bài giảng vi sinh vật đai cương

Bài giảng MÔN VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG BÀI 1: U CẦU ĐỐI VỚI CƠNG VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VSV CÁCH SỬ DỤNG MÁY MÓC – CÁCH BAO GÓI DỤNG CỤ THUỶ TINH Các nhà vi sinh vật học làm việc chủ yếu với giống vi sinh vật khiết Đó hệ sinh từ tế bào riêng biệt Trong khơng khí, bề mặt đồ vật phòng thí nghiệm, quần áo, chân tay… ln có lượng lớn loại vi sinh vật, cần phải quan tâm tới việc giữ khiết giống vi sinh vật dùng nghiên cứu Khi làm việc phòng thí nghiệm vi sinh vật học, cần phải tuân nghiêm ngặt qui tắc định YÊU CẦU ĐỐI VỚI PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC Phòng ln phải giữ gìn Trong thực tế, để tiêu diệt vi sinh vật khơng khí bề mặt đồ vật, ta dùng biện pháp khử trùng khác Khơng khí Thường làm phương pháp thơng gió Phải thơng gió liên tục 30-60 phút Thơng gió làm thấp rõ rệt số lượng vi sinh vật khơng khí, có chênh lệch nhiệt độ ngồi phòng Một cách làm khơng khí khác có hiệu thường sử dụng hơn, việc chiếu tia tử ngoại Loại tia có tác động chống vi sinh vật cao, làm chết tế bào dinh dưỡng mà bào tử vi sinh vật Để khử trùng khơng khí cần chiếu tia tử ngoại từ 30 phút đến vài tùy theo mức độ nhiễm bẩn khơng khí Chú ý: tránh khơng để tia tử ngoại chiếu trực tiếp chiếu phản xạ lên mắt Trong phòng nhỏ, khơng nên bật đèn tử ngoại Sàn nhà, tường bàn ghế Được làm máy hút bụi, lau chùi số hoá chất khử trùng (dung dịch nước cloramin 0,5-3%) Làm vệ sinh trước sau làm thí nghiệm Trên bàn làm việc khơng để vật dụng khơng cần thiết Phải có nhãn ghi tất lọ hoá chất, lọ dung dịch pha chế phải đặt chỗ xác định Trong phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse làm việc, không phép ăn, uống, hút thuốc NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC VỚI CÁC GIỐNG VI SINH VẬT Trong điều kiện phòng thí nghiệm, vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng (đặc lỏng đựng ống nghiệm, đĩa Petri bình thuỷ tinh Dụng cụ thuỷ tinh môi trường dinh dưỡng khử trùng trước Cấy công việc đưa tế bào vi sinh vật vào môi trường khử trùng Khi cấy (hoặc cấy chuyển) phải tiến hành theo qui tắc xác định, đảm bảo giữ cho giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm vi sinh vật môi trường xung quanh Trước cấy: ghi lên ống nghiệm (đĩa Petri bình thuỷ tinh) tên giống, tên mơi trường, ngày ni cấy Có thể viết bút viết kính viết lên nhãn giấy dán vào dụng cụ Trong cấy: Khi lấy tế bào vi sinh vật môi trường đặc để cấy làm tiêu bản, người ta sử dụng que cấy đầu tròn đầu nhọn Để lấy tế bào vi sinh vật môi trường lỏng, người ta thường dùng pipet khử trùng Cách tiến hành Khử trùng đầu que cấy trước lấy tế bào vi sinh vật Hơ nóng đỏ đầu que cấy làm nóng phần cán Đưa que cấy khử trùng vào dụng cụ chứa vi sinh vật Để tránh làm chết vi sinh vật, trước hết phải áp que cấy vào mặt dụng cụ thuỷ tinh vào phần môi trường chứa vi sinh vật cho nguội dùng để lấy lượng nhỏ sinh khối vi sinh vật Các thao tác thực bên cạnh lửa (không phải bên lửa) phải tiến hành thật nhanh để tránh