bài giảng vi sinh vật thực phẩm

MỤC LỤC Chương I: MỞ ĐẦU II.1 Giới thiệu môn vi sinh thực phẩm II I.2 Lịch sử phát triển ngành vi sinh thực phẩm Chương II: CÁC QUÁ TRÌNH VI SINH QUAN TRỌNG LIÊN QUAN ĐẾN CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỰC PHẨM .6 II.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN KỴ KHÍ .6 II.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN HIẾU KHÍ 21 II.3 QUÁ TRÌNH THỐI RỮA .26 Chương III: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CỦA THỰC PHẨM ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 31 III.1 Nhóm yếu tố nội sinh .31 III.2 Nhóm yếu tố ngoại sinh 41 III.3 Tác động qua lại yếu tố thực phẩm: 45 Chương IV: HỆ VI SINH VẬT THỰC PHẨM TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM QUAN TRỌNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN 47 IV.1 VI SINH VẬT CỦA THỊT 47 IV HỆ VI SINH VẬT CÁ 50 IV.3.HỆ VI SINH VẬT CỦA TÔM, MỰC, ĐỘNG VẬT THÂN MỀM 55 IV.4 HỆ VI SINH VẬT SỮA 57 IV.5 HỆ VI SINH VẬT CỦA TRỨNG GIA CẦM 62 IV.5 Đặc điểm trứng 62 IV.5 Hệ vi sinh vật trứng 63 IV.5.3 Sự hư hỏng trứng .63 IV.5.4 Bảo quản trứng 64 IV.6.HỆ VI SINH VẬT CỦA RAU QUẢ 64 IV.6.1 Đặc điểm rau 64 IV.6.2 Hệ vi sinh vật rau 65 IV.6.3 Sự hư hỏng rau 65 IV.6.4 Bảo quản rau qủa .65 IV.6.5 Hệ vi sinh vật số sản phẩm rau .66 IV.7 HỆ VI SINH VẬT HẠI NÔNG SẢN 67 IV.7 Đặc điểm nông sản .67 IV.7 Hệ vi sinh vật hại nông sản 67 IV.7 phương pháp bảo quản nông sản .68 IV.8 HỆ VI SINH VẬT CỦA BỘT VÀ BÁNH MÌ 69 IV.8 1.Vi sinh vật bột 69 IV.8 Ảnh hưởng vi sinh vật đến phẩm chất bột bảo quản 69 IV.8 Vi sinh vật sản xuất bánh mì 70 IV.8.4 Hệ vi sinh vật bánh mì 71 IV.8.5 Hư hỏng bánh vi sinh vật 71 Chương V: VI SINH VẬT GÂY BỆNH VÀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 73 V.1 VI SINH VẬT GÂY BỆNH 73 V.2 BỆNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM .77 V.3 CÁC BIỆN PHÁP NGĂN NGỪA BỆNH QUA ĐƯỜNG THỰC PHẨM 81 CHƯƠNG VI: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM 84 VI.1 Các tiêu vi sinh vật thực phẩm 84 VI.2 Kiểm tra vi sinh vật nguyên liệu thực phẩm thực phẩm 90 VI.3 Phương pháp thu, bảo quản chuẩn bị mẫu thực phẩm: 91 VI.4 Các phương pháp định lượng vi sinh vật: .92 VI.5 Các thử nghiệm sinh hóa: 94 VI.6 Các phương pháp truyền thống phân tích tiêu vi sinh vật: 97 VI.7 Các phương pháp không truyền thống: .99 I Chương I: MỞ ĐẦU II I.1 Giới thiệu môn vi sinh thực phẩm I.1.1 Một số khái niệm Vi sinh vật tên gọi chung sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường khơng nhìn thấy được, quan sát chúng kính hiển vi Vi sinh vật gồm nhiều nhóm khác nhau: virus, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, protozoa, tảo Thực phẩm chất mà người nuốt tiêu hoá để cung cấp chất dinh dưỡng lượng cho trình sinh trưởng phát triển thể Thực phẩm bao gồm nhiều loại tồn nhiều dạng khác như: nước, thịt, cá, trứng, sữa, rau quả… Thực phẩm vật thể sống sản phẩm qua chế biến từ nguyên liệu ban đầu I.1.2 Yêu cầu môn vi sinh thực phẩm Sau học xong mơn học học viên phải hình thành lực sau: a Về kiến thức  Nhận thức vai trò vi sinh vật chế biến bảo quản thực phẩm Cũng tác hại vi sinh vật chúng nhiễm vào thực phẩm  Nắm vững số nhóm vi sinh vật có ý nghĩa sản xuất thực phẩm, chế hoạt động chúng, ứng dụng sản xuất, chế biến bảo quản thực phẩm b Về kỹ Biết liên hệ, vận dụng vào thực tế sản xuất sống chế biến bảo quản thực phẩm Có kỹ cơng tác kiểm nghiệm tiêu vi sinh thực phẩm c Về thái độ  u thích mơn vi sinh thực phẩm với mong muốn khám phá đặc tính tiềm ẩn giới vi sinh vật kỳ diệu ảnh hưởng lên thực phẩm  Có lực tự học, tự nghiên cứu để nâng cao hiểu biết ứng dụng vi sinh vật ngành thực phẩm III I.2 Lịch sử phát triển ngành vi sinh thực phẩm Mãi đến năm 1800 mối liên quan giữ thực phẩm vi sinh vật phát Sau khám phá Pasteur số nhà vi sinh vật khác thời kỳ phát triển mạnh mẽ ngành cơng nghiệp lên men Ta xem xét số giai đoạn sau: Giai đoạn trước Pasteur (1860): phát ứng dụng số trình lên men thực phẩm như: làm mắm, làm nước tương, muối chua rau quả, làm bánh mì… Cuối giai đoạn người biết lên men hiếu khí để sản xuất giấm Từ phát triển bước lớn lĩnh vực nuôi cấy vi sinh vật vệ sinh thực phẩm Giai đoạn 1806-1900: phát thêm trình lên men lactic ứng dụng rộng rãi trình vào đời sống thực tiễn Phát triển nuôi cấy thu sinh khối cách thổi khơng khí vào mơi trường lỏng Giai đoạn 1900-1920: cơng nghiệp sản xuất glyxerin, axeton, butanol phát triển mạnh mẽ Giai đoạn 1920-1940: thiết bị lên men hoàn thiện dần Phát số trình lên men khác sản xuất sorboza, gluconic Trong giai đoạn người ta biết khử trùng khơng khí trước cung cấp cho q trình lên men hiếu khí Giai đoạn 1940-1950: trình sản xuất kháng sinh phát hiện, đặc biệt trình sản xuất penicillin Bên cạnh sản xuất vitamin B12 riboflavin Giai đoạn 1950-1960: giai đoạn hồn thiện cơng nghệ sản xuất kháng sinh bắt đầu công nghệ sản xuất axit amin enzyme Giai đoạn 1960 đến nay: giai đoạn phát triển mạnh mẽ việc sản xuất axit amin, enzyme, đồng thời hoàn thiện toàn thiết bị lên men Quá trình lên men ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm, y học, nông nghiệp… I.3 Tác động vi sinh vật thực phẩm: I.3.1 Gây hư hỏng thực phẩm: Hệ vi sinh vật thực phẩm phát sinh từ nhiều nguồn khác nhau: - Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ mơi trường bên ngồi, tay cơng nhân, dụng cụ, trình chuyên chở, bảo quản… - Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ thân nguyên liệu I.3.2 Thực phẩm mang vi sinh vật gây bệnh Khi ăn phải loại thực phẩm mang vi sinh vật gây bệnh độc tố chúng gây nhiều bệnh cho thể người động vật để lại hậu nghiêm trọng chí dẫn đến tử vong Các bệnh thường gặp thương hàn vi khuẩn Salmonella, tả Shigella, lao Micobacterium, Ngồi dẫn đến triệu chứng ngộ độc nghiêm trọng ăn phải độc tố vi khuẩn độc tố botulin vi khuẩn độc thịt Clostridium botulinum, độc tố vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus I.3.3 Ứng dụng có lợi vi sinh vật chế biến thực phẩm Trong thực tế đời sống người ta biết lợi dụng biến đổi có lợi vi sinh vật để tạo sản phẩm thực phẩm có chất lượng phù hợp cho nhu cầu dinh dưỡng ngày cao người Như sử dụng sinh khối vi sinh vật làm nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng, ứng dụng trình lên men rộng rãi việc sản xuất loại thực phẩm quan trọng như: rượu, bia, nước giải khát, bánh mì, nước mắm, mì chính,…cũng làm gia tăng giá trị dinh dưỡng loại thực phẩm tempeh, natto… lên men từ đậu nành Chương II: CÁC QUÁ TRÌNH VI SINH QUAN TRỌNG LIÊN QUAN ĐẾN CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỰC PHẨM II.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN KỴ KHÍ Lên men kỵ khí vi sinh vật kỵ khí kỵ khí tùy tiện gây II.1.1 Lên men rượu: Lên men rượu q trình phân giải đường thành rượu khí cacbonic tác dụng vi sinh vật Trong tất q trình chuyển hóa glucid vi sinh vật gây ra, lên men rượu ứng dụng rộng rãi công nghiệp, ứng dụng có từ thời xưa sơ để sản xuất rượu vang, bia nước uống giải khát lên men khác II.1.1.1 Cơ chế trình lên men rượu Phương trình tổng quát trình sau: C6H12O6 + 2(P) + 2ADP = 2C2H5OH + 2CO2↑ + 2ATP (glucoza) (rượu etylic) Sự lên men thông thường: mơi trường có pH từ đến 5, chia thành thời kỳ khác nhau: Thời kỳ cảm ứng: - Lượng acetaldehyt (CH3CH=O) tạo thành - Ion H+ chuyển từ NADH2 đến glyxeraldehyt-3-photphat để tạo thành glyxerin 3-photphat - Sau glyxerin 3-photphat bị gốc photphat để tạo thành glyxerin NADH2 NAD+ -P Glyxeracetaldehyt–3–photphat Glyxeryl–3–photphat Glyxeryl Thời kỳ tĩnh: - Khi lượng acetaldehyt (CH3CH=O) tạo thành đạt lượng định, - Axetaldehyt bị khử tạo thành rượu etylic Glyxerin tạo thành từ thời kỳ cảm ứng sản phẩm phụ lên men mơi trường axit Phương trình tổng qt q trình sau: C6H12O6 + 2(P) + 2ADP = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Sự lên men điều kiện kiềm yếu: Nếu tiến hành kiềm hố mơi trường Na2CO3, K2CO3 hay (NH4)2CO3 axetaldehyt vừa bị khử vừa bị oxi hố, chất nhận H2 từ NADH glyxeraldehit 3-photphat kết tạo thành glyxerin Như môi trường kiềm ta thu glyxerin, axit axetic rượu etylic Phương trình tổng quát sau: CH2OH 2C6H12O6 + H2O  CHOH + CH3COOH + C2H5OH + 2CO2 CH2OH (glucoza) (glyxerin) (axit acetic) Nếu thêm NaHSO3 vào mơi trường kết hợp với axetaldehyt thành acetaldehitbisulfitnatri khó tan Khi khơng có axetaldehyt làm chất nhận H2, lúc chất nhận H2 Dioxyacetonphotphat Kết tạo thành glyxerin Phương trình tổng quát trình sau: CH2OH OH C6H12O6 + NaHSO3  CHOH + CH3 - CH CH2OH + CO2↑ SO3Na↓ II.1.1.2.Vi sinh vật lên men rượu a Nấm men Nấm men tác nhân gây nên trình lên men rượu, nhiên khơng phải lồi lên men đường thành rượu mà có số lồi có khả Trong sản xuất người ta thường dùng số lồi thuộc họ Saccharomycesaceae Theo đặc tính lên men người ta chia nấm men thành hai nhóm: nấm men lên men nấm men lên men chìm Nấm men nổi: nấm men có cường lực lên men nhanh mạnh Nhiệt độ thích hợp cho nấm men sinh trưởng từ 20 ÷ 28oC, có tốc độ lên men lớn, lượng đường tiêu thụ nhiều Do sinh nhiều khí CO nên tế bào nấm men theo CO lên bề mặt, nấm men hoạt động mạnh lên men phân tử đường bề mặt Người ta thường sử dụng để sản xuất cồn bánh mì Tiêu biểu lồi Saccharomyces cerevisiae Nấm men chìm: nấm men có cường lực lên men yếu, nhiệt độ thích hợp từ ÷ 10 oC Trong q trình lên men lượng khí CO2 tạo nhiệt độ thấp nên giữ lại dung dịch lên men Nấm men tiếp xúc sau lên men chúng tạo thành váng cặn đáy thùng Quá trình lên men chậm xảy từ từ Tiêu biểu lồi Saccharomyces ellipsoideus Nấm men chìm thường dùng sản xuất bia, rượu vang, sâmpanh b Nấm mốc Nếu sản xuất rượu từ tinh bột phải qua bước đường hoá tức giai đoạn chuyển tinh bột thành đường Ngày người ta thường sử dụng nấm mốc cho giai đoạn Nấm mốc cho enzyme amylase để chuyển tinh bột thành đường Hiện người ta thường sử dụng số loài nấm mốc sau: Aspergillus oryzae: nấm mốc có màu vàng, bào tử hở Đặc điểm có hệ enzyme amilase protease Được sử dụng rộng rãi sản xuất tương nước chấm Aspergillus usamii: nấm mốc có màu xám trắng, giàu enzyme amylase Được sử dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất rượu Aspergillus awamori: nấm mốc có màu xám đen giàu enzyme amylase Được ứng dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất rượu Mucor rouxii: thường có màu xám trắng, sử dụng rộng rãi nhà máy rượu sản xuất theo phương pháp amilo Khác với lồi phải ni cấy môi trường đặc, Mucor phát triển tốt môi trường lỏng tạo nhiều enzyme amylase c Vi khuẩn: II.