CHẨN ĐOÁN BỆNH, ĐỘNG VẬT THỦY SẢN, BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR
Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TRUNG TÂM QUAN TRẮC, CẢNH BÁO MÔI TRƯỜNG VÀ BỆNH THỦY SẢN VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN I CHẨN ĐỐN BỆNH ĐỘNG VẬT THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR Bắc Ninh, 2006 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Mục Lục Phần Phương pháp PCR Ứng dụng PCR Nguyên tắc phản ứng PCR 2 Một số nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 3 Ứng dụng PCR việc chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản Phần II Trang thiết bị hóa chất Trang thiết bị Hóa chất Các loại Kít thường dùng Phần III Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản phương pháp PCR Quy trình chẩn đốn Phương pháp chẩn đốn bệnh MBV tơm sú Chẩn đoán tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú tôm Chân trắng 12 Chẩn đốn bệnh đầu vàng tơm sú phương pháp RT - PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV 18 Chẩn đoán hội chứng Taura phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV 22 Chẩn đoán bệnh VNN cá biển phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000VNN 26 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phần Phương pháp PCR Ứng dụng PCR Nguyên tắc phản ứng PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis cộng (Mỹ) phát minh năm 1985 kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới Ðây phương pháp in vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự ADN đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa hoạt động ADN polymerase trình tổng hợp ADN từ mạch khuôn Tất ADN polymerase cần mồi, đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Ðoạn mồi sau nối dài nhờ hoạt động ADN polymerase để hình thành mạch hoàn chỉnh Một phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND giống chuỗi AND gốc Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Một số nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR • Cặp Mồi Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại • ADN mẫu Kết phản ứng PCR lệ thuộc lớn vào ADN mẫu, phản ứng PCR tối ưu ADN thật tinh Ứng dụng PCR việc chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản Hiện nay, phương pháp sử dụng rộng rãi nhiều nghiên cứu sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát mầm bệnh, vi sinh vật, virus, tạo đột biến gene xác định mối quan hệ họ hàng di truyền loài động vật thực vật….trong Thủy sản PCR áp dụng để chẩn đốn bệnh, bao gồm: Bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV…và bệnh cá: VNN… Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phần II Trang thiết bị hóa chất Trang thiết bị 1.1 Trạm tách triết ADN RNA Trang thiết bị cần dùng cho trạm tách chiết ADN RNA bao gồm dụng cụ sau: • Tủ lạnh thường • Tủ lạnh sâu • Máy ly tâm lạnh 13000rpm • Block nhiệt khô • Vortex • Máy hút chân không • Các loại Micropipette 0.5 - 1000μl • Giá đựng ống nghiệm tube Eppendorf 0.2 – 1.5ml • Hộp đựng đầu típ Micropipette loại • Bộ kéo, panh • Máy làm lạnh hơp đá lạnh • Chai có vịi đựng cồn 95% • Ống nghiệm tube Eppendorf 0.2 1.5ml • Típ Micropipette loại • Gang tay, giấy lau, giấy thấm • Bút đánh dấu • Sổ ghi chép • Chày nghiên mẫu (loại dùng lần loại dùng lại) 1.2 Trạm PCR Các trang thiết bị cần thiết cho trạm PCR bao gồm: • Máy PCR (Eppendorf) • Ổn áp LIOA 10000W Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.3 Trạm phân tích kết Trang thiết bị cần thiết cho trạm phân tích kết bao gồm: • Bộ điện di • Bàn đọc UV • Bộ chụp ảnh gel • Máy vi tính • Lị vi sóng • Cân điện tử • Ống đong 100ml, 500ml 1000ml • Bình tam giác 500ml 1000ml • Bình tam giác chịu nhiệt 250ml • Ống nghiệm 50ml nhựa có nắp • Micropipette - 20μl • Típ Micropipette • Gang tay, giấy lau • Giấy Parafin Hóa chất Các loại hóa chất cần dùng phịng chẩn đốn tác nhân vi rút gây bệnh tơm, cá bao gồm loại sau: • Nước cất • Cồn 75%, 95% • Chloroform • Isopropanol • Ethidiumbrome • Agarose • TAE buffer 1X TBE buffer 1X Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Các loại Kít thường dùng • IQ2000VNN • Non – Stop Nested WSSV PCR kits (Nam Khoa) • Duplex MBV – WSSV PCR mix (Nam Khoa) • IQ2000WSSV • IQ2000YHV • IQ2000TSV Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phần III Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản phương pháp PCR Quy trình chẩn đốn Quy trình chẩn đốn tác nhân vi rút gây bệnh tơm thực theo bước sau: Quy trình chẩn đốn tác nhân vi rút gây bệnh tơm Mẫu tôm Chuẩn bị mẫu Tách triết ADN (MBV WSV) Tách triết RNA ( YHV, TSV) PCR RT- PCR Điện di Đọc kết Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Quy trình chẩn đoán VNN cá biển Mẫu cá Chuẩn bị mẫu Tách triết RNA RT- PCR Điện di Đọc kết Phương pháp chẩn đốn bệnh MBV tơm sú Phương pháp chẩn đốn bệnh MBV tơm sú phương pháp PCR sử dụng kít Duplex MBV – WSSV Công ty Nam Khoa chủ yếu sử dụng tôm Postlarvae nhỏ (< PL8) 2.1 Thành phần kít Thơng thường kít Duplex MBV – WSSV có 50 mix • Dung dịch tách chiết ADN cho 50 mẫu: R1 (50ml), R2 (300μl) R3 (150μl) Pha dung dịch tách chiết cách dùng đầu típ hút 250μl R2 vào R1, lắc sau dùng típ hút 125μl R3 cho tiếp vào R1, lắc ( ý dung dịch tách chiết pha phải để tối, thời hạn sử dụng tháng kể từ pha) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Duplex MBV – WSSV PCR mix: x 50 tube PCR loại 0.2ml, ống chứa 48μl mix (bảo quản – 200C) • Đối chứng dương đối chứng âm (bảo quản – 200C) • TBE 10X: x50ml • Loading buffer: 500μl • Ethidium bromide10mg/ml: 15μl • Agarose:3gr • Ngồi kít cung cấp cho 50 cối chày nghiền mẫu tube Eppendorf 1.5ml 2.2 Chuẩn bị mẫu • Mẫu tôm Postlarvae, tôm giống cỡ nhỏ tiến hành lấy khoảng 50 • Mẫu tơm ni: tiến hành cắt phần mang, chân bơi đuôi 10 – 15 (tổng lượng mẫu không gr) • Đối với tơm bố mẹ tiến hành cắt chân bơi • Tất loại mẫu lấy mẫu tươi cố định cồn 95% 2.3 Tách chiết ADN • Cho mẫu vào Eppendorf 1.5ml, sau thêm vào 100μl dung dịch tách chiết, dùng chày nghiền nhỏ, sau nghiền nhỏ nhuyễn tiến hành thêm vào từ 500 – 700ml dung dịch tách chiết, sau tiếp tục nghiền nhuyễn hồn toàn đậy nắp lại (nếu thực nhiều mẫu lần cần phải để lạnh trước chuyển sang bước tiếp theo) • Ủ mẫu: sau nghiền xong tiến hành chuyển vào block nhiệt khơ (điều chỉnh nhiệt độ block 960C) giữ khoảng – 10 phút, sau lấy làm lạnh nhanh (trong đá tủ lạnh sâu) vài phút • Ly tâm 13000 vịng/phút phút Sử dụng phần dịch để chạy PCR bảo quản tủ lạnh sâu Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2 Chẩn đoán tác nhân gây bệnh phương pháp PCR sử dụng kít IQ2000WSSV 3.2.1 Thành phần Bộ kít cung cấp cho 200 mẫu, bao gồm thành phần sau: First PCR PreMix ống, ống chứa 450μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP primer chuyên biệt) Nested PCR PreMix ống, ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer chuyên biệt) Đối chứng dương (Positive standard) ống, chứa 100μl, 104 sao/μl Đối chứng âm Thang ADN ống, chứa 100μl ( thang ADN có vạch, 848bp, 630bp 333bp) Dung dịch tách chiết ADN ( Lysis buffer) chai 100ml 3.2.3 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV) 3.2.3 Tách chiết AND • Cho mẫu vào ống Eppendorf 1.5ml ( mẫu bảo quản cồn cần làm khô cồn mẫu trước đưa vào tách chiết) • Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 - 200μl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 