ khuếch đại của các mẫu chuẩn và chứng âm 34

Hình 4.4: Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và dãy pha loãng của chủng vaccine sởi 34

Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại của dãy MV vaccine pha loãng 35

Hình 4.6 Đường biểu diễn khếch đại của một số mẫu phết mũi (TN1) 36

Hình 4.7 Biểu đồ chuẩn của các mẫu chuẩn và các mẫu thử (TN1) 36

Hình 4.8 Đường biểu diễn khuếch đại của mẫu âm tính và RNAse P của mẫu 37

Hình 4.9 Đường biểu diễn khuếch đại của mẫu dương tính và RNAse P của mẫu 37

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sởi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên cái chết của trẻ em toàn cầu Trên thế giới có khoảng 20 triệu trường hợp mắc bệnh sởi mỗi năm Ước tính vào năm 2008 có 164000 người chết vì bệnh sởi và hầu hết là trẻ em dưới năm tuổi (WHO) Từ vài chục năm nay bệnh sởi ít xảy ra ở những quốc gia phát triển, nhưng vẫn còn là một ám ảnh kinh hoàng đối với người dân các nước đang phát triển Bệnh rất dễ lây và dễ dàng lan ra từ những người đi du lịch, 90% những người tiếp xúc với bệnh nhân sẽ bị lây nếu chưa chích ngừa Sự nguy hiểm của bệnh sởi là khả năng biến chứng của bệnh: viêm não, viêm tai giữa, viêm phổi, gây sảy thai… tình trạng nặng có thể dẫn đến hôn mê và chết

Việc chẩn đoán sớm bệnh sởi có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc tránh sự lây lan cũng như loại bỏ bệnh sởi Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh sởi như chẩn đoán lâm sàng, ELISA, phân lập và định danh virus, PCR, real-time PCR… Tuy chẩn đoán lâm sàng và ELISA được áp dụng phổ biến nhưng chỉ phát hiện được bệnh sởi ở giai đoạn muộn khi ban đã xuất hiện Phân lập virus có thể dùng phát hiện virus sởi nhưng cần thời gian dài, khó và tỷ lệ thành công thấp Virus sởi có thể được phát hiện bằng PCR trước khi kháng thể IgM xuất hiện Khả năng phát hiện virus sởi bằng real-time PCR trong nhiều loại mẫu như nước tiểu, dịch phết khoang miệng, mẫu phết mũi…không chỉ đơn giản mà còn có khả năng phát hiện virus trước khi có ban xuất hiện, điều này rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, ngăn chặn cũng như loại bỏ dịch sởi

Chính vì những ưu điểm vượt trội nhanh, đặc hiệu và chính xác của real-time PCR đây là cách tiếp cận đầy tiềm năng, hỗ trợ cho công tác chẩn đoán, điều trị của bác sĩ (đặc biệt trong những trường hợp thể không điển hình) cũng như phòng và dập tắt dịch

Từ thực tế nêu trên tôi thực hiện đề tài: “Chẩn đoán virus sởi (measles virus - MV) bằng phương pháp real-time PCR”

1.2 Mục tiêu đề tài

1.2.1 Mục tiêu chung

- Đánh giá độ nhạy bộ kit phát hiện virus sởi

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên chủng vaccine sởi

- Khảo sát độ nhạy của bộ kit trên mẫu phết mũi pha lẫn chủng vaccine sởi

1.3 Nội dung thí nghiệm

- Tiến hành ly trích MV – RNA

- Thực hiện phản ứng RT – PCR chuyển MV - RNA thành cDNA

- Thực hiện phản ứng real –time PCR

- Phân tích kết quả, đánh giá độ nhạy của bộ kit

Năm 1670, Thomas Sydenham (1624-1689) phân biệt rõ ràng bệnh sởi và bệnh đậu mùa, hai biến chứng của bệnh sởi là viêm loét hoại tử miệng và viêm não Cùng lúc Mauriceau bác bỏ thuyết ban sởi có nguồn gốc từ máu kinh nguyệt mẹ và thuyết cho rằng sởi là một bệnh truyền nhiễm được chấp nhận rộng rãi Năm 1758, Francis Home lấy máu của một đứa trẻ bị sởi lây cho đứa khác Ông thành công 8 trên 10 trẻ, chứng minh được sự hiện diện của một yếu tố lây nhiễm trong máu mà ông không biết

có bản chất virus

Năm 1846, Panum điều tra một vụ dịch sởi xảy ra tại quần đảo Faroe (Đan Mạch) Tại Faroe, bệnh sởi đã vắng bóng 65 năm Một thợ mộc vốn đã mắc sởi tại Copenhague (chưa có dấu hiệu bệnh sởi) trở về Faroe Chuyến đi khá dài để bệnh xuất hiện, nhưng cũng không đủ dài để anh ta hồi phục và ngưng thải tiết virus Đến nơi, anh ta lây bệnh cho hai người bạn, từ đó bệnh lan ra thành dịch Trong một thời gian ngắn, trên 6000 người trong tổng số 7782 toàn bộ dân cư bị tấn công Nhà nào cũng có người mắc bệnh, và chỉ những ai đã từng mắc bệnh sởi 65 năm trước đó mới không bị mắc bệnh Từ vụ dịch tại Faroe, Panum đưa ra bốn nhận xét: (1) Ban sởi xuất hiện từ

12 - 14 ngày sau khi tiếp xúc (2) Bệnh lây cao nhất vào cuối giai đọan tiền triệu (3 - 4 ngày trước khi ban xuất hiện) (3) Bệnh lây truyền qua những giọt dịch tiết hô hấp (qua

ho, hắt hơi) (4) Sau khi bị sởi, cả đời sẽ không bị mắc bệnh trở lại

Năm 1910, Ludvig Hektoen phát hiện ra virus sởi Năm 1954, tại Mỹ, Enders

và Peebles phân lập được virus sởi từ một cậu bé 11 tuổi mắc bệnh sởi và nuôi cấy thành công trên môi trường cấy mô phôi gà Năm 1963, vaccin sởi sống và chết được

đưa ra sử dụng tại Mỹ (Axton, 1979)

2.1.2 Giới thiệu bệnh sởi

2.1.2.1 Khái niệm bệnh sởi

Bệnh sởi theo tiếng Anh là measles, hoặc rubeola, tiếng Pháp là rougeole Từ measles có nguồn gốc từ tiếng Đức "masern", đi từ tiếng Bắc Phạn (Sanskrit)

“masura”, có nghĩa là "đốm”

Bệnh sởi là bệnh truyền nhiễm gây dịch lây qua đường hô hấp do virus sởi gây nên Trước đây bệnh sởi chủ yếu gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi, hay xảy ra vào mùa đông xuân Hiện nay bệnh có thể xuất hiện ở người lớn do chưa được tiêm phòng hoặc đã tiêm phòng nhưng chưa được tiêm nhắc lại Bệnh có biểu hiện đặc trưng là sốt, viêm long và phát ban, có thể dẫn đến nhiều biến chứng như tiêu chảy, viêm phổi, viêm giác mạc, thậm chí có thể viêm não dễ dẫn đến tử vong (Bộ Y Tế, 2009)

2.1.2.2 Biểu hiện lâm sàng (Bộ Y Tế, 2009)

a Thể điển hình

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh sởi. (a) hạt Koplik trên niêm mạc miệng (b) ban sởi

xuất hiện với những nốt đỏ; (c) viêm kết mạc do sởi

(http://www.cdc.gov/measles/about/photos.html)

Giai đoạn ủ bệnh: 10 - 14 ngày

Giai đoạn khởi phát: 2 - 4 ngày Bệnh nhân sốt cao, viêm long đường hô hấp trên và viêm kết mạc, đôi khi có viêm thanh quản cấp, có thể thấy hạt Koplik là các hạt nhỏ 0,5 - 1 mm màu trắng có quầng ban đỏ ở trên niêm mạc miệng

Giai đoạn toàn phát: kéo dài 2 - 5 ngày Thường sau khi sốt cao 3 - 4 ngày bệnh nhân bắt đầu phát ban, xuất hiện từ sau tai, sau gáy, trán, mặt, cổ dần lan đến thân

mình và tứ chi, cả ở lòng bàn tay và gan bàn chân, ban hồng dát sẩn, khi căng da thì ban biến mất Khi ban mọc hết toàn thân thì thân nhiệt giảm dần