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men rượu a Nồng độ đường Tất nấm men có khả lên men đường đơn giản đường đơn (glucose, fructose) đường đôi (maltose, saccarose) riêng đường lactose có nấm men Saccharomyces lactic sử dụng Nấm men hồn tồn khơng có khả thủy phân loại đường đa Nồng độ đường thích hợp cho q trình lên men rượu từ ÷ 20% Khi nồng độ đường lớn 30% ức chế trình lên men rượu Tuỳ thuộc vào sản phẩm trình lên men mà người ta sử dụng nồng độ đường thích hợp Trong sản xuất cồn người ta sử dụng nồng độ đường từ 14 ÷ 20%, trình lên men xảy mạnh hết lượng đường sau người ta chưng cất để thu cồn Đối với việc sản xuất rượu vang người ta sử dụng nồng độ đường từ 16 ÷ 25% dùng nấm men chìm, nên trình lên men chậm sau lên men lượng đường rượu rượu vang thường có vị Còn sản xuất bia thường dùng nồng độ đường từ ÷ 12% b Oxy Nấm men loại vi sinh vật hô hấp tùy tiện Trong điều kiện hiếu khí với có mặt oxy xảy phương trình phản ứng sau: C6H12O6 + 6O2 6H2O+ 6CO2 + Q1 → gia tăng sinh khối Chỉ điều kiện yếm khí tiến hành lên men rượu theo phương trình: C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2 + Q2 Vì có mặt oxy kiềm hãm trình lên men rượu Hiệu ứng Pasteur: ức chế trình lên men rượu có mặt oxy Sự chuyển từ lên men sang hơ hấp ngồi việc giảm hiệu suất tạo thành rượu khí cacbonic giảm hiệu suất sử dụng đường Vì giai đoạn đầu trình lên men cần thơng khí vào mơi trường để kích thích nấm men sinh trưởng tăng sinh khối sau khơng cần oxy để tạo điều kiện kỵ khí cho trình lên men rượu đạt hiệu suất cao c Độ rượu Rượu tích tụ dần dịch lên men lại chất độc kìm hãm nấm men Nấm men chịu nồng độ cồn từ ÷ 12%, từ 16 ÷ 18% đại đa số nấm men bị ức chế Nếu nồng độ cồn cao ức chế tất nấm men Khả chịu cồn nấm men nồng độ cồn ức chế phát triển hoạt động nấm men sau 72 nuôi cấy nhiệt độ 30oC Tuỳ theo khả chịu nồng độ cồn khác mà người ta sản xuất sản phẩm khác d Độ pH Độ pH mơi trường có ý nghĩa quan trọng trình lên men rượu Tuỳ thuộc vào sản phẩm thu mà người ta điều chỉnh pH mơi trường cho thích hợp  pH mơi trường axit sản phẩm thu rượu etylic  pH mơi trường axit yếu sản phẩm thu rượu etylic glyxerin  pH mơi trường kiềm yếu sản phẩm thu rượu etylic, axit axetic glyxerin Bình thường lên men rượu thực pH= ÷ 4,5 Để axit hóa mơi trường người ta thường dùng H 2SO4 axit lactic để tạo pH thích hợp cách cấy vi khuẩn lactic vào sau trùng cấy nấm men vào e Nhiệt độ Tuỳ thuộc vào nấm men hay nấm men chìm mà điều chỉnh nhiệt độ mơi trường cho thích hợp Đối với nấm men nhiệt độ thích hợp từ 20 ÷ 28oC, nấm men chìm nhiệt độ thích hợp từ ÷ 10 oC Ngoài nhiệt độ từ 28 ÷ 30oC rượu bay làm cho trình lên men xảy nhanh II.1.1.4 Ứng dụng a Sản xuất rượu cồn Sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột gạo, sắn, ngô… Người ta thuỷ phân tinh bột thành đường axit, kiềm hay enzyme sau lên men đường thành rượu nhờ nấm men Sản xuất từ nguyên liệu rỉ đường thường có từ 35 ÷ 40% đường Trước lên men phải pha lỗng xuống từ 14 ÷ 20% 10 Nhóm nước chấm: Nguồn gốc động vật: nước mắm Nguồn gốc thực vật Nhóm thức ăn khơ chứa dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt: Phải xử lý nhiệt trước sử dụng Dùng trực tiếp khơng qua xử lý nhiệt Kem, nước đá Nhóm đồ hộp Nhóm dầu mỡ 104 102 10 102 10 10 102 102 10 104 10 10 10 104 0 10 0 102 10 104 105 10 10 10 10 0 TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E.coli; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella; BCE: Bacillus cereus; COL: Coliforms; CPE: Clostridium perfringens; VPA: Vibrio parahaemolyticus; NM – MO: tổng số nấm men, nấm mốc; SFA: Streptococcus faecalis; PAE: Pseudomonas aeruginosa; CBO: Clostridium botulinum; G.M.P: Goof Manufacturing Practice: quy phạm sản xuất GMP 90 VI.2 Kiểm tra vi sinh vật nguyên liệu thực phẩm thực phẩm a Kiểm tra vi sinh vật nước: Nước coi dạng nguyên liệu đặc biệt chế biến số loại thực phẩm Mặt khác nước coi nguồn lây nhiễm vi sinh vật chế biến thực phẩm Người ta chia nước làm ba loại dựa liên quan đến vi sinh vật: - Nước sát khuẩn - Nước chưa sát khuẩn - Nước thải Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật nước bao gồm: - Tổng số vi sinh vật hiếu khí - Tổng số E.coli - Clostridium perfringens - Phagơ - Vi khuẩn gây bệnh b Kiểm tra vi sinh vật nước giải khát: Kiểm tra vi sinh vật nước giải khát bao gồm: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí - E.coli - Clostridium perfringens - Nấm mốc - Vi khuẩn gây đục - Vi khuẩn gây bệnh c Kiểm tra vi sinh vật bia: Kiểm tra vi sinh vật bia bao gồm: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí - E.coli - Nấm men - Clostridium perfringens - Vi sinh vật làm đục bia d Kiểm tra vi sinh vật sữa: Kiểm tra vi sinh vật sữa bao gồm: - Tổng số vi sinh vật hiếu khí - Tổng số vi sinh vật kỵ khí - Vi sinh vật gây bệnh - kiểm tra sơ xanh metylen e Kiểm tra vi sinh vật đồ hộp  Kiểm tra vi sinh vật đồ hộp động vật - Vi sinh vật hiếu khí - Vi sinh vật kỵ khí 91 - Clostridium botulinum độc tố - Vi sinh vật chịu nhiệt  Kiểm tra vi sinh vật đồ hộp thực vật - Tổng số vi sinh vật hiếu khí - Tổng số bào tử vi sinh vật hiếu khí - Vi khuẩn E.coli - Vi sinh vật sinh H2S - Vi khuẩn chịu nhiệt f kiểm tra vi sinh vật nước mắm, nước chấm: - Vi sinh vật hiếu khí - E.coli - Trực khuẩn kỵ khí sinh H2S - Trực khuẩn hiếu khí sinh H2S VI.3 Phương pháp thu, bảo quản chuẩn bị mẫu thực phẩm: VI.3.1 Phương pháp thu, bảo