nhiễm VSV môi trường xung quanh Việc cấy vi sinh vật vào môi trường vô trùng tốt thực phòng vơ trùng Sau cấy Các tế bào vi sinh vật lại đầu que cấy sau cấy làm tiêu đốt cháy lửa Phải đốt từ phần dây kim loại sát với đầu que cấy để làm cho tế bào vi sinh vật lại bị khơ khơng tạo thành khí dung (aerosol) làm nhiễm bẩn khơng khí, sau đặt thẳng đứng nung đỏ đầu que cấy Đối với hình thức lấy mẫu, cấy pipet vô trùng, sau tiến hành xong, pipet phải nhanh chóng ngâm vào dung dịch khử trùng (dung dịch cloramin 0,53% hay dung dịch phenol 3-5%) Sau cấy phải đặt ống nghiệm (hoặc dụng cụ khác có ni cấy vi sinh vật) vào tủ định ôn (thermostab) Đối với dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật dùng xong, cần phải khử trùng nồi hấp áp lực (autoclave) đem rửa Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc dùng xong lớp dung dịch khử trùng, để ngày, sau đổ cọ rửa Xử lý không cẩn thận dụng cụ ni cấy vi sinh vật dẫn đến tượng khí dung vi khuẩn (baterial aerosol) NGUYÊN TẮC GHI CHÉP THÍ NGHIỆM Sổ ghi chép cơng việc thí nghiệm tài liệu cho phép kiểm tra xác kết thu Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng theo trật tự xác định -Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu ngày kết thúc - Đối tượng nghiên cứu - Những điều kiện tiến hành thí nghiệm - Nguyên tắc phương pháp phân tích sử dụng - Những kết thu nhận Chú - Phải ghi chép tỉ mỉ kết thu được, số liệu phải ghi thành ý bảng, cần thiết phải vẽ biểu đồ, đồ thị - Có quan sát, nhận xét, kết luận thân - Không ghi chép vào mảnh giấy rời CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ MÁY MĨC Trong phòng thí nghiệm có số loại máy móc thường xun sử dụng, cần phải nắm vững cách vận hành bảo dưỡng máy móc 1.NỒI ẤP ÁP LỰC (AUTOCLAVE) Nguyên lý Phương pháp sử dụng nồi hấp áp lực dựa nguyên tắc làm gia nhiệt vật nước bão hoà áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng, nhiệt độ tăng theo (bảng) Bảng Nhiệt độ nước bão hoà áp suất khác o Áp suất (atm) Nhiệt độ ( C) Bình thường Cao (áp suất bổ sung) 1,0 100 1,0 0,5 112 1,0 1,0 121 1,0 1,5 128 1,0 2,0 134 Tác dụng phối hợp nhiệt độ cao áp suất đảm bảo cho việc khử trùng thực tốt Khi hấp, áp lực tiêu diệt tế bào & sinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật Chú ý: ghi chế độ khử trùng đơn vị áp suất 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 atm… có nghĩa nói đến áp suất bổ sung Cấu tạo Nồi hấp thường có cấu trúc khác cấu tạo mặt nguyên lý nồi hấp áp lực Cách sử dụng - Đổ nước vào nồi hấp với lượng thích hợp (đến vạch chuẩn ống thuỷ tinh đặt phễu rót nước) Nước phải đủ, khơng nên đổ q sơi nước lọt vào ống dẫn đến áp kế làm sai lạc số áp Nếu đổ ít, hiệu khử trùng kém, gây cháy nồi Tốt nên dùng nước cất cho vào nồi hấp không tạo canxi - Các đồ dùng phải bao gói kỹ xếp vào nồi hấp Đồ nặng Không nên xếp dụng cụ sát để nước di chuyển dễ dàng - Các mơi trường đem khử trùng rót khơng nửa chiều cao dụng cụ chứa chúng Các dụng cụ có mơi trường đậy nút bơng để ngăn cản vi sinh vật không khí nhiễm vào mơi trường Tuy nhiên