Giai đoạn hồi phục: ban nhạt dần rồi chuyển sang màu xám, bong vảy phấn sẫm màu Nếu không xuất hiện biến chứng thì bệnh tự khỏi Có thể có ho kéo dài 1 - 2 tuần sau khi hết ban

b Thể không điển hình

Bệnh nhân AIDS, hội chứng thận hư, điều trị thuốc ức chế miễn dịch ban có thể không điển hình Biểu hiện lâm sàng có thể sốt nhẹ thoáng qua, viêm long nhẹ và phát ban ít, toàn trạng tốt Thể này dễ bị bỏ qua, dẫn đến lây lan bệnh mà không biết Bệnh nhân cũng có thể sốt cao liên tục, phát ban không điển hình, phù nề tứ chi, đau mỏi toàn

thân, thường có viêm phổi nặng kèm theo Xét nghiệm có thể có tăng men gan

2.1.2.3 Biến chứng

Tình trạng dinh dưỡng kém làm giảm cơ chế bảo vệ của cơ thể, làm suy giảm miễn dịch, cho nên khi bị sởi thì nguy cơ bị các biến chứng nặng sẽ cao hơn trẻ có chức năng miễn dịch bình thường

Biến chứng thần kinh: viêm màng não cấp tính, thường xuất hiện khi bệnh vào giai đoạn hồi phục Biểu hiện lâm sàng có thể sốt lại, đau đầu, cứng gáy, co giật và thay đổi ý thức từ lú lẫn, ngủ gà tới hôn mê Ngoài ra có thể có rung giật cơ, múa giật

và các dấu hiệu viêm tuỷ như liệt hai chi dưới, liệt tứ chi, mất cảm giác, rối loạn cơ Ngoài ra còn có thể viêm não sau khi mắc sởi nhiều năm

Biến chứng bội nhiễm hay gặp ở trẻ em Sau khi ban bay bệnh nhân sốt lại, có tình trạng nhiễm trùng, bạch cầu máu ngoại vi tăng Có thể gặp bội nhiễm ở các bộ phận sau: viêm tai giữa, viêm thanh quản, viêm phế quản phổi, viêm phổi, lao tiến triển, viêm loét hoại tử miệng, tiêu chảy, viêm kết - giác mạc, viêm cơ tim

Phụ nữ mang thai bị sởi có thể bị sảy thai, thai chết lưu, đẻ non hoặc thai nhiễm sởi

tiên phát (Bộ Y Tế, 2009)

2.1.2.4 Đường truyền lây

Người bệnh phát tán virus mạnh nhất là vào giai đoạn tiền triệu (giai đoạn khởi

phát) thông qua các hạt nhỏ bắn ra khi ho, khi nói chuyện hoặc khi tiếp xúc (Butel, 2004) 2.1.2.5 Miễn dịch

Miễn dịch sau khi bị mắc sởi thường kéo dài suốt đời Còn miễn dịch chủ động sau khi tiêm vaccin sởi cũng kéo dài trong nhiều năm, và đa số có thể kéo dài cả đời

Miễn dịch qua trung gian tế bào có cũng có vai trò ngăn ngừa bị sởi tái diễn, vì bệnh nhân mắc chứng thiếu globuline-máu (miễn dịch dịch thể giảm nhưng miễn dịch tế bào còn nguyên vẹn) sẽ không bị mắc sởi nhiều lần

2.1.2.7 Phòng ngừa bệnh sởi

Phòng bệnh sởi bằng vaccine: Biện pháp phòng bệnh sởi tốt nhất là tiêm chủng đầy đủ 2 liều vaccine sởi Thường vaccine ở dạng MMR (vaccine đa giá) phòng bệnh sởi, quai bị, ban Đức

