biến dị di truyền và qtl liên quan đến sự phát triển ổn định phát và sự tương tác của môi trường lên các tính trạng trong ngô (zea mays l )

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC SEMINAR MÔN HỌC: CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT ĐỀ TÀI: BIẾN DỊ DI TRUYỀN VÀ QTL LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN ỔN ĐỊNH PHÁT VÀ SỰ TƯƠNG TÁC CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN CÁC TÍNH TRẠNG TRONG NGƠ (Zea mays L.) GVHD: Ths Lưu Thị Thanh Tú Tổng quan Hiện nay, nghiên cứu sở di truyền phương sai vi môi tr ường (VE) tương quan mơi trường hạn chế Trong nghiên cứu này, việc sử dụng quần thể dòng nội phối tái tổ hợp (RIL) ngơ trình tự l ặp lại đơn giản (SSR) marker đa hình, đ ể thực hi ện mục đích: Đ ầu tiên, đ ể xác định số lượng thành phần di truyền V E hay ổn định phát triển cho bốn tính trạng ngô tương quan môi trường tính trạng Th ứ đến, để nhận dạng tính trạng số lượng nhiều locut quy định (QTLs) Chúng nhận thấy rằng, ước lượng phương sai, độ tương quan ki ểm tra đồng chúng việc ước lượng kiểm tra cần thi ết không phụ thuộc nhiều vào nhận định thơng thường Có bi ến đổi đáng k ể giá trị VE RILs tương quan môi trường vài tính trạng, dẫn đến tính đa dạng di truyền V E tương tác với môi trường Hệ số di truyền biến đổi phương sai môi trường (GCV VE) ước lượng 20%, số thấp so với số loài khác Một vài vùng gen liên quan t ới s ự ổn định vài tính trạng nhận diện vùng không ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị trung bình tính trạng Một vùng có th ể ảnh hưởng tới tương quan môi trường tính trạng tìm thấy Giới thiệu Ổn định kiểu hình xu hướng kiểu gen để bi ểu nh ững ki ểu hình giống mơi trường khác (Lynch & Walsh, 1998) Sự ổn định hay dễ biến đổi kiểu gen thay đổi mơi tr ường chung ước lượng phương sai kiểu gen tổng th ể môi trường chung nơi chúng sinh trưởng ổn định kiểu gen thay đổi mơi trường chung ước lượng phương sai kiểu gen vi môi trường (sự ổn định phát tri ển) Những khác ki ểu gen trạng thái ổn định biểu tính đa dạng ki ểu gen ph ương sai vi mơi trường hay mơi trường chung Có khả nhân tố di truy ền quy đ ịnh s ự ổn định kiểu hình thay đổi môi trường chung hay vi môi tr ường khơng phải nhân tố tương tự nhân tố ảnh hưởng đến ổn định thay đổi môi trường, s ố nghiên cứu có thành định Bằng chứng cho tồn tính đa dạng di truyền phương sai mơi tr ường (VE) thí nghiệm chọn lọc, theo số gi ả thuy ết, phương sai môi trường làm giảm sút chọn lọc ổn định làm gia tăng ch ọn l ọc phân hóa (theo Mulder, 2007) Do đó, Kaufman (1997) quan sát s ự gi ảm sút c VE chọn lọc ổn định Schaloo (1972) quan sát gia tăng ch ọn l ọc gián đoạn Một vài thí nghiệm sử dụng chọn lọc trực tiếp cắt ngắn cho thấy phương sai kiểu hình gia tăng theo hệ chọn l ọc (Clayton Robertson, 1957; Mackey, 1994) Một giải thích cho ki ện tồn phương sai kiểu gen VE nhiều kiểu gen thay đổi có nhiều khả có kiểu hình cực trị cường độ chọn lọc cao (Hill Zhang, 2004) Sự khác kiểu gen VE xác định việc phân tích vùng liệu động vật địa Van Vleck (1968) Clay (1979) bò s ữa, SanCristobal-Gaudy (2001) cừu, Sorensen Waapegetersen (2003) IbanezEscriche (2008) heo Rowe (2006) gà Các tác giả khác tìm s ự đa d ạng di truyền VE số loài mẫu bao gồm chu ột (Gutierrez, 