quản mẫu thực phẩm: Tiêu chuẩn quy định mật độ cho phép vi sinh vật thực phẩm thay đổi tùy theo nhòm vi sinh vật cần phân tích, đối tượng thực phẩm, tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia Đối với vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thường không cho phép diện vi sinh vật đơn vị khối lượng thực phẩm Trường hợp cần định tính diện vi sinh vật Thông thường, tiêu chuẩn quy định mật độ vi sinh vật cho phép diện khối lượng thực phẩm xác định Trong trường hợp cần tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật diện mẫu thực phẩm Tuy nhiên kết phân tích, định lượng vi sinh vật mẫu thực phẩm thường khơng phản ánh xác mật độ vi sinh vật thực tế diện mẫu vậy, thông thường cần thực việc định lượng mẫu số lượng mẫu xác định sử dụng khoảng giới hạn quy ước để nhận định kết như: - Khoảng chấp nhận: mật độ vi sinh vật nhỏ trị số m - Khoảng không chấp nhận: mật độ vi sinh vật lớn trị số M - Khoảng lân cận giới hạn: mật độ vi sinh vật lớn m nhỏ M Dựa vào tiêu chuẩn quy định, người phân tích cần có kế hoạch (thơng số khối lượng số lượng) mẫu thích hợp Các thơng số thay đổi tùy thuộc vào độ nguy hiểm loại thực phẩm có diện vi sinh vật gây bệnh Kết phân tích, định lượng phụ thuộc nhiều vào phương pháp quy trình thu mẫu a Dụng cụ thu, chứa mẫu: Dụng cụ thu, chứa mẫu thay đổi tùy loại thực phẩm phải vơ trùng để bảo đảm tính xác phương pháp định lượng Khối lượng cần thu mẫu thay đổi tùy thuộc khối lượng tiêu cần phân tích Mẫu cần phải đảm bảo tính đại diện dụng cụ chứa mẫu thường bình nhựa có nắp nhơm hay chất dẻo, bao nilon chứa mẫu Tránh sử dụng bình thủy tinh dễ vỡ 92 b Vận chuyển bảo quản mẫu: Mẫu sau thu bảo quản cách độc lập với thùng bảo quản mẫu làm lạnh bao nước đá Nước phải kho tan chảy suốt trình vận chuyển mẫu phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm mẫu chuyển vào tủ đơng phân tích Nếu khơng phân tích ngay, mẫu phải bảo quản - 20oC phân tích Trường hợp mẫu khơng thể bảo quản đơng bảo quản tủ lạnh – 4oC không 36 Các loại thực phẩm đồ hộp hay loại thực phẩm khó hư hỏng bảo quản nhiệt độ phòng đến phân tích VI.3.2 Chuẩn bị mẫu: a Giải đông mẫu: mẫu đông lạnh cần giải đông điều kiện vơ trùng trước phân tích Việc giải đông thực nhiệt độ – 5oC khoảng 18 giờ, cần thiết giải đông nhanh 45 oC 15 phút phải lắc liên tục b Đồng mẫu: mẫu cần làm đồng trước phân tích phân bố không vi sinh vật bên mẫu việc đồng tiến hành điều kiện vô trùng, lắc mẫu lỏng đảo trộn thiết bị dập mẫu mẫu rắn c Cân mẫu: cân xác lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu tiêu phân tích Sai số cho phép ±0,1g VI.4 Các phương pháp định lượng vi sinh vật: Sự diện vi sinh vật định lượng nhiều phương pháp khác nhau, trực tiếp đếm kính hiển vi, gián tiếp thơng qua phương pháp đo độ đục, đếm số khuẩn lạc mọc môi trường xác định, định lượng cách thống kê phương pháp pha loãng tới hạn (MPN) a Phương pháp đếm trực tiếp: buồng đếm kính hiển vi Thường áp dụng để xác định mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn nấm men, tảo… Ưu điểm: Quy trình cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa mẫu Nhược điểm: - Không phân biệt tế bào sống tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với vật thể khác mẫu - Khó đạt độ xác cao - Khơng thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp Ta có phương pháp đếm trực tiếp sau: - Đếm buồng đếm hồng cầu - Đếm buồng đếm Breed - Đếm kính hiển vi huỳnh quang b Phương pháp đếm khuẩn lạc: cho phép xác định mật độ tế bào sống diện mẫu Tế bào sống tế bào có khả phân chia tạo 93 thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Phương pháp cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường điều kiện nuôi cấy Trong phương pháp cần thực pha loãng mẫu thành nhiều độ pha lỗng bậc 10 liên tiếp cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để xuất khuẩn lạc riêng lẻ bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số đếm tính tốn Mật độ tế bào q lớn làm khuẩn lạc chồng chéo lên tạo thành màng sinh khối, ngược lại số lượng khuẩn lạc q nhỏ lại khơng có ý nghĩa thống kê Số lượng khuẩn lạc tối ưu khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa Số lượng khuẩn lạc xuất đĩa tùy thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường điều kiện ủ Các tế bào đĩa khơng tăng trưởng hình thành khuẩn lạc với tốc độ nhau, nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc thời gian ủ không đủ dài Thông thường điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo cho số khuẩn lạc xuất tối đa Phương pháp dễ sai số nên cần thực lặp lại hai đĩa Ngồi ra, có khả nhiều tế bào hình thành chung khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc khơng biểu xác số tế bào ban đầu đưa vào môi trường, nên kết đếm mật độ tế bào trình bày số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit) CFU/g thay số tb/ml Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật mật độ thấp mẫu Quy trình thao tác sau: - Pha loãng mẫu theo dãy thập phân - Tạo hộp trải hay hộp đổ - Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian thích hợp - Đếm khuẩn lạc tính kết Mật độ tế bào vi sinh vật mẫu ban đầu tính theo công thức sau: N A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: n1Vf1 + …+ niVfi A: số tế bào vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng c Phương pháp MPN (phương pháp tối khả): phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Phương pháp dùng để định lượng nhóm vi sinh vật nuôi cấy môi trường lỏng chọn lọc cho kết biểu kiến thích hợp Là phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha lỗng khác (Thơng thường, 94 lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3=9 ống nghiệm) Số lượng ống nghiệm lặp lại cao độ xác phương pháp lớn Quy trình thực phương pháp sau: - Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác định dung dịch mẫu nồng độ pha loãng liên tiếp - Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (phản ứng dương tính), ghi nhận số lượng độ pha loãng - Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu d Phương pháp đo độ đục: phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục máy so màu bước sóng từ 550 – 610 nm Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục dùng để so sánh mức độ tăng trưởng hai hay nhiều chủng vi sinh vật môi trường lỏng phương pháp cho kết nhanh chóng thường ứng dụng theo dõi nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng chủng vi sinh vật phòng thí nghiệm sản xuất nhiên khơng thích hợp dùng kiểm nghiệm vi sinh vật N A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: n1Vf1 + …+ niVfi A: số tế bào vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng VI.5 Các thử nghiệm sinh hóa: Người ta định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm sinh hóa đặc trưng lồi (hay nhóm) vi sinh vật Có ba cách tiếp cận để thực thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh cách truyền thống, cách sử dụng KIT dùng thiết bị tự động Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng thường sử dụng kiểm nghiệm vi sinh vật bao gồm:  Thử nghiệm khả lên men: nhằm xác định khả sử dụng nguồn cacbon định vi sinh vật để tăng trưởng Nguồn cacbon chia làm nhóm: đường đơn, đường đa rượu Khả lên men đánh giá làm giảm pH môi trường dẫn đến thay đổi màu thị pH mơi trường Ngồi ra, CO tạo thành bẫy lại 95         thành bọt khí ống chng Durham làm ống chuông (môi trường lỏng) làm vỡ thạch (môi trường rắn) Được dùng để định danh vi sinh vật đường ruột Thử nghiệm khả oxy hóa – lên men: gọi thử nghiệm Hugh – Leifson nhằm xác định vi sinh vật thử nghiệm biến dưỡng hydratcacbon theo phương thức oxy hóa hay phương thức lên men Thử nghiệm thực cách nuôi cấy chủng thử nghiệm môi trường Hugh – Leifson có glucose nguồn cacbon thị pH bromothymol blue Các sản phẩm có tính axit q trình lên men làm thay đổi màu thị Thử nghiệm Bile esculin: thử nghiệm phân biệt vi sinh vật dựa khả thủy phân liên kết glucoside esculin thành esculetin glucost có diện muối mật Esculetin phản ứng với muối sắt môi trường tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen Thử nghiệm khả biến dưỡng citrate: môi trường thử nghiệm khả biến dưỡng citrate sử dụng citrate làm nguồn cacbon có chứa muối ammonium dùng làm nguồn đạm làm tăng giá trị pH môi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường Thử nghiệm catalase:catalase enzyme chứa tế bào vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý Catalase thủy phân H 2O2 thành H2O O2 ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Sự giải phóng O2 ghi nhận thông qua tượng sủi bọt khí Thử nghiệm decacboxylase: thường dùng để định danh phân loại vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae Các vi sinh vật thường cảm ứng tạo thành enzyme decacboxylase mơi trường có tính axit có chất cảm ứng đặc hiệu (một loại axit amin đó: lizin, ornithin, arginin, …) tất trường hợp, CO sinh làm tăng pH môi trường ghi nhận qua đổi màu thị pH Thử nghiệm coagulase: số loài vi khuẩn đặc biệt nhóm Staphylococcus, có khả tiết mơi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ thành phần huyết tương Thử nghiệm dùng bước cuối tiêu thử nghiệm để định danh loài giống Staphylococcus: Staphylococcus aureus (+),Staphylococcus epidermidis (-) Thử nghiệm urease: số vi sinh vật có khả sinh tổng hợp urease để thủy phân ure Sự phóng thích NH3 CO2 làm tăng pH mơi trường theo dõi qua đổi màu chất thị pH Thử nghiệm urease đặc trưng cho loại Proteus spp Thử nghiệm gelatinase: số vi sinh vật có khả tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin môi trường nuôi 96        trường nuôi cấy Trong thử nghiệm này, phản ứng (+) môi trường đặc tan chảy thành dạng lỏng Thử nghiệm khả tăng sinh H2S: trình phân giải axit amin chứa lưu huỳnh khí H2S giải phóng, tạo tủa màu đen với thị sulfite có mơi trường Thử nghiệm khả sinh indol: số vi sinh vật có khả oxy hóa tryptophan thành sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa pDimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinon có màu đỏ Thử nghiệm KIA, TSI: môi trường KIA (Kligler Iron Agar) môi trường TSI (Triple Sugar Iron agar) sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả sử dụng nguồn cacbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S chủng vi sinh vật Nếu vi sinh vật lên men đường glucose sau 18 – 24 ni cấy mơi trường thạch nghiêng phần có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Nếu vi sinh vật lên men đường glucose lactose thị sau 18 – 24 tồn mơi trường có pH acid, mơi trường có màu vàng Nếu vi sinh vật khơng sử dụng hai nguồn cacbon có phần