PHÂN LẬP VIRUS GÂY BỆNH TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÔN TRÙNG Spodoptera frugiperda (Sf9)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS GÂY BỆNH TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÔN TRÙNG Spodoptera frugiperda (Sf9) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2004 – 2008 Lớp: DH04SH Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ THƯƠNG Tháng 9/2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS GÂY BÊNH TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÔN TRÙNG Spodoptera frugiperda (Sf9) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS VĂN THỊ HẠNH HỒ THỊ THƯƠNG Tháng 9/2008 LỜI CẢM ƠN  Con xin chân thành cảm ơn bố mẹ, người sinh thành nuôi dưỡng trưởng thành Em xin chân thành cảm ơn anh chị, em người thân yêu tin tưởng, yêu thương tạo điều kiện cho em học tập tốt  Chúng xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường - TS Văn Thị Hạnh hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp viện - Ban giám đốc tập thể cán công nhân viên thuộc viện Sinh học Nhiệt Đới tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khoá luận tốt nghiệp - Các anh chị bạn làm việc phịng Cơng nghệ Tế Bào Động Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới giúp đỡ chia sẻ vui buồn tơi q trình thực tập - Các bạn bè thân yêu lớp DH04SH sát cánh chung vui suốt thời gian học tập Thành phố HCM tháng năm 2008 Sinh viên HỒ THỊ THƯƠNG iii TÓM TẮT Hồ Thị Thương, tháng 9/2008 “Phân lập virus gây bệnh tôm phương pháp nuôi cấy tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9)” Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Giáo viên hướng dẫn: TS Văn Thị Hạnh Đề tài thực từ 01/03/2008 đến 15/09/2008 Tại Phịng Cơng Nghệ Tế Bào Động Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thí nghiệm thực bốn mẫu virus gây bệnh tôm: hai mẫu virus gây bệnh hội chứng đốm trắng (WSSV); virus gây bệnh đỏ đuôi (RTV) virus gây bệnh hoại tử (IHHNV) Tác nhân virus gây bệnh ngun nhân gây thiệt hại kinh tế, có dẫn tới sụp đổ nghề ni tơm tồn khu vực nhiều năm Vì vậy, việc phân lập tinh virus yêu cầu cần thiết để cung cấp nguyên liệu tinh cho nguyên cứu Phân lập virus Thí nghiệm tiến hành với dịng tế bào trùng Sf9, phân lập virus theo phương pháp plaque Virus có khả chép nhanh tạo thành plaque sau – ngày gây nhiễm Thu đựơc nguồn virus tinh sau – lần lặp lại điều kiện vô trùng Nhân sinh khối giữ mẫu nitơ lỏng phục vụ cho nghiên cứu dịch tễ Định lượng virus Định lượng virus có mẫu quan sát khả huỷ hoại tế bào Sf9 So sánh hai cách định lượng: - Định lượng phương pháp pha loãng nồng độ - Định lượng phương pháp plaque Kết đạt - Xây dựng quy trình phân lập virus gây bệnh tôm - Đã phân lập thành công hai chủng virus: virus gây bệnh hội chứng đốm trắng (WSSV) virus gây bệnh đỏ đuôi (RTV) iv SUMMARY Ho Thi Thuong, September 2008 “Isolation of pathogenic viruses by using the sf9 inset cell line” Subject of department of biotechnology, Nong Lam Univesity Advisor: doctor Van Thi Hanh The study has conducted in laboratory from March 2008 to September 2008, at animal cell technology, the institude of tropical biology The experiment was carried out on shrimp pathogenic virus samples: two samples white spot syndrome viruse (WSSV); Red tail virus (RTV) and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) These viruses have thought to be a main cause of harm to economy, even scatter shrimp hatching industry at all area in many years Thus, the isolation and purification of shrimp viruses are very important to have viruses for the next applying researches Isolation virus Plaque assay were used with the Sf9 cells to isolate and purify the samples Virus can quickly transcribe and after – days injection is made the plaque The plaque is havested in sterile condition with - replication Mass reproduction and keeping in liquid nito to provide epidemiology Quantitative virus Quantitative virus and observe deterioration of Sf9 cells Comparation between two methods: - The methods of End-point dilution - The methods of plaque assay Results: -Established the standard procedure for the isolation and purification of shrimp viruses - Isolated two viral strains: WSSV-ST; RTV v MỤC LỤC Trang tựa TRANG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình - đồ thị .x Danh sách bảng – sơ đồ xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự phát triển thuỷ sản toàn cầu 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Tại Việt Nam 2.2 Ảnh hưởng dịch bệnh nghề nuôi tôm 2.3 Một số bệnh virus .4 2.3.1 Hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) 2.3.2 Hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) .7 2.3.3 Bệnh nhiễm trùng virus da hoại tử 2.4 Một số vấn đề nghiên cứu virus gây bệnh tôm 11 2.5 Virus gây bệnh đuôi đỏ hoại tử (Red Tail Virus – RTV) 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng thời gian nghiên cứu .15 3.1.1 RTV – LA 15 3.1.2 WSSV – ST 15 3.1.3 WSSV – CĐ .16 vi 3.1.4 ISP3 16 3.2 Nội dung nghiên cứu .18 3.3 Phương pháp thực 19 3.3.1 Nuôi cấy tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) 19 3.3.1.1 Vật liệu - dụng cụ - thiết bị 19 3.3.1.2 Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy 20 3.3.1.