2006) Drosophila melanogaster (Whitlock Fower, 1999; Mackay Lyman, 2005) ốc sên Helix aspersa (Ros, 2004) Trong tạo giống thực vật, phần lớn tài liệu nghiên cứu m ẫu th ống kê kiểu gen x tương tác vĩ môi trường đánh giá ổn định ều ki ện th nghiệm đa môi trường (Cotes, 2006) Tuy nhiên, gần đây, nhà nghiên cứu không ý đến đa dạng V E hay phương sai sai số sau với mục tiêu giảm sai số việc ước lượng phương sai tương tác gi ữa ki ểu gen môi trường chung (Edwards Jannink, 2006) Sự đa dạng V E hay phương sai sai số di truyền gây lại đưa thơng tin h ữu ích v ề thành phần di truyền ổn định phát triển Ở mức độ phân tử, thơng tin thí nghiệm bị gi ới hạn v ề c s di truyền c phương sai vi môi trường (VE) Ở loài D.melanogaster, yếu tố di truyền định khác giá trị trung bình phương sai s ố l ượng lông c cháu xác định vị trí hay nhiều nhiễm sắc th ể (Caligari Mather, 1975) Trong việc lai Licopersicon esculentun Licopersicon pimpinellifolium, marker liên kết ảnh hưởng lên phương sai tìm thấy vài tính tr ạng s dụng marker hình thái marker liên quan đến ện chuy ển (Weller, 1998) Ở Arabidopsis thaliana, Stratton (1998) tìm thấy hai QTLs tác động đến th ời gian hoa, số lượng Mackay Lyman (2005) nhận thấy hi ện tượng đa hình phân tử Dopa decarbonxilase (Ddc) liên kết v ới bi ến đổi phương sai môi trường số lông bụng D.melanogaster Dữ liệu thí nghiệm xếp QTL tác động đến phương sai môi tr ường ổn định môi trường, VE hay ổn định (sự ổn định phát tri ển) b ộ gen hay ảnh hưởng QTL cần thiết Ví dụ, thơng tin có th ể h ữu ích đ ể hiểu cách mức độ phương sai kiểu hình rút giá tr ị (Zhang Hill, 2005) Cũng vậy, chăn nuôi tạo giống thực vật, thông tin QTL tác động đến VE hữu ích đồng dạng sản phẩm sản phẩm sau m ột v ấn đề quan trọng Giá trị hàng ngàn marker phân tử hình thái s ự phát tri ển c ph ương pháp thống kê thích hợp cho phép việc sử dụng nghiên cứu đồ QTL đ ể nhận diện nhiều vùng gen tác động đến giá trị trung bình nhiều tính tr ạng khác nhiều loài động thực vật Tuy nhiên, cho tận đến bi ết, kỹ thuật có khơng có ứng dụng vùng gen xác đ ịnh vị trí hay QTL ảnh hưởng đến V E tương quan với mơi trường tính trạng Vì vậy, nghiên cứu sử dụng dòng nội phối tái tổ hợp (RIL) ngơ lặp lại trình tự đơn giản (SSR) marker đa hình, v ới mục đích: Để xác định số lượng thành phần di truy ền V E hay ổn định phát triển cho bốn tính trạng ngơ tương quan với mơi trường gi ữa tính trạng Để nhận dạng xác định ảnh hưởng QTL V E tính trạng tương quan môi trường chúng 2.Vật liệu phương pháp (i) Vật liệu thí nghiệm, ước lượng kiểu hình locut marker Tổng cộng có 129 dòng F6 khơng chọn lọc phát tri ển từ phép lai đ ơn dòng EP42 x EP39 Dòng EP42 thu từ giống thụ phấn mở Tây Bắc Tây Ban Nha (vùng ẩm ướt) Dòng EP39 thu từ lồi ‘Fino’ trung tâm Tây Ban Nha (vùng khô ráo) RILs sinh sôi nảy n m ột năm m ột khu vực để có hạt giống đồng 129 RILs phát tri ển m ột lơ hồn toàn ngẫu nhiên qua hệ Pontevedra (vùng ẩm ướt) năm 2006 Mỗi kho ảng bao gồm hàng, gồm 13 dòng xếp 13 c ụm Khoảng cách hàng 0, 8m 0, 21m mật đ ộ xấp x ỉ 60 000 cây/ha Số sống sót trung bình RIL 49, 5, bi ến thiên t 12 đ ến 65 D ữ liệu theo sau lấy từ riêng biệt: chi ều cao chi ều dài b ắp (hoa cái), chiều dài cờ (hoa đực) ngày tung phấn DNA 10 ngẫu nhiên lấy từ RIL rút b