400 – 500μl dung dịch tách chiết nghiền tiếp đến nhuyễn • Ủ mẫu nhiệt độ 950C 10 phút, ly tâm 12000 vòng/phút thời gian 10 phút • Chuyển 200μl phần dịch sang ống Eppendorf có chứa 400μl cồn 95%, lắc nhẹ nhàng • Ly tâm 12000 vòng/phút thời gian phút, sau loại bỏ cồn làm khơ mẫu • Hòa tan ADN nước tinh khiết với lương khoảng từ 50 - 200μl tùy thuộc vào lượng ADN tách chiết Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 15 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2.4 Khuếch đại sản phẩm • Điều kiện phản ứng - Bước 940C 30 giây ; 620C 30 giây; 720C 30 giây, lặp lại chu kỳ, sau 940C 15 giây; 620C 15 giây; 720C 20 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối - Bước 940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 25 chu kỳ, Add 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối • Chuẩn bị phản ứng + Chuẩn bị chất phản ứng sau: Bước : 8μl/phản ứng, bao gồm chất - First PCR PreMix 7,5μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 0,5μl Bước 2: 15μl/ phản ứng, bao gồm chất - Nested PCR Premix 14μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl + Quy trình thực sau: - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước theo số mẫu chẩn đoán, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf - Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf - Cho vào ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch ADN mẫu tách chiết, đối chứng âm dương - Đậy nắp lại Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 16 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước máy PCR - Sau kết thúc trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 3.2.5 Điện di Quy trình tiến hành theo nguyên lý chung điện di Tiến hành hiệu điện 100volt thời gian 25 – 30 phút 3.2.6 Đọc kết Đọc kết dựa hình chuẩn sau Trong 1: Mẫu bị nhiễm WSS mức độ nặng 2: Mẫu bị nhiễm WSS mức độ trung bình 3: Mẫu bị nhiễm WSS mức độ nhẹ 4: Mẫu bị nhiễm WSS mức độ nhẹ 5: Mẫu không bị nhiễm WSSV 6: Mẫu nước tinh khiết 7: Đối chứng dương 2000 8: Đối chứng dương 200 9: Đối chứng dương 20 M: Thang ADN 848bp, 630bp 333bp Quy trình chẩn đốn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 17 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 296bp 550bp có vạch 550bp mẫu bị nhiễm WSSV - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 848bp mẫu khơng bị nhiễm WSSV Ngồi ta sử dụng kít Duplex MBV – WSSV cho việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh Đốm trắng tôm sú tôm Chân trắng ( Xem phần Quy trình chẩn đốn bệnh MBV) Chẩn đốn bệnh đầu vàng tơm sú phương pháp RT PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV 4.1 Thành phần Bộ kít cung cấp cho 200 mẫu, bao gồm thành phần sau: RT - PCR PreMix ống, ống chứa 420μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer YHV/GAV chuyên biệt) Nested PCR PreMix ống, ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer YHV/GAVchuyên biệt) Đối chứng dương (YHV GAV ) ống, chứa 100μl, 104 sao/μl Đối chứng âm (Yeast tRAN) ống 500μl, 40ng/μl IQzyme ADN Polymerase ống 2U/μl, chứa 360μl RT Enzyme Mix ống, chứa 12μl Dung dich nhuộm (6X Loading buffer Dye) ống, chứa 1500μl Thang ADN ống, chứa 100μl ( thang ADN có vạch, 848bp, 630bp 333bp) Dung dịch tách chiết RNA chai 100ml Nước tinh kiết chai 100ml 4.2 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV) 4.3 Tách chiết RNA • Cho mẫu vào ống Eppendorf 1.5ml ( mẫu bảo quản cồn cần làm khơ cồn mẫu trước đưa vào tách chiết) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 18 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 - 200μl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 400 – 500μl dung dịch tách chiết nghiền