nút khơng nên chặt, gây ảnh hưởng tới cung cấp khơng khí cho giống ni cấy - Đật nắp nồi hấp, vặn chặt khố, đóng van thơng - Đun nóng (có thể điện hoằng đốt) kim áp vạch 0,5atm mở van thơng để loại hết khơng khí có sẵn nồi hấp Do áp suất, nhiệt độ nước đơn cao nhiệt độ hỗn hợp nước khơng khí, tác dụng khử trùng nước đơn lên tế bào vi sinh vật mạnh lên nhiều - Khi kim áp kế trở 0, đóng van thơng hơi, áp suất tăng dần tới mức cần thiết Lúc cần điều chỉnh nguồn nhiệt để trì trạng thái theo thời gian định trước (Hiện nay, phần lớn phòng thí nghiệm, nồi hấp áp lực trang bị đầy đủ thiết bị chỉnh nhiệt độ, áp lực thời gian ) - Khi đủ thời gian khử trùng, đợi áp suất nồi hạ dần tới vạch số 0, mở van thơng xả hết khí Vặn ốc, mở nắp, lấy đồ dùng khử trùng 2.TỦ ĐỊNH ÔN (THERMOSTAB) Đây thiết bị quan trọng nuôi cấy vi sinh vật Nhiệt độ tủ thay o đổi từ 0-60 C Nhiệt độ xác định trì ổn định suốt thời gian ni cấy Cấu tạo Bao gồm lớp: - Lớp lớp kim loại dẫn nhiệt giữ nhiệt độ bên tủ - Lớp lớp kim loại dầy bao bọc bên lớp cách nhiệt Giữa lớp lớp thường khoảng rỗng giữ cho nhiệt độ biến đổi Trong tủ có mắc phận cảm ứng nhiệt để báo nhiệt độ lên xuỗng cho rơle hoạt động Phía mặt ngồi tủ có núm điều chỉnh nhiệt độ Các điểm cần ý sử dụng - Phải xem điện máy với nơi đặt máy có giống không Nếu khác phải dùng biến điện - Khi dùng lần đầu phải xem phận điều chỉnh nhiệt có làm việc tốt khơng, nhhiệt độ tủ có ổn định khơng - Cửa tủ ln đóng kín trừ lấy cho ngun liệu vào ni cấy - Luôn dảm bảo sẽ, khô tủ Cho máy chạy thường xuyên ngày trời ẩm TỦ SẤY Nguyên lý Đây phương pháp dùng để khử trùng dụng cụ thuỷ tinh khơng khí nóng o Cơng việc thực tủ sấy nhhiệt độ 165-180 C vòng Khi tiêu diệt tế bào sinh dưỡng bào tử vi sinh vật Cấu tạo Tủ sấy có cấu tạo vật liệu chịu nhiệt, thường kim loại amiăng Trong tủ có ngăn, phía có lỗ để cắm nhiệt kế cho bầu thuỷ ngân nhiệt kế phải đặt bên tủ, cách thành từ 6-8cm Khơng nên đặt sát thành tủ nhiệt độ thường cao nhiệt so với tủ Việc trì nhiệt độ cần thiết thực nhờ thiết bị điều hoà nhiệt (thermoregulator) Cách sử dụng - Các dụng cụ chuẩn bị tốt đưa vào tử sấy Khơng nên xếp q khít để khơng khí lưu thơng làm nóng vật cần khử trùng - Đóng kín cửa tủ lỗ khơng khí, bật cơng tắc điện Khi nhiệt độ lên tới 165o 180 C trì nhiệt độ vòng Chú ý: nhiệt độ xuống thấp tác dụng khử trùng khơng còn, nhiệt độ q o cao, lớn 180 C gây cháy giấy - Khử trùng xong, tắt công tắc điện không mở cửa tủ trước nhiệt độ o hạ xuống 80 C, không gây nứt làm ảnh hưởng đến tính vơ trùng dụng cụ CÁCH XỬ LÝ DỤNG CỤ THỦY TINH Đối với dụng cụ thuỷ tinh mới, dụng cụ thuỷ tinh trước sau làm thí nghiệm, cần ý hai nhiệm vụ trung tính rửa dụng cụ Phương pháp trung tính dụng cụ thuỷ tinh Phương pháp sử dụng nhằm tránh thay đổi pH gây từ dụng cụ chứa vào môi trường ni cấy Phương pháp thử: lấy nước trung tính (pH=7) cho vào dụng cụ thuỷ tinh, đem hấp nhiệt độ cao khoảng 30’ -> Lấy ra, để nguội, thử pH Nếu pH>7, ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% 10giờ Sau thử lại thấy chưa trung tính tiến hành