ởi Liu Whittier (1999) với biến thể Sự khuếch đại SSR thực hi ện mô tả Butron (2003) Sản phẩm SSR tách sau khuếch đại bảng điện di sử dụng 1TBE 6% gel acrylamide khơng làm bi ến tính (x ấp x ỉ 250V giờ) (Wang, 2003) Tổng cộng có 85 cặp mồi hình thái SSR phân b ố gen RIL (bảng phụ lục) (ii) Phương pháp thống kê Trong này, sử dụng thuật ngữ ‘micro-environment’ đ ể nói đ ến môi trường riêng lẻ phát tri ển thời gian gần đ ịa điểm với khác, cụ thể hàng (a) Cơ sở phân tích tính đồng phương sai tương quan mơi trường Dưới mơ hình thứ nhất, kiểu hình (P) tổng hợp ảnh h ưởng từ giá trị kiểu gen hay RIL (G), số lần thử (R), tương tác gi ữa locut (I) sai số ngẫu nhiên (e) Công thức viết sau: Pijk = µ + Gi + Rj + Iij + eijk i= 1, 129 ; j = 1, ; k =1, n ij; µ trung bình tổng thể yếu tố cố định, yếu tố khác ngẫu nhiên với trung bình ph ương sai V G, VR, VI VE, nij số lượng RIL I số lần lặp lại j Các thành phần phương sai liên kết với nguồn g ốc bi ến đổi đ ược ước lượng khả lớn xảy hạn chế (REML) sử dụng phần mềm VARCOMP SAS (viện SAS, 2003) Phương sai vi môi trường, VE, đánh giá biển đổi hàng VE biến đổi vi mơi trường chính, bao gồm b ất kỳ s ự bi ến đổi di truyền lại sau hệ tự thụ chia cách đời F6 (mà theo trung bình 1/16 ph ương sai ki ểu gen th ế h ệ F2 giả sử khơng có tính át chế) Dưới mơ hình 1, V E cho giống với tất kiểu gen khơng có đa dạng di truy ền tính bi ến thiên vi mơi trường phương sai di truyền lại đồng cho tất dự đốn từ mơ hình di truyền nhỏ Phương sai tính cộng (VA) chiều cao chiều dài bắp 14 l ần phương sai tính trội (VD), ngược lại, quần thể ngô thụ phấn tự do, phương sai tính cộng tính trạng số ngày tung phấn Mặc dù khơng có thơng tin sẵn có phương sai kiểu gen chiều dài bắp, gi ả đ ịnh phương sai tương tự với chiều cao vậy, V D nhỏ nhiều so với VA Tiếp tục tự thụ giả sử khơng có chọn lọc, giá trị mong đợi phương sai kiểu gen dòng F6 1, 875V A 0, 0586VD, VA VD ám tới hệ F2 Do đó, phương sai tính trội mong chờ thấp h ệ F2 giảm đáng kể đời F6, đóng góp V D đến phương sai F6 xem khơng đáng kể Vì vậy, chúng tơi ước l ượng phương sai tính c ộng () hệ F2 /1, 875, đó, thành phần phương sai ước lượng RIL hệ F6 Sự đóng góp V D đến phương sai đời xem không đáng kể phương sai kiểu gen dư đời () xác định /16 Tổng sai sót diện tích sản phẩm lai lỗi thu từ RELM đa biến dùng để tính tốn tương quan lại tính tr ạng Nh ững h ệ s ố tương quan tương quan mơi trường chính, trung bình tất ki ểu gen cho phương sai kiểu gen nhỏ dòng (b) Ước lượng đa hình mơi trường tương quan RIL (mơ hình 2) Theo mơ hình nhỏ, phương sai ki ểu gen dư cho tất c ả RIL, tính đa dạng phương sai dư RIL tính đa d ạng c VE Trong thí nghiệm chúng tơi, khối tương đối đồng nhất, kích thước chúng, số sai khác mơi trường có th ể tồn chúng Tuy nhiên, chúng tơi có năm khối RILs chọn ngẫu nhiên kh ối, giả định tác động mơi trường trung bình t ương t ự cho tất RILs Do đó, khác biệt phương sai dư RIL xem khác biệt chúng ều ki ện vi môi tr ường d ễ thay đổi Số lượng hàng khác số không phát tri ển Sự khác số lượng gây độ sai l ệch môi tr ường tác đ ộng lên phương sai sai số Để kiểm tra ảnh hưởng số lượng lên phương sai dư, chúng tơi tiến hành hồi quy tuyến tính phương sai dư kết h ợp RIL x lặp lại chống lại với số sống sót h ồi