2.1.3 Tình hình bệnh sởi trên thế giới

Sởi vẫn còn là dịch bệnh phổ biến ở cả các nước đang phát triển cũng như các nước phát triển Năm 2009, Châu Phi báo cáo có nhiều trường hợp mắc sởi Ở Nam Phi dịch sởi vẫn đang hoành hành, có hơn 9000 trường hợp mắc sởi từ 1/2009 đến 3/2010, nguyên nhân chính bắt nguồn từ tỉnh Gauteng (CDC) Từ 1 - 2/2010 Tại Philipines hơn 1300 trường hợp mắc sởi (gồm 5 ca tử vong) Dịch sởi xảy ra tại thủ đô Manila và 10 vùng khác của Philipines (CDC)

2.1.4 Tình hình bệnh sởi ở Việt Nam

Trước đây bệnh sởi xảy ra rất thường xuyên và có tỷ lệ lây nhiễm và tử vong rất cao nhưng hiện nay không còn phổ biến nhờ vào chương trình tiêm chủng mở rộng Năm 2004 tỉ lệ bệnh sởi đã giảm đến 573 lần so với trước năm 1985 Tuy hàng năm, trên cả nước ghi nhận từ 1500 - 2000 trường hợp mắc sởi rải rác, chủ yếu tại các tỉnh phía Bắc vào mùa đông, xuân, nhưng các quan chức thẩm quyền cho rằng căn bệnh này đang được khống chế tốt và dự kiến sẽ bị loại trừ vào năm 2010 Tuy nhiên cuối năm 2008 đến 2009, số ca mắc sởi tăng đột biến Tính đến ngày 9/2/2009 dịch sởi đã xảy ra tại 11 tỉnh miền Bắc với 370 trường hợp phát ban dạng sởi và tại các bệnh viện nhiệt đới và truyền nhiễm quốc gia ngày 3/2/2009, có 340 trường hợp ở Hà Nội và các tỉnh lân cận bị sốt phát ban vào viện, 147 người trong số này dương tính với bệnh sởi

Trong đó có 8 ca nặng biến chứng viêm não, viêm màng não thể nặng, hôn mê sâu, rối loạn tim, 3 người phải cho thở máy Bệnh nhân chủ yếu ở độ tuổi từ 20 - 30 Điều bất thường nhất là tỉ suất biến chủng viêm não và viêm màng não quá cao (8/147 tức là 54/1000 trong khi đó tỉ suất biến chứng viêm não ở trẻ em theo lý thuyết là 1/1000 ca) Người dân thì xôn xao phân vân không biết có cần phải đi tiêm chủng hay không, còn chính phủ chỉ đạo các ngành, địa phương khẩn cấp khai triển các biện pháp ngăn chặn dịch lan rộng

2.2 Virus sởi (Measles virus – MV)

2.2.1 Phân loại, hình thái học và cấu trúc

Virus sởi (measles virus - MV), thuộc chi Morbilivirus, họ Paramyxoviridae

Đường kính một hạt virus từ 120 - >300 nm MV là virus RNA chuỗi âm, gồm 15984 nucleotides, đóng gói trong nucleoside xoắn (Kulik và ctv, 2008) Sự sắp xếp bộ gene của MV: 3’N, P/V/C, M, F, HA, L5’ mã hóa lần lượt các protein: nucleoprotein (N), phosphoprotein (P)/C protein/V protein, matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin protein (H), large polymerase protein (L)

MV chỉ có một type kháng nguyên duy nhất MV có 23 genotypes (A, B1 - B3, C1 - C2, D1 - D10, E, F, G1 - G3 và H1 - H2) đã được xác định, 5 số trong đó (B1, D1, E, F và G1) được xem là bất hoạt do không được phát hiện từ nhiều năm qua (Griffin và Oldstone, 2008)