ngâm tiếp Nói chung dụng cụ thuỷ tinh kiềm Rửa dụng cụ thuỷ tinh Dụng cụ Dùng chổi lông sát xà phòng rửa trong, ngồi dụng cụ, rửa xong để dốc ngược cho khô nước Dụng cụ sau dùng Ống nghiệm: Dùng xong qua khử trùng nồi hấp áp lực hay ngâm dung dịch lyzol 2% 24 h Đổ vật phẩm ống nghiệm ra, dùng xà phòng rửa trong, ngồi ống Tráng sạch, để Nếu cách chưa ngâm vào dung dịch KMnO4 0,2% đêm, vớt ra, dùng dung dịch HCl 0,2% để tẩy thuốc tím Sau rửa Một số dung dịch dùng để rửa (ngâm 24h) NaOH 4% ; HCl 0,2% ; HNO3 20% ; Na3PO4 5% ;H2SO4 20% - Pipette: dùng xong ngâm dung dịch fenol 5%, sau ngâm vào dung dịch NaOH 0,4% - Đĩa Petri: dùng vải xát xà phòng rửa bên góc quanh đĩa, úp sấp đĩa, cọ sát bên Rửa nước nhiều lần, để - Chai lọ: Trước rửa, đổ hết chất lại chai, lọ Ngâm nước 1-2 ngày Dùng dung dịch xà phòng đặc rửa sạch, xúc rửa bên nhiều lần, xúc rửa lại với dung dịch HCl 0,2% Tráng sạch, để - Đối với lọ đựng thuốc nhuộm, cần ngâm dung dịch HCl hay cồn, sau dùng nước rửa - Phiến kính: Nếu phiến kính có dầu, trước rửa phải lau sạch, ngâm phiến kính vào dung dịch credin 2% dung dịch fenol 5% Có thể ngâm dung dịch HgCl2 0,1% hay dung dịch lyzol 5% Đun nước xà phòng phút Rửa sạch, để khơ Có thể giữ phiến kính cồn, dùng lấy lau khô, hơ lên lửa Như tránh bụi, phiến kính BAO GĨI DỤNG CỤ THỦY TINH Các dụng cụ thuỷ tinh chiếm phần lớn dụng cụ phòng thực tập vi sinh vật học Việc xử lý bao gói dụng cụ có liên quan trực tiếp tới kết tiến hành Dụng cụ phải lựa chọn qui cách, đảm bảo chất lượng, phải xử lý tốt, khơng có vết bẩn khơng chứa tạp chất Bao gói phải đạt tiêu chuẩn khử trùng thuận tiện sử dụng Trước hấp khử trùng dụng cụ, vật liệu, cần phải tiến hành bao goí kỹ kỹ thuật để thuận tiện cho công việc khử trùng, tránh tượng nứt vỡ hay bị tạp nhiễm sau hấp Cách làm nút Làm không thấm nước (bông mỡ) loại sợi dài Cắt bơng thành miếng nhỏ hình vng 7-8cm Tuỳ theo đường kính miệng ống nhỏ hay to mà ta thay đổi kích thước miếng bơng cho phù hợp Chú ý - Nút cho ống nghiệm không dài cm - Không làm nút chặt gây vỡ ống nghiệm - Không làm nút bơng q lỏng dễ bị nhiễm tạp - Làm nút bơng cho bình lớn phải bọc thêm vải thưa gạc Làm nút ống hút Mục đích: ngăn ngừa chất từ mơi trường ni cấy vào miệng tránh nhiễm tạp từ miệng vào môi trường Cách làm Dùng que nhỏ cho vào miệng ống hút chút (cách miệng 1-2cm) Chú ý: Khơng làm nút chặt q khó hút chất Khơng làm nút lỏng nút bơng di động lên, xuống Bao gói dụng cụ Sau làm nút, dụng cụ phải bao gói quy cách để đem hấp - Đối với ống nghiệm đựng mơi trường có nút bơng, cần dùng giấy bọc chặt phía đầu nút bơng lại - Chai lọ bọc chặt phần nút giấy - Pipet gói phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy dần theo kiểu xốy trơn ốc hết phía đầu có nút bơng Các pipet gói từ tới vài - Các đĩa Petri gói thành chồng, chồng từ 3-5 - Các dụng cụ khác, tuỳ theo yêu cầu mà có bao gói cho thích hợp Nếu hấp nồi hấp áp lực khơng bao gói giấy thấm nước mà phải dùng loại giấy dai, khơng thấm nước Các dụng cụ bao gói phải thật khô, sạch, tránh vỡ hấp Dụng cụ bao