thạch chuyển sang màu đỏ Trong trường hợp lên men đường tạo sản phẩm khí làm vỡ thạch Thử nghiệm nitratase: Thử nghiệm nhằm xác định khả tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác khử nitrate thành nitrit nitơ phân tử vi sinh vật Thử nghiệm oxidase:thử nghiệm nhằm xác định diện hệ enzyme oxidase vi sinh vật Thử nghiệm ONPG: Xác định có mặt enzyme β-galactosedase có vai trò xúc tác thủy phân lactose tế bào vi sinh vật dựa vào chất tổng hợp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPD) Sự thủy phân chất đường β-galactosidase phóng thích o-nitrophenol có màu vàng Thử nghiệm MR (methyl red): Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa khác biệt khả tạo trì sản phẩm biến dưỡng có tính axit bền mơi trường trình lên men glucose Thử nghiệm MR phụ thuộc lớn vào thời gian nuôi cấy Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính tích lũy axit môi trường ngày nhiều, pH mơi trường ngày giảm Các vi sinh vật có phản ứng MR (-) tiếp tục chuyển hóa sản phẩm có tính axit thành sản phẩm trung tính, pH chuyển phía trung tính Chỉ thị metyl red giúp phân biệt nồng độ H + diện môi trường sau vi sinh vật lên men 97  Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer): thử nghiệm VP giúp phân biệt loài họ Enterobacteriaceae dựa oxi hóa acetoin  Thử nghiệm CAMP: Là phản ứng phối hợp nhân tố protein nhân tố β-hemolysin tiết chủng Staphyloccocus aureus gây tượng làm tan máu hồng cầu cừu bò mơi trường thạch máu Nếu thử nghiệm (+) xuất đường tan huyết phân biệt rõ với vùng sẫm màu lại mơi trường  Thử nghiệm tính di động: khả di động vi sinh vật theo dõi mơi trường thạch mềm ngồi ra, triphenyltetrazolium chloride (TTC) bổ sung vào môi trường để giúp phát dễ dàng vị trí diện tế bào vi sinh vật môi trường hợp chất vào bên tế bào bị khử thành formazan có màu đỏ Ngày thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật thực ỏ thuốc thử dạng đĩa giấy, que giấy Ngồi ra, có kit cho phép thực hàng loạt phản ứng sinh hóa theo quy trình lựa chọn để định danh vi sinh vật Các kit sản xuất dạng thương phẩm có ưu điểm ví dụ kit cho phép định danh số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền Ngồi ra, nhu cầu phân tích số lượng mẫu lớn thực tế công tác kiểm nghiệm nhanh để rút ngắn thời gian từ nhận mẫu đến có kết Do vậy, nhiều thiết bị chế tạo nhằm tự động hóa cơng tác kiểm nghiệm, đặc biệt không yêu cầu kiểm nghiệm viên phải có mặt để giám sát cơng việc, thực qua đêm VI.6 Các phương pháp truyền thống phân tích tiêu vi sinh vật: VI.6.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí: Chỉ số có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn Chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp nguyên liệu sản phẩm Từ đánh giá tình trạng vệ sinh điều kiện bảo quản sản phẩm dự đoán khả hư hỏng sản phẩm Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn tăng trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có diện oxy phân tử (O 2) Tổng số vi khuẩn hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm Chỉ số xác định phương pháp đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc sinh khối phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) đơn vị khối lượng thực phẩm VI.6.2 Coliforms Escherichia coli Coliforms trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh axit sinh 37 oC 24 – 48 giờ, diện rộng rãi tự nhiên, ruột người, động vật Chúng bao gồm: Escherichia coli, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp Số lượng diện chúng thực phẩm dùng để thị khả diện 98 vi sinh vật gây bệnh khác Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi chung IMViC - Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24 ủ 44oC môi trường canh EC - Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indol ủ khoảng 24 44,5 oC canh Trypton Dùng để thị mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm thị ô nhiễm phân Để định lượng coliforms ni cấy mơi trường lỏng (phương pháp MPN) môi trường thạch rắn chọn lọc phương pháp đếm khuẩn lạc VI.6.3 Staphylococcus aureus: a Định nghĩa nguyên tắc: Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, gram dương, có khả sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm Các tế bào thường liên kết thành chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả sinh coagulase S aureus hiếu khí hay kỵ khí tùy ý có khả lên men sinh axit từ manitol, trehalose, saccarose Mẫn cảm với novobiocine, có khả tăng trưởng mơi trường có đến 15% NaCl Một số dòng có khả làm tan máu mơi trường thạch máu Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào chủng nhỏ đường kính khuẩn lạc Khi phát triển môi trường, tạo sắc tố vàng sau – ngày ni cấy nhiệt độ phòng tổng hợp enterotoxin nhiệt độ 15 oC, nhiều tăng trưởng 35 – 37oC S aureus gọi tụ cầu khuẩn gây bệnh, cần xác định để biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không Staphylococcus aureus xác định sở đặc điểm tăng trưởng phản ứng đơng huyết tương dòng từ khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập VI.6.4 Clostridium Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, thủy phân đường protein hoạt động thu nhận lượng Hầu hết nhóm Clostridium ưa nhiệt vừa nhiên có số lồi ưa nhiệt số lồi thuộc nhóm ưa lạnh Các lồi gây ngộ độc thực phẩm quan trọng C.botulinum