2.2.2 Vai trò của các protein của MV

H (60 KDa) chịu trách nhiệm cho sự tấn công lên thụ thể tế bào chứa neuraminic acid (MV thiếu hoạt động neuramidase) F có vai trò trong việc hòa màng virus và màng tế bào chủ, làm cho virus có thể xâm nhiễm vào tế bào (F được phân cắt thành F1 - 40KDa và F2 - 20 KDa bởi protease của tế bào) M (37 KDa) nằm dưới lớp màng của virus, liên quan đến quá trình lắp ráp, đóng gói và nảy chồi của virus N (60 KDa) liên quan đến RNA bộ gene, hình thành cấu trúc nucleocapsid bảo vệ RNA khỏi

sự phân giải của RNAse

Những protein có liên quan khác: P (70 KDa) gắn với protein N (60 KDa) và L (250 KDa) hình thành nên cấu trúc phức tạp của RNA polymerase, giúp cho quá trình sao chép RNA của virus Protein V (46 KDa) và C (21 KDa) chức năng chưa rõ (có thể liên quan đến sự sao chép của virus)

2.2.3 Quá trình sao chép của MV (replication)

Hình 2.2 Cấu trúc measles virus (MV) và cơ chế nhân lên của MV (a) Cấu trúc measles virus (b) Sự sắp xếp bộ gene của MV (c) Cơ chế xâm nhập và sinh sản của MV (http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n12/box/nrmicro1550 _BX1.html)

Quá trình sao chép và tái bản RNA xảy ra trong tế bào chất của tế bào ký chủ

(1) Giai đoạn bám của virus trên bề mặt tế bào

Virus bám vào thụ thể tế bào nhờ H protein

(2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào

Vỏ virus hòa màng với màng tế bào nhờ hoạt động của F protein (F được phân cắt thành F1 và F2) Tại pH trung tính hoặc kiềm của tế bào chất, virus giải phóng

nucleocapsid và polymerase protein

(3) Quá trình tái bản RNA của virus

Từ RNA chuỗi âm polymerase virus phiên mã tạo ra RNA chuỗi dương hoàn chỉnh, và đây sẽ là khuôn mẫu để tổng hợp các RNA chuỗi âm, tạo nên bộ genome

của thế hệ virus mới

(4) Tổng hợp protein

mRNA được dịch mã tạo protein của virus (H, F, M, N, P, L, V, C) Các protein H,

F và M được chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ của hạt virus mới

(5) Đóng gói hạt virus

Nucleocapsid (gồm N, P, L và RNA chuỗi âm của bộ gene) được lắp ráp trong

tế bào chất và di chuyển đến màng tế bào, nơi các protein H, F, M đang tập kết để

đóng gói hình thành hạt virus

(6) Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào

M nằm dưới lớp màng và giúp cho quá trình nảy chồi (budding) của virus

người dễ cảm thụ (Butel, 2004)

2.2.7 Cơ chế sinh bệnh của MV

Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và nhân lên tại đây, sau đó nhiễm vào mô lympho lân cận rồi tiếp tục nhân lên Nhiễm virus máu lần đầu sẽ phát tán virus đi khắp nơi, virus sau đó sẽ nhân lên trong hệ thống lưới nội mô Cuối cùng, nhiễm virus máu thứ phát sẽ giúp virus lan tới các biểu mô bề mặt cơ thể, bao gồm da đường hô hấp và kết mạc, tại đó xuất hiện các ổ tăng sinh virus MV có thể nhân lên ở một số tế bào lymphô, từ đó lại phát tán khắp cơ thể Các tế bào khổng lồ đa nhân thường có ở trong mô lymphô của khắp cơ thể (hạch lymphô, amygdale, ruột thừa) Các quá trình trên diễn ra trong thời kỳ ủ bệnh (kéo dài trung bình 9 - 11 ngày)

Trong suốt thời kỳ tiền triệu, diễn ra từ 2 - 4 ngày, virus có ở nước mắt, dịch tiết mũi họng, nước tiểu và máu

Nốt ban sẩn điển hình xuất hiện vào khoảng ngày thứ 14 ngay khi phát hiện được kháng thể tuần hoàn, không còn virus trong máu và hết sốt Nốt ban sẩn xuất hiện là kết quả tương tác của tế bào miễn dịch T với tế bào nhiễm virus trong các tĩnh mạch nhỏ, tồn tại khoảng 1 tuần (Ở những bệnh nhân bị khiếm khuyết miễn dịch qua

trung gian tế bào, thường không xuất hiện các nốt sẩn) (Butel, 2004)