gói xong phải dán nhãn, đề ngày đem hấp để tiện việc theo dõi, sử dụng Nội dung đạt Quan sát biết cách sử dụng máy móc như: tủ định ôn, nồi hấp áp lực, tủ sấy Thực tập xử lý làm nút bơng bao gói dụng cụ thuỷ tinh, tiến hành sấy hấp khử trùng dụng cụ Chuẩn bị dụng cụ hố chất Máy móc - Dụng cụ: Tủ định ôn Tủ sấy Nồi hấp áp lực Dụng cụ thuỷ tinh Chổi rửa dụng cụ thuỷ tinh Đũa tre, vải Dụng cụ ngâm đồ thuỷ tinh Giá gỗ, giỏ lưới Chậu rửa Hố chất Xà phòng Dung dịch kiềm Dung dịch axit HCl 0,2%; H2SO4 20%, Fenol 5%; HNO3 Dung dịch chất oxy hoá: KmnO4 0,2%; K2Cr2O7 10% Dung dịch chất sát trùng: lyzol 2%; credin 2% BÀI - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI, CÁCH LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT Việc nghiên cứu, cấu tạo tế bào vi sinh vật nhỏ bé thực nhờ giúp kính hiển vi Hiện nay, người ta sáng chế nhiều loại kính hiển vi khác nhằm mục đích nghiên cứu rõ sâu vi sinh vật Tuy nhiên nghiên cứu sử dụng loại kính hiển vi quang học – loại kính sử dụng hầu hết lĩnh vực có liên quan đến vi sinh vật Để quan sát vi sinh vật kính hiển vi quang học, cần làm tiêu tế bào sống (tiêu tươi) tiêu tế bào cố định (chết) Mục đích – yêu cầu - Nắm vững cấu tạo kính hiển vi, hiểu rõ nguyên tắc phương pháp sử dụng - Sử dụng thành thạo kính hiển vi để quan sát hình thái cấu tạo vi sinh vật - Thực tốt biện pháp, yêu cầu bảo vệ kính hiển vi trước sau sử dụng - Học làm tiêu tế bào vi sinh vật sống, tiêu cố định nhuộm màu - Làm quen với hình thái học đại diện thuộc nhóm vi sinh vật khác A KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH SỬ DỤNG Kính hiển vi bao gồm ba phận sau đây: Bộ phận giới Chân kính: Dùng để đỡ kính hiển vi Khay kính: Nơi đặt tiêu để quan sát có lỗ hổng để ánh sáng qua Trên khay có kẹp để giữ tiêu Khay kính cố định động theo chiều nhờ có ốc cố định ốc chuyển dịch nằm mép khay kính Trụ mang ống kính: phận dùng để đặt ống kính Trụ kính có đầu (đầu trụ) để gắn ống kính bàn xoay Ống kính: ống kim loại hình trụ, phía gắn thị kính, phía gắn bàn xoay có gắn vật kính Phần ống kính ống gắn thị kính có thẻ hai ống gắn thị kính Phần quay theo hướng nhờ vít hãm Ốc điều chỉnh: gồm ốc vĩ cấp ốc vi cấp Các ốc thực chất điều chỉnh khoảng cách tiêu đầu vật kính Bộ phận quang học Vật kính: Vật kính hệ thống quang học gồm nhiều thấu kính ghép lại với Bộ phận quan trọng định tính kính hiển vi (tính tạo ảnh thật tiêu bản) Mỗi kính hiển vi tuỳ theo thiết kế : Vật kính bội số thấp, trung bình cao Vật kính có bội số thấp vật kính 8X; 10X; 20X; vật kính có bội số cao trung bình 40X; 60X; 65X; vật kính có bội số cao 90X 100X (còn gọi vật kính đầu, đầu có vòng đen để phân biệt với vật kính khác) vạt kính có bội số thấp thường dùng để xem tươi, vật kính dầu thường để xem tiêu nhuộm Thị kính: cấu tạo gồm hai thấu kính ghép lại Thị kính khơng có lực tạo ảnh vật kính mà chủ yếu chức phóng đại ảnh vật kính thu Thơng thường thị kính có độ phóng đại: 7X; 10X; 15X 20X (hoặc 12X, 16X…) Độ phóng đại tiêu quan sát tích số độ phóng đại thị kính với độ phóng đại vật kính đem sử