tiếp đến nhuyễn Để nhiệt độ phịng thời gian khoảng phút • Cho vào 100μl CHCl3 (Chloroform), lắc máy Vortex khoảng 20 giây, để nhiệt độ phòng khoảng phút ly tâm 12000 vòng/phút thời gian 15 phút • Chuyển 200μl phần dịch sang ống Eppendorf có chứa 200μl Isopropanol, lắc nhẹ nhàng • Ly tâm 12000 vịng/phút thời gian 10 phút, sau loại bỏ Isopropanol • Rửa với 500μl cồn 75%, ly tâm 9000 vịng/phút thời gian phút • Loại bỏ cồn làm khơ • Hịa tan RNA nước tinh khiết với lương khoảng từ 50 - 200μl tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết 4.4 Khuếch đại sản phẩm • Điều kiện phản ứng - Bước 420C 30 phút ; 940C phút, sau 940C 20giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối - Bước 940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối • Chuẩn bị phản ứng + Chuẩn bị chất phản ứng sau: Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 19 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bước : 8μl/ hỗn hợp phản ứng, bao gồm chất - RT - PCR PreMix 7μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 0,5μl - RT Enzyme Mix 0,5μl Bước 2: 15μl/ phản ứng, bao gồm chất - Nested PCR Premix 14μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl + Quy trình thực sau: - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước theo số mẫu chẩn đoán, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf - Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf - Cho vào ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch RNA mẫu tách chiết, đối chứng âm dương - Đậy nắp lại - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước máy PCR - Sau kết thúc trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 4.5 Điện di Quy trình tiến hành theo nguyên lý chung điện di Tiến hành hiệu điện 100volt thời gian 25 – 30 phút 4.6 Đọc kết Đọc kết dựa hình chuẩn sau Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 20 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Trong 1: Đối chứng dương YHV, 2000 2: Đối chứng dương YHV, 200 3: Đối chứng dương YHV, 20 4: Đối chứng dương GAV, 2000 5: Đối chứng dương GAV, 200 6: Đối chứng dương GAV, 20 7: Mẫu bị nhiễm YHV mức độ nặng 8: Mẫu bị nhiễm YHV mức độ nhẹ 9: Mẫu bị nhiễm GAV mức độ nặng 10: Mẫu bị nhiễm GAV mức độ nhẹ 11: Đối chứng âm M: Thang ADN, 848bp, 630bp 333bp Quy trình chẩn đốn - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 277bp 777bp mẫu bị nhiễm YHV mức độ nặng - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 277bp mẫu bị nhiễm YHV mức độ nhẹ - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 406bp 777bp mẫu bị nhiễm GAV mức độ nặng Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 21 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 406bp mẫu bị nhiễm GAV mức độ nhẹ - Nếu xuất vạch 680bp mẫu khơng bị nhiễm YHV GAV Chẩn đoán hội chứng Taura phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV 5.1 Thành phần Bộ kít cung cấp cho 200 mẫu, bao gồm thành phần sau: RT - PCR PreMix ống, ống chứa 420μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer TSV chuyên biệt) Nested PCR PreMix ống, ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer TSVchuyên biệt) Đối chứng dương (TSV ) ống, chứa 100μl, 104 sao/μl Đối chứng âm (Yeast tRAN) ống 500μl, 40ng/μl IQzyme ADN Polymerase ống 2U/μl, chứa 360μl RT Enzyme Mix ống, chứa 12μl Dung dich nhuộm (6X Loading buffer Dye) ống, chứa 1500μl Thang ADN ống, chứa 100μl ( thang ADN có vạch, 848bp, 630bp 333bp) Dung dịch tách chiết RNA chai 100ml Nước tinh kiết chai 100ml 5.2 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV) 5.3 Tách chiết RNA • Cho mẫu vào ống Eppendorf 1.5ml ( mẫu bảo quản cồn cần làm khô cồn mẫu trước đưa vào tách