2.2.8 Giới thiệu về gene N của MV

Gene N (bắt đầu từ nucleotide 56 - 1744), có khung đọc mở (Open Reading Frame, ORF) bắt đầu từ nucleotide 108 – 1682 (525 codon), mã hóa N protein Chỉ có một promoter trong bộ gene của MV tại vị trí đầu cuối 3’ của bộ gene, khi mã hóa mRNA thì mRNA của gene N là được tổng hợp nhiều nhất, còn mRNA của gene L là

ít nhất Chính vì vậy khi xâm nhiễm vào tế bào, kháng thể đầu tiên và nhiều nhất được sinh ra là kháng thể chống lại protein N

Sự đa dạng của gene N: Đầu C tận cùng (456 nucleotide) của gene N là vùng biến đổi nhiều nhất của bộ gene MV, và đã được chứng minh là thích hợp cho việc phân biệt những dòng khác nhau Xác định genotype của MV có thể dựa trên việc giải trình tự gene N của MV (thiết kế một đoạn chứa đầu C tận cùng thuộc gene N, khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu, rồi tiến hành giải trình tự) Từ kết quả có được ta có thể biết được vùng dịch sởi đang xảy ra có nguồn gốc ở đâu, thuộc dòng nào, điều này có

ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát bệnh sởi

Trong chẩn đoán bệnh sởi bằng phương pháp RT- PCR, ta có thể lựa chọn nhiều vùng trên bộ gene như: gene N, gene H, gene M…để phát hiện MV với độ đặc hiệu và nhạy rất cao

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sởi

2.3.3 Phân lập và định danh virus

Bệnh phẩm thích hợp nhất để phân lập virus là phết mũi họng và cấy máu của bệnh nhân từ 2 - 3 ngày trước khi có triệu chứng đến một ngày sau khi có phát ban (chủ yếu là trong giai đoạn sốt) Các loại tế bào thích hợp nhất để phân lập virus sởi là

tế bào thận khỉ hoặc thận người hoặc tế bào Hep-2 Virus sởi tăng trưởng chậm; hiệu ứng huỷ hoại tế bào điển hình (tế bào khổng lồ đa nhân chứa thể vùi ở bào tương và nhân) cần 7 - 10 ngày mới xuất hiện Tuy nhiên, có thể tiến hành chẩn đoán nhanh trong vòng 2 - 3 ngày bằng nuôi cấy virus trong ống nghiệm Sử dụng miễn dịch

huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên MV trong canh cấy (Butel, 2004)

Ưu điểm: là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo

Sử dụng chủ yếu cho các phòng thí nghiệm tham chiếu

Nhược điểm: chậm, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề kỹ thuật cao

2.3.4 Huyết thanh học

Lấy máu kể từ ngày thứ ba sau khi phát ban tìm kháng thể IgM Những nơi chỉ làm được IgG thì lấy máu ở giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục để xác định hiệu giá kháng thể Hiệu giá kháng thể lần hai cao gấp ít nhất bốn lần so với lần đầu Có thể dùng phương pháp ELISA, HI và trung hòa để tìm kháng thể kháng MV (Bộ Y Tế, 2009)

2.3.5 ELISA gián tiếp

Nguyên tắc: Kháng nguyên của MV được phủ trên bề mặt rắn trong giếng

Huyết thanh của bệnh nhân và đối chứng được cho vào các giếng Kháng thể IgM

(hoặc IgG) kháng MV hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng nguyên của MV Sau khi rửa để lấy thành phần không chuyên biệt ra ngoài, kháng thể thứ hai được gắn với enzyme (kháng thể này đặc hiệu với kháng thể IgM hoặc IgG kháng MV) được cho vào giếng sẽ gắn vào kháng thể IgM hoặc IgG Rửa thêm lần nữa, bổ sung cơ chất (không màu) enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất, có sự hiện màu Nếu không có sự hiện diện kháng thể IgM hoặc IgG kháng MV trong mẫu thì kháng thể thứ hai bị rửa trôi trong quá trình rửa và không có sự hiện màu khi bổ sung cơ chất

Ưu điểm: Nhanh, nhạy, ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh trên diện rộng Nhược điểm: Tính đặc hiệu chưa cao Phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn sau khi