quy ến tính c phương sai dư cộng gộp RIL so với số s ống sót RIL Sự thay đổi phương sai dư giải thích thay đổi số lượng không đáng kể (r2 chúng tơi kết luận khác biệt phương sai dư gi ữa RIL khơng khác biệt chúng số sống sót Để kiểm tra xem phương sai dư RILs khác biệt đáng kể hay không, phép phân tích phương sai (ANOVA) thưc 129 RIL V Ei (phương sai dư RIL i) ước lượng từ diện tích trung bình Ngun nhân biến đổi trình tái thực vật sinh sản diện tích trung bình tương ứng v ới nguyên nhân thay đổi tương ứng , chẳng hạn ước tính VEi Để kiểm tra tính đồng phương sai dư RIL sử dụng tiêu chuẩn Barlett, M = () ln- ln (Steel cộng sự, 1997) với = / Ki ểm tra s ố liệu thống kê Bartlett, M phân phối chi bình phương VEi đồng đối tượng phân phối chuẩn nhiên thay giả thuyết M phân ph ối chi bình phương, u cầu giả thuyết thơng thường, ta ước lượng M phân phối ngẫu nhiên Giá trị phương sai dư độ tự phân phối cho RILv ới lần lặp lại, gộp phương sai lại với độ tự th ực hi ện m ỗi RIL Ngẫu nhiên phương sai dư độ tự số không cân đối thí nghiệm Sử dụng việc gộp phương sai dư độ tự do, M tính tốn miêu tả từ trước giá trị ghi lại Lấy ngẫu nhiên lặp lặp lại 1000 lần để có phân phối M s ự đ ồng phương sai sở để kiểm tra tầm quan trọng M Để định lượng tính khơng đồng di truyền (dị gen) phương sai môi trường, phương sai hàng () phương sai dư k ết h ợp c RIL tái ước lượng giả thuyết phương sai dư (VE) tái x RIL tổng hợp phương sai dư trung bình, độ lệch chuẩn ảnh hưởng RIL, ảnh hưởng tái ảnh hưởng tự cơng thức viết: =++ + i=1, 129, j= 1, trung bình phương sai dư ảnh h ưởng ng ẫu nhiên với trung bình phương sai Nguồn gốc phương sai, cụ thể RIL, tái tương tác giữ chúng ước tính cách sử dụng VARCOMP th ủ tục SAS Chúng tiến hành phân tích sử dụng phương sai dư biến đổi RIL x tái tập hợp với logarit tự nhiên giá tr ị S ự không đ ổi c giá tr ị 10 sử dụng để rõ ràng tầm quan trọng phương sai không đổi giá trị log đạt nhiều sai sót đồng Trong phân tích không đổi phương sai, phương sai thành phần liên kết với RIL () sử dụng để ước lượng phương sai dựa phương sai dư RIL, E (cơng thức 1, bảng 2) để ước lượng µ phương sai dư RIL ( ước lượng /trong phân tích khơng đổi phương sai log mà phương sai hệ s ố hệ số cân phương sai (Rowe cộng sự, 2006) ước lượng hệ số gốc phương sai thành phần liên kết với RIL giả sử tính cộng đòi hỏi di truyền phương sai môi trường tăng với hệ nội phối từ 1.875 lần F2, hệ số di truyền phương sai môi trường () đ ược ước lượng / Để kiểm tra ảnh hưởng cân số lượng ước lượng, lặp lại phân tích lần 2: hàng nhiều h ơn, m ỗi hàng nhiều trường hợp, tìm ước l ượng tương đồng thu sử dụng tất kiện, bi ểu thị tác động khơng đồng khơng quan trọng Mỗi RIL, sai số tổng diện tích phép lai c ặp tính tr ạng đ ạt đ ược t phân tích ANOVA dụng tính tốn hệ số tương quan tất cặp tính trạng S2xyi/ Mỗi cặp tính trạng, chúng tơi kiểm tra tính đồng h ệ số tương quan với Sự tái thành phần RIL tính tốn, cho m ỗi RIL, biến nạp Zi = 0.5ln[ (1 + ri)/ (1- ri)] với xấp xỉ phân phối thông thường với phương sai 1/ (di-1) di sai số bậc tự từ phân tích ANOVA (Steel cộng sự) 11 Kiểm tra tiêu chuẩn C C=)]2 với Zw = tiêu chuẩn phân phối chi bình phương với 128 bậc tự dnếu Zi đồng phân phối thường, theo phân phối thường, phân phối