C.perfringens C botulinum lồi sống kỵ khí bắt buộc, tăng trưởng mơi trường trung tính, khơng có cạnh tranh với vi sinh vật khác Các dòng lồi có đặc điểm ni cấy khác có kiểu kháng nguyên ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A, B F có hoạt tính thủy giài protein tạo nên vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc mơi trường Willis Hobbs, kiểu C, D, E khơng có khả Kiểu A thường thấy mẫu thịt kiểu E phân lập mẫu cá 99 C perfringens lồi kỵ khí khơng bắt buộc, tạo bào tử môi trường nuôi cấy nhân tạo, quan sát bào tử mơi trường ni cấy Ellner, mơi trường có bổ sung muối mật bicarbonate hay quinoline Lồi có kiểu kháng nguyên ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho vết thương gây ngộ độc thực phẩm Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate disodium sulphate, ủ 37oC – ngày Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt ủ thêm 50 oC Trên mơi trường khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphite (S 2-) ion sắt (Fe2+) có mơi trường VI.6.5 Salmonella: Salmonella trực khuẩn gram âm, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả di động, khơng tạo bào tử, lên men glucose manitol sinh axit không lên men saccharose lactose, không sinh indol, không phân giải ure, khơng có khả tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết sinh H2S Salmonella xác định gồm bước: - Tăng sinh Salmonella thường có mặt mẫu với số lượng nhỏ bị tổn thương nên phải chọn quy trình tăng sinh phù hợp - Tăng sinh chọn lọc salmonella môi trường tăng sinh chọn lọc dùng để phát Salmonella mẫu thực phẩm như: RV (Rappaport Vassiliadis), Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT)… - Phân lập: Tách nhận dạng Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác mẫu, môi trường giúp nhận dạng Salmonella dựa vài đặc tính - Khẳng định: nhằm xác nhận lại có mặt khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất môi trường phân lập Bước dựa việc sử dụng phản ứng sinh hóa thử nghiệm huyết đặc trưng cho Salmonella KIA/TSI, indol, LDC, ODC, urease, lên men manitol, sorbitol,… VI.6.6 Tổng số nấm men, nấm mốc: Trong thực phẩm, diện nấm men, nấm mốc làm thay đổi màu thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu thực phẩm, số tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm Mật độ nấm mốc, nấm men mẫu xác định chung dạng tổng số nấm mốc, nấm men kỹ thuật pha lỗng, trải đếm khuẩn lạc mơi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar (DRBC) VI.7 Các phương pháp không truyền thống: Các phương pháp truyền thống công nhận rộng rãi lại có số nhược điểm như: tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, nhiều công sức, tốn kém… Để khắc phục nhược điểm này, nhiều phương pháp nhanh tự động phát triển thưong mại hóa Các phương pháp gọi chung phương pháp khơng truyền thống có đặc điểm chung cho kết nhanh phương pháp truyền thống 100 VI.7.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP giám sát vệ sinh Adenosin triphotphat (ATP) tìm thấy tất tế bào sống nên phát ATP dấu hiệu nhận biết vật chất sống tồn ATP phát cách nhanh chóng lượng ánh sáng phát thông qua kết hợp với enzyme luciferase nhờ máy đo ánh sáng Kỹ thuật phát 1pg (10-12g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10 -15gATP/ tế bào) Độ nhạy có sử dụng hóa chất thương mại đắt tiền, phân tích thường diễn vài phút phương pháp xem nhanh thuận lợi so với phương pháp đếm khuẩn lạc Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật diện biết đến vào năm 1960 Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi nhiều cải tiến việc thiết kế máy đo lượng ánh sang phát (giảm giá thành mang được) hóa chất ổn định phát sang Phương pháp ứng dụng lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra chất lỏng nước rửa làm hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh thực phẩm để đánh giá chất lượng vi sinh thực phẩm ATP ATP vi sinh vật cần phải tách chiết khỏi tế bào vi sinh vật định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát Phản ứng phát sáng sinh học đom đóm trải qua hai giai đoạn: E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng viết lại sau: E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi (E: Luciferase; LH2: Luciferin) Phản ứng phát sáng đom đóm có hiệu nhất, biết đến phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP Phản ứng đòi hỏi DLuciferin ion Mg2+ để hoạt động, thành phần kit thương mại Chất dioxetanone hình thành tạo phức hợp luciferase với oxi phức hợp Mg – ATP Sau đó, ánh sáng vàng - xanh (bước song cao 562nm) phát Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng vi khuẩn hiếu khí thành phẩm, người ta xác định tổng lượng ATP mẫu Tổng hàm lượng ATP bao gồm hàm lượng ATP eukaryote tế bào vi sinh vật Thơng thường ATP khơng có nguồn gốc tế bào vi sinh vật tách chiết chất tẩy khơng ion ví dụ Triton X-100 ATP sau tách chiết khỏi tế bào thủy phân cách xử lý với enzyme ATPase vòng phút Tiếp theo, ATP tế bào vi sinh vật ly trích chất tricloaxetic 5% Ánh sáng phát phản ứng phát sáng đo loại máy đo ánh sáng đo cường độ ánh sáng thấp Ngày phát quang sinh học sử dụng rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mĩ phẩm Quy trình thực đơn giản, nhanh chóng vài phút dễ dàng tự động hóa 101 Nguyên tắc chung quy trình phát