đã xuất hiện kháng thể

2.3.6 Phương pháp RT-PCR

Là kỹ thuật invitro để khuếch đại trình tự gene đích của MV nhờ sử dụng các

mồi nucleotide Sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ điện di trên gel agarose Đây

là phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác, đặc hiệu

2.4 Phương pháp real-time PCR

2.4.1 Phương pháp PCR

PCR (polymerase chain reaction) là phản ứng chuỗi trùng hợp nhân bội số lượng một phân đoạn DNA nào đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu đến hàng tỷ lần so với số lượng ban đầu (Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008)

Ưu điểm: nhạy, nhanh, đặc hiệu

Nhược điểm: vấn đề ngoại nhiễm trong khâu diện di, hóa chất độc hại (ethidium bromide có khả năng gây ưng thư)

(1) Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có

hoạt tính tối đa ở 720C, bền với nhiệt độ (2) 4 loại dNTP là dATP, dTTP, dGTP, dCTP (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng (4) Mồi: mồi xuôi và mồi ngược (3) ion Mg2+ (4) Dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng

2.4.1.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính (Denaturation): biến tính mẫu bằng cách nâng nhiệt độ lên

94 - 950C (30 giây – 1 phút), liên kết hydro trong mạch đôi DNA bị phá vỡ, mạch đôi

DNA tách thành hai mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp (Annealing): hỗn hợp được làm lạnh dần đến 55 - 650C các đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích

Giai đoạn kéo dài (Elongation – Extension): Nhiệt độ được nâng lên 72oC, là

nhiệt độ tối ưu cho chức năng xúc tác của Taq polymerse để kéo dài các mạch DNA

Sự sinh tổng hợp bắt đầu ở đầu 3’OH của mỗi đoạn mồi

Kết quả cuối cùng một đoạn DNA đích được khuếch đại lên rất nhiều lần Tổng

số khuếch đại = m x 2n , trong đó

n: số chu kỳ m: số bản sao của đoạn DNA đích Phát hiện sản phẩm PCR: điện di sản phẩm PCR trên gel agarose chứa 0.4 - 4% ethidium bromide Các đoạn DNA có kích thước khác nhau phân tách thành các băng khác nhau trên gel có thể nhìn thấy được dưới tia cực tím

2.4.1.4 Tối ưu hóa PCR

Khuôn DNA: PCR cho kết quả tốt với đoạn DNA cần khuếch đại có kích thước

<1,5 Kb (nếu kích thước trình tự cần khuếch đại > 3 Kb phản ứng PCR thường không hoạt động được) Số lượng DNA chỉ cần 5 - 10 ng DNA thuần khiết

Mồi: là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến PCR có sản phẩm hay không Mồi tối ưu:

• Dài khoảng 15 – 30 base

• Các đoạn mồi không nên chứa 3 nucleotide giống nhau liên tiếp

• Hàm lượng GC 40 – 60%

• Tránh hiện tượng tự bắt cặp hoặc bắt cặp bổ sung giữa hai đoạn mồi

• Tm của mồi không khác nhau quá 50C

dNTP: nồng độ mỗi loại dNTP trong phản ứng là như nhau (thường là 200 µM)

Polymerase: Taq polymerase (1 – 1,5 unit) cho một hỗn hợp phản ứng 50µl Hàm lượng Taq polymerase cao hơn có thể tổng hợp nhiều sản phẩm PCR không đặc hiệu

Mg2+: nồng độ Mg2+ ảnh hưởng đến bắt cặp mồi, Tm của sợi khuôn, sản phẩm

và liên kết mồi - khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và tính chính xác Nồng độ Mg2+ trong PCR khoảng 0,5 – 2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số

Số chu kỳ phản ứng PCR: không quá 40 chu kỳ Do hiệu quả của phản ứng khuếch đại có thể giảm dần ở những chu kỳ cuối (thành phần phản ứng cạn kiệt, sự xuất hiện của sản phẩm phụ ức chế phản ứng…) (Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải, 2008)