dụng Ví dụ: dùng vật kính dầu có độ phóng đại 90X thị kính có độ phóng đại 15X để quan sát tiêu tiêu phóng đại lên: 90x15 = 1350 lần Bộ phận tập trung ánh sáng Gương phản chiếu: Đặt khay kính gồm hai mặt lõm lồi Tụ quang kính: đặt khay kính dùng để tập trung ánh sáng từ gương phản chiếu vào tiêu Tụ quang kính nhiều thấu kính tạo nên tập trung ánh sáng Dưới hệ thống thấu kính phận chắn sáng Tụ quang kính di động lên xuống nhờ có ốc điều khiển làm chuyển dịch lề gần tụ quang CÁCH SỬ DỤNG Tư kính: Đặt kính bàn ngắn, tư có lợi cho người quan sát Khi quan sát người ta thường dùng mắt trái mắt phải để ghi chép Nguồn sáng Có thể sử dụng hai nguồn sáng nguồn sáng tự nhiên nguồn sáng nhân tạo (ánh sáng đèn) Sử dụng nguồn sáng tự nhiên thường ánh sáng tán xạ (ánh sáng gián tiếp) Tránh dùng ánh sáng chiếu trực tiếp có hại cho mắt ánh sáng không rõ Sử dụng nguồn sáng nhân tạo, thường người ta dùng ánh sáng đèn điện ánh sáng đèn dầu, đèn đất, nến….Cần dùng phiến kính lọc màu đặt tụ quang kính để tránh ảnh hưởng tia sáng màu vàng màu nâu đến màu sắc thật ảnh Trường hợp ánh sáng mạnh sử dụng kính mờ màu trắng để giảm bớt cường độ ánh sáng làm cho ánh sáng Cách lấy ánh sáng Hiệu quan sát tiêu có quan hệ lớn đến cách sử dụng ánh sáng Sử dụng tốt ánh sáng có quan hệ đến ba yếu tố cách sử dụng nguồn sáng, sử dụng gương phản chiếu kính tụ quang Đối với kính hiển vi có bố trí kính tụ quang Trong trường hợp thơng thường: dùng mặt phẳng gương phản chiếu để bảo đảm phát huy tính tạo ảnh kính Trong trường hợp ánh sáng khơng đủ dùng kính lõm Đối với kính hiển vi khơng có bố trí kính tụ quang nói chúng dùng mặt lõm gương phản chiếu Sử dụng kính tụ quang cần nắm điểm sau đây: quan sát với vật kính bội số táp thường mở phận chắn sáng, hạ thấp đến mức gần thấp kính tụ quang Khi dùng vật kính có bội số cao kính tụ quang nâng dần lên đến mức cần thiết để đạt độ chiếu sáng tốt, ảnh rõ Dùng với vật kính dầu (bội số cao) cần thiết phải nâng kính tụ quang lên mức tối đa mở hồn tồn phận chắn sáng Xác định tiêu điểm quan sát Khi xem tươi cần hạ thấp ống kính gần sát xuống tiêu bản, sau vặn ốc vĩ cấp nâng từ từ ống kính lên, đồng thời quan sát kính, thấy chớp ảnh dùng ốc vi cấp để điều chỉnh cho rõ ảnh tiêu Khi xem tiêu nhuộm với vật kính dầu phải xác định tiêu điểm với vật kính bội số thấp Sau nhỏ giọt dầu bạch dương (cedre) nhỏ vào vị trí xác định khơng làm lan rộng Do vật kính dầu có độ phóng đại lớn, đường kính thấu kính nhỏ khơng cho dầu có phần nhỏ ánh sáng lọt vào thấu kính, ảnh vào khơng rõ, dầu bạch dương có chiết suất xấp xỉ chiết xuất thuỷ tinh ánh sáng qua tiêu để vào vật kính mơi trường gần đồng nên di thẳng mà không bị khúc xạ lượng ánh sáng vào nhiều, ảnh rõ Xoay vật kính dầu cho sát xuống tiêu cho đầu vật kính ngập dầu Khi thấy có chớp ảnh vặn ốc vi cấp từ từ để thấy rõ ảnh tiêu CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Lấy kính hiển vi hộp nên dùng tay phải, nắm trụ kính kéo kính theo hướng nằm ngang không để đụng vào thành hộp; sau dùng tay trái đỡ chân kính để mang Nếu mang