chiết) • Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 - 200μl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 400 – Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 22 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 500μl dung dịch tách chiết nghiền tiếp đến nhuyễn Để nhiệt độ phịng thời gian khoảng phút • Cho vào 100μl CHCl3 (Chloroform), lắc máy Vortex khoảng 20 giây, để nhiệt độ phòng khoảng phút ly tâm 12000 vịng/phút thời gian 15 phút • Chuyển 200μl phần dịch sang ống Eppendorf có chứa 200μl Isopropanol, lắc nhẹ nhàng • Ly tâm 12000 vịng/phút thời gian 10 phút, sau loại bỏ Isopropanol • Rửa với 500μl cồn 75%, ly tâm 9000 vịng/phút thời gian phút • Loại bỏ cồn làm khơ • Hịa tan RNA nước tinh khiết với lương khoảng từ 50 - 200μl tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết 5.4 Khuếch đại sản phẩm • Điều kiện phản ứng - Bước 1: RT - PCR 420C 30 phút ; 940C phút, sau 940C 20giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối - Bước 2: Nested PCR 940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối • Chuẩn bị phản ứng + Chuẩn bị chất phản ứng sau: Bước : 8μl/ hỗn hợp phản ứng, bao gồm chất - RT - PCR PreMix 7μl Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 23 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 0,5μl - RT Enzyme Mix 0,5μl Bước 2: 15μl/ phản ứng, bao gồm chất - Nested PCR Premix 14μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl + Quy trình thực sau: - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước theo số mẫu chẩn đoán, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf - Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf - Cho vào ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch RNA mẫu tách chiết, đối chứng âm dương - Đậy nắp lại - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước máy PCR - Sau kết thúc trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 5.5 Điện di Quy trình tiến hành theo nguyên lý chung điện di Tiến hành hiệu điện 100volt thời gian 25 – 30 phút 5.6 Đọc kết Đọc kết dựa hình chuẩn sau Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 24 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Trong 1: Đối chứng dương, 2000 2: Đối chứng dương, 200 3: Đối chứng dương, 20 4: Đối chứng âm 5: Mẫu bị nhiễm TSV nặng 6: Mẫu bị nhiễm TSV mức độ trung bình 7: Mẫu bị nhiễm TSV mức độ nhẹ 8: Mẫu bị nhiễm TSV mức độ nhẹ 9: Mẫu không bị nhiễm TSV M: Thang ADN, 848 bps, 630 bps, 333 bps Quy trình chẩn đốn - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 284bp 476bp mẫu bị nhiễm TSV mức độ nặng - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 284bp mẫu bị nhiễm TSV mức độ nhẹ - Nếu xuất vạch 680bp mẫu khơng bị nhiễm TSV Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 25 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Chẩn đoán bệnh VNN cá biển phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000VNN 5.1 Thành phần Bộ kít cung cấp cho 200 mẫu, bao gồm thành phần sau: RT - PCR PreMix ống, ống chứa 420μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer VNN chuyên biệt) Nested PCR PreMix ống, ống chứa 840μl (Bao gồm dung dịch phản ứng, dNTP Primer VNN chuyên biệt) Đối chứng dương (VNN ) ống, chứa 100μl, 104 sao/μl Đối chứng âm (Yeast tRAN) ống 500μl, 40ng/μl IQzyme ADN Polymerase ống 2U/μl, chứa 360μl RT Enzyme Mix ống, chứa 12μl Dung dich nhuộm (6X Loading buffer Dye) ống, chứa 1500μl Thang ADN ống, chứa 100μl ( thang ADN có vạch, 848bp, 630bp 333bp) Dung dịch tách chiết RNA chai 100ml Nước tinh kiết chai 100ml 5.2 Chuẩn bị mẫu ( xem phần chuẩn bị mẫu kít Duplex MBV – WSSV) 5.3 Tách chiết RNA • Cho mẫu vào ống Eppendorf 1.5ml ( mẫu bảo quản cồn cần làm khơ cồn mẫu trước đưa vào tách chiết) • Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 - 200μl dung dịch tách chiết , nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 400 – 500μl dung dịch tách chiết nghiền tiếp đến nhuyễn Để nhiệt độ phòng thời gian khoảng phút Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 26 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Cho vào 100μl CHCl3 (Chloroform), lắc máy Vortex khoảng 20 giây, để nhiệt độ phòng khoảng phút ly tâm 12000 vòng/phút thời gian 15 phút • Chuyển 200μl phần dịch sang ống Eppendorf có chứa 200μl Isopropanol, lắc nhẹ nhàng • Ly tâm 12000 vịng/phút thời gian 10 phút, sau loại bỏ Isopropanol • Rửa với 500μl cồn 75%, ly tâm 9000 vòng/phút thời gian phút • Loại bỏ cồn làm khơ • Hòa tan RNA nước tinh khiết với lương khoảng từ 50 - 200μl tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết 5.4 Khuếch đại sản phẩm • Điều kiện phản ứng - Bước 420C 30 phút ; 940C phút, sau 940C 30giây; 620C 30 giây; 720C 30 giây, lặp lại 15 chu kỳ, sau 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối - Bước 940C 20 giây; 620C 20 giây; 720C 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ 720C 30 giây; 200C 30 giây, kết thúc chu kỳ cuối • Chuẩn bị phản ứng + Chuẩn bị chất phản ứng sau: Bước : 8μl/ hỗn hợp phản ứng, bao gồm chất - RT - PCR PreMix 7μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 0,5μl Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 27 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - RT Enzyme Mix 0,5μl Bước 2: 15μl/ phản ứng, bao gồm chất - Nested PCR Premix 14μl - IQzyme ADN Polymerase 2U/μl 1μl + Quy trình thực sau: - Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước theo số mẫu chẩn đoán, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf - Cho 8μl hỗn hợp phản vào ống Eppendorf 0,2ml, ghi ký hiệu mãu lên ống Eppendorf - Cho vào ống Eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng 2μl dung dịch RNA mẫu tách chiết, đối chứng âm dương - Đậy nắp lại - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước máy PCR - Sau kết thúc trình khuếch đại sản phẩm bước 1, thêm vào 15μl hỗn hợp phản ứng bước - Tiến hành khuếch đại sản phẩm bước 5.5 Điện di Quy trình tiến hành theo nguyên lý chung điện di Tiến hành hiệu điện 100volt thời gian 25 – 30 phút 5.6 Đọc kết Đọc kết dựa hình chuẩn sau Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 28 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Trong 1: Đối chứng chuẩn 1, 2000 sao/ phản ứng 2: Đối chứng chuẩn 2, 200 sao/phản ứng 3: Đối chứng chuẩn 3, 20 sảo/phản ứng 4: Mẫu nước tinh khiết 5: Mẫu bị nhiễm VNN mức độ nặng 6: Mẫu bị nhiễm VNN mức độ nhẹ 7: Mẫu không bị nhiễm VNN M: Thang ADN, 848 bps, 630 bps, 333 bps Quy trình chẩn đốn - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 289bp mẫu bị nhiễm VNN mức độ nhẹ - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 289 620bp mẫu bị nhiễm VNN mức độ trung bình - Nếu mẫu kiểm tra xuất vạch 289, 620 1160bp mẫu bị nhiễm VNN ỏ mức độ nặng Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 29 ... Phần III Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản phương pháp PCR Quy trình chẩn đoán Phương pháp chẩn đoán bệnh MBV tôm sú Chẩn đoán tác nhân gây bệnh đốm... Phương pháp chẩn đoán bệnh Động vật Thủy sản phương pháp PCR Quy trình chẩn đốn Quy trình chẩn đốn tác nhân vi rút gây bệnh tôm thực theo bước sau: Quy trình chẩn đốn tác nhân vi rút gây bệnh tôm... 12 Chẩn đoán bệnh đầu vàng tôm sú phương pháp RT - PCR sử dụng kít IQ2000YHV/GAV 18 Chẩn đoán hội chứng Taura phương pháp RT- PCR sử dụng kít IQ2000TSV 22 Chẩn đoán bệnh