quang sinh học sau: Mẫu thu cách dùng que bơng vơ trùng quẹt diện tích nhỏ định bề mặt dụng cụ, thiết bị sau que bơng cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với ATPase cho phản ứng phát sáng Gần đây, nhiều hệ thống phát thiết kế, chế tạo chứa sẵn hóa chất nằm dụng cụ quẹt mẫu tay phát sáng xảy phía đầu dụng cụ quẹt mẫu, sau dụng cụ đặt máy đo lượng ánh sáng phát Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo với đường chuẩn tương quan lượng ánh sáng phát mật độ tế bào vi sinh vật biết trước VI.7.2 Phương pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến kỹ thuật vài thập niên vừa qua thúc đẩy phát triển nhiều kỹ thuật chuẩn đốn huyết nhanh nhạy, xác bệnh truyền nhiễm Mặt khác, phát triển kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thơng qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên – kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme) Trong số phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay: ELISA) quan tâm nhiều có tính đơn giản hiệu cao Phương pháp sử dụng cho hầu hết loại kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngồi đĩa giếng Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxydase hay alkaline phosphate Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu phát diện định lượng kháng nguyên ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng phát định lượng vi sinh vật thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh VI.7.3 Phương pháp lai phân tử Hiện nhiều hệ thống thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật độc tố Tuy nhiên, có phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò, probes) phương pháp PCR thương mại hóa dạng kit phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Cơ sở việc sử dụng mẫu dò phương pháp lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn 102 kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (T m) phân tử DNA tái bắt cặp trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Q trình lai phân tử chiu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion mơi trường Ví dụ: hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống sử dụng que thử với mẫu dò để phát Listeria mẫu bơ sữa mẫu mơi trường mẫu dò đoạn oligomer AND đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình phân tích chia làm bước: 1) Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA 2) Mẫu dò phát chứa fluorescein isothiocyanate đầu 5` 3` phân tử đặt vào phản ứng 3) Que thử bao bọc polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò 4) Que thử đặt ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzyme 5) Sau rửa loại phần enzyme thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu 6) Sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450nm VI.7.4 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khn trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật Karl Mullis mà cộng phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật có thực phẩm… Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khn thường trình tự DNA gen (gọi trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho lồi vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu đoạn mạch khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase Khi có diện hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA phản ứng PCR, điều kiện đảm bảo hoạt động DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích thao tác gen Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có 103 thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước: - Bước 1: biến tính: dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94 – 95oC 30 – 60 giây Mạch đôi DNA tách thành dạng mạch đơn - Bước 2: bước lai: nhiệt độ hạ thấp T m mồi cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ khoảng 40 – 70 oC, khoảng 30 – 60 giây - Bước 3: tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt Thời gian bước tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm bước lặp lại nhiều lần, lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính tốn sau 30 đến 40 chu kỳ khuếch đại tạo 10 Sau phản ứng PCR, DNA nhuộm ethidium bromide quan sát thấy thơng qua việc điện di sản phẩm PCR gel agarose quan sát tia UV (bước sóng 320nm) Quy trình chung cho việc phát vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm phương pháp PCR sau: - Bước 1: tăng sinh mơi trường khơng chọn lọc thời gian từ 10 – 20 - Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích 1/10 thể tích dịch ni cấy ban đầu, xử lý nhiệt 100oC 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR - Bước 3: thực phản ứng PCR - Bước 4: điện di gel agarose 1,5% xem kết đèn UV 104 ... CHƯƠNG VI: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM 84 VI. 1 Các tiêu vi sinh vật thực phẩm 84 VI. 2 Kiểm tra vi sinh vật nguyên liệu thực phẩm thực phẩm 90 VI. 3 Phương... ứng dụng vi sinh vật ngành thực phẩm III I.2 Lịch sử phát triển ngành vi sinh thực phẩm Mãi đến năm 1800 mối liên quan giữ thực phẩm vi sinh vật phát Sau khám phá Pasteur số nhà vi sinh vật khác... thực phẩm: Hệ vi sinh vật thực phẩm phát sinh từ nhiều nguồn khác nhau: - Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ mơi trường bên ngồi, tay cơng nhân, dụng cụ, q trình chuyên chở, bảo quản… - Thực phẩm