2.4.2 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

RT–PCR là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát hiện là RNA

Để có thể thực hiện PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT,

Reverse Transciption) thành cDNA, rồi sau đó dùng PCR khuếch đại trình tự đích

trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này (Phạm Hùng Vân, 2009)

Mồi sử dụng cho giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được phiên mã thành cDNA hay mồi ngẫu nhiên (random hexamer) gồm 6 nucleotide, phiên

mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành cDNA Ngoài ra còn có mồi oligo (dT15) – mồi poly T, tổng hợp cDNA từ mRNA biểu hiện từ một gene

RT-PCR gồm hai loại: (1) RT-PCR hai bước: giai đoạn RT tổng hợp cDNA (sử dụng enzyme reverse transcriptase) trong một ống nghiệm Lấy sản phẩm cDNA làm khuôn cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu, thực hiện PCR

khuếch đại trình tự DNA muốn tìm nhờ enzyme Taq polymerase Phương pháp này

làm tăng nguy cơ ngoại nhiễm, có thể giảm nguy cơ này bằng cách cho dUTP và UNG vào PCR mix (2) RT- PCR một bước: hai giai đoạn RT và PCR trong cùng ống phản

ứng, có cả enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT và enzyme Taq polymerase

sử dụng cho PCR Ngoài ra cũng có một loại DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus thermophilus, gọi là TthPol, có hai khả năng: có thể thực hiện

phiên mã ngược khi có sự hiện diện của Mn2+ và khả năng nhân bản DNA khi có sự hiện diện của Mg2+ , do vậy có thể dùng enzyme này làm RT-PCR một bước

Chu trình nhiệt giai đoạn RT: 42oC (10 -15 phút), mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA và enzyme reverse transcriptase tổng hợp cDNA Nếu dùng mồi ngẫu nhiên thì

để ống phản ứng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 10 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA Sau đó enzyme reverse transcriptase bị hủy hoạt tính bằng cách nâng nhiệt độ ống phản ứng lên 95oC (5 phút)

2.5.7 Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real-time (Phạm Hùng Vân, 2009) Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc (bằng điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết thúc) Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Kết quả real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA)

Ưu điểm:

• Phương pháp nhạy, nhanh, đặc hiệu

• Rút ngắn thời gian chẩn đoán và giảm nguy cơ ngoại nhiễm (do không cần phải điện di trên gel)

Nhược điểm: đắt tiền, thiết kế phản ứng phức tạp

2.5.7.2 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR (amplification graph)

Đồ thị khuếch đại thể hiện hai giai đoạn

• Giai đoạn một theo hàm mũ, lượng sản phẩm PCR gần như tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ

• Giai đoạn bão hòa cường độ huỳnh quang tăng chậm dần và đạt đến bình

nguyên (dNTP cạn kiệt, Taq polymerase cạn kiệt)

Hình 2.4 Biểu đồ khuếch đại real – time PCR (

www.gene-quantification.de/real-time-pcr-guide-biorad.pdf)

Chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm này thiết bị real-time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền Cường độ huỳnh quang nền là trung bình cộng của các cường độ tín hiệu huỳnh quang mà thiết bị real-time ghi nhận được từ ống phản ứng trong một số chu kỳ đầu (chu kỳ nền) Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền này được gọi là đường nền (nền) Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diễn khuếch đại Do được tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ chứ ít khi là một số chẵn (Phạm Hùng Vân, 2009)

Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA đích ban đầu nhiều thì chỉ sau một vài chu kỳ sản phẩm khuếch đại đã tích lũy đủ cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền Như vậy, phản ứng sẽ sớm hay có chu kỳ ngưỡng thấp Ngược lại nếu lượng mẫu ban đầu thấp phản ứng sẽ trễ hay có chu kỳ ngưỡng cao Do chu kỳ ngưỡng được đo lường trong giai đoạn hàm mũ khi các thành phần phản ứng chưa cạn kiệt, real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán một cách chính xác và tin cậy lượng ban đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng dựa vào chu kỳ ngưỡng

2.5.7.3 Biểu đồ chuẩn của real-time PCR

Để xác định chính xác số lượng DNA đích ban đầu trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử này cùng với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng (thường các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10)