chuẩn C ước lượng ngẫu nhiên tương đương phân phối chuẩn cho ki ểm tra đ ồng phương sai c) Vị trí QTL liên kết với phương sai mơi trường tương quan Mục đích cơng thức đặt QTL vào ảnh hưởng phương sai môi tr ường/ tương quan môi trường định lượng ảnh hửơng Tại m ỗi marker, x ấp x ỉ ½ RIL đồng hợp allen A từ EP39 ½ nửa đồng hợp từ allen B EP42 Tại marker, công thức áp dụng riêng cho phần RIL v ới RIL, tái bản, phương sai môi trường tương quan môi trường cặp tính trạng ước lượng Do marker ướclượng V E cho RIL với allen A VE cho RIL với allen B lượng lớn giá trị chia nhỏ đề đạt th ống kê F, xác suất giá tr ị cân cao giá trị F (P≤ F) đạt hoán v ị (Churchill & Doerge, 1994) nhiều dựa vào quan sát thông thường Hồn vị s dụng b ởi marker liên kết kiểm tra ảnh hưởng liên kết marker khơng đ ộc lập Kiểu hình RIL xáo trộn ngẫu nhiên ki ểu gen, gi ữ ki ểu gen liên k ết với gốc marker thơng tin tính trạng giá tr ị tự nhiên phân chia qua kiểu gen Chúng tơi tính toán giá trị F cho marker ghi chép giá tr ị l ớn nh ất c F tất marker lặp lại trình 1000 lần 12 Như đạt phân phối F, ước lượng experimentwise ??? xác suất giá trị quan sát Mỗi marker, the sai số diện tích phép lai gi ữa tính tr ạng đ ược bi ến đ ổi ANOVA sử dụng tính trạng hệ số tương quan tính trạng S 2xyi /cho RIL với allen A khác allen B Kiểm tra giả thuyết ước lượng tương quan từ quần thể, thay đổi từ Z trên, kiểm tra tiêu chuẩn T= (ZA-ZB)/ tính tốn xác suất giá trị cân lớn quan sát T (P≥ T) đ ược hoán v ị b ằng hoán trị tương đương bảng 1: trung bình, S.D, giá trị lớn nhất, nhỏ chi ều cao cây, chi ều cao hoa, chiều dài tua ngày phun hạt phấn Tính trạng Chiều cao (cm) Chiều cao hoa (cm) Chiều dài tua (cm) Ngày phun phấn (ngày) Giá trị trung bình 130.3 44.84 43.56 60.22 Độ lệch chuẩn 28.07 13.30 9.288 3.402 Giá trị lớn 20 48 Giá trị 231 102 80 81 nhỏ d) Vị trí QTL liên kết với trung bình đặc điểm Phát QTL liên kết với trung bình tinhý trạng th ực hi ện b ởi nhân tố đơn ANOVA Một locut marker chịu ANOVA với dạng phương sai:s ố lần lặp l ại, allen, s ố lần lặp lại x allen, RIL (allen), RIL (allen) x tái sai s ố c nh ững đơn lẻ số lần lặp lại, allen, số lần lặp lại x allen, RIL (allen), RIL (allen) x s ự tái đề cập nhân tố allen đề cập gắn vào 13 ANOVA bao gồm thống kê F kiểm tra ảnh hưởng allen tính b ởi Mixed thủ tục SAS, dựa nguyên tắc rộng rãi diện tích ước l ượng kiểm tra vị trí ảnh hưởng Kiểm tra hốn vị tương tự sử dụng cho phương sai tương quan ước lượng thí nghiệm kiểm chứng lúc đầu Bảng 2: ước lượng phương sai thành phần: phương sai số lần lặp lại (V R), phương sai kiểu gen (VG), tương tác kiểu gen x số lần lặp lại (V I) phương sai môi trường (VE) Tính cộng (VA= VG/ 1.875) phương sai dư RIL (VA/16) trình bày Chiều cao Chiều cao hoa Chiều dài Ngày tung phấn tua 16.10 8.160 4.317 0.1346 21.09 3.339 44.79 7.540 VG VR VI VE 152.7 144.8 220.0 298.5 VA RIL 81.44 5.09 59.61 14.89 35.68 68.03 Biến dị di truyền dự đoán 31.79 8.587 1.99 0.540 4.352 0.272 Kết Tính trạng trung bình, S.D, giá trị lớn nh ững đ ặc ểm qu ần th ể RIL thể bảng i) phân tích giả định tính đồng phương sai m ối tương quan mơi trường Dự tốn thành phần phương sai trình bày bảng 2, tất c ả tính trạng, đặc điểm ước lượng phương sai kiểu gen có mức ý nghĩa >0 (F test, P