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dạng lỏng 20 3.3.1.4 Chuẩn bị môi trường Stock × .20 3.3.1.5 Phương pháp cấy chuyển tế bào 21 3.3.2 Phương pháp đếm tế bào 22 3.3.3 Phân lập tinh virus theo phương pháp Plaque 23 3.3.4 Chuẩn độ virus theo phương pháp pha loãng nồng độ .26 3.3.5 Nhân sinh khối virus 28 3.3.5.1 Phương pháp nhân sinh khối virus 28 3.3.5.2 Phương pháp thu sinh khối virus 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Khảo sát khả sinh trưởng phát triển tế bào Sf9 30 4.2 Kết khảo sát mật độ tế bào tối ưu cho nghiên cứu 33 4.3 Kết chuẩn độ dịch tế bào nhiễm virus từ tôm sú 35 4.3.1 Kết chuẩn độ virus phương pháp pha loãng nồng độ 36 4.3.2 Kết chuẩn độ virus dựa vào phương pháp plaque .39 4.3.2.1 Virus RTV-LA 40 4.3.2.2 Virus WSSV-ST .41 4.3.3 Kết so sánh chuẩn độ virus hai phương pháp .43 4.4 Kết phân lập virus gây bệnh phương pháp plaque .45 4.5 Kết nhân sinh khối virus 50 4.5.1 So sánh khả huỷ hoại tế bào Sf9 thu từ plaque khác .50 4.5.2 So sánh khả huỷ hoại tế bào virus giữ nhiệt độ khác 52 4.6 Thuận lợi khó khăn q trình thí nghiệm 54 4.6.1 Thuận lợi 54 4.6.2 Khó khăn 55 vii Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC: American Type Culture Collection bp: Base pair BP: Baculovirus Penaeid DNA: Deoxyribonucleic acid DMSO: Dimethyl Sulfoxide FAO: Food and Agriculture Organization FBS: Fetal Bovin Serum GAV: Gill-Associated Virus HHNBV: Hypodermal Hepatopoietic Necrosis Baculovirus HPV: Hepatopancreatic Parvovirus IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus Kb: KDa LD50: Kilo base Kilo Dalton Lethal dose LOVV: Lymphoi Organ Vacuolization Virus MBV: Monodon Type baculovirus OIE: World Organisation for Animal Health ORF: Open Reading Frame PFU: Plaque Formation Unit REO: Reo – like – virus RNA: Ribonucleic acid RPS : Rhabdovirus of Penaeid Shrimp RTV : Red Tail Virus RV-PJ: Japan’s Rod-shaped Nuclear Virus of P japonicus SEMBV : Thailand’s Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus of P monodon SFM : Serum Free Medium TCID50 : Tissue Culture infectious Dose TSV : Taura syndrom virus WSSV: White spot syndrome virus YHV: Yellow - head virus ix DANH SÁCH CÁC HÌNH - ĐỒ THỊ HÌNH - ĐỒ THỊ TRANG Hình 2.1: Tơm sú biểu bệnh hội chứng đốm trắng .5 Hình 2.2: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng Hình 2.3: Tôm thẻ chân trắng biểu bệnh hội chứng Taura Hình 2.4: Tơm sú biểu bệnh IHHNV 10 Hình 2.5: Tơm sú biểu bệnh RTV 13 Hình 3.1: Tơm sú nhiễm virus RTV-LA 17 Hình 3.2: Tơm sú nhiễm virus WSSV-ST 17 Hình 3.3: Tơm sú nhiễm virus WSSV-CĐ 17 Hình 3.4: Tôm sú nhiễm virus ISP3 .17 Hình 4.1: Tế bào Sf9 nuôi cấy đơn lớp thời kỳ phát triển mạnh (X200) 33 Hình 4.2: Các mật độ tế bào khác phục vụ cho nghiên cứu virus (X100) 34 Hình 4.3: Tế bào trùng Sf9 nhiễm virus gây bệnh đỏ đuôi tôm 35 Hình 4.4: Nhuộm tế bào thuốc nhuộm neutral red 40 Hình 4.5: Tổng thể virus WSSV-STPLII tạo plaque đĩa petri 42 Hình 4.6: Virus tạo thành plaque quan sát mắt thường .47 Hình 4.7: Virus phá huỷ tế bào Sf9 tạo thành plaque (X40) 48 Hình 4.8: Hình tổng thể plaque quan sát kính hiển vi soi ngược (X100) 48 Hình 4.9: Hình plaque virus sau ngày gây nhiễm giữ nhiệt độ phòng 49 Hình 4.10: Nhân sinh khối virus tế bào Sf9 giữ 270C (X200) .52 Hình 4.11: Nhân sinh khối WSSV – STPLII quan sát vật kính X200 53 Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng tế bào Sf9 nuôi cấy đơn lớp môi trường Sf- 900 II SFM giữ 270C 31 Đồ thị 4.2: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ sống tế bào Sf9 nuôi cấy đơn lớp môi trường Sf- 900 II SFM 32 Đồ thị 4.3: Kết chuẩn độ TCID50/mL loại virus gây bệnh tôm 38 Đồ thị 4.4: Kết chuẩn độ sử dụng hai phương pháp .44 x ... dịng tế bào côn trùng Sf9 mẫn cảm với virus gây bệnh tôm, mở hướng nghiên cứu virus hiệu Chính chúng tơi tiến hành thực đề tài “PHÂN LẬP VIRUS GÂY BỆNH TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÔN TRÙNG... THƯƠNG iii TÓM TẮT Hồ Thị Thương, tháng 9/2008 ? ?Phân lập virus gây bệnh tôm phương pháp nuôi cấy tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9)? ?? Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nơng Lâm Thành... MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS GÂY BÊNH TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÔN TRÙNG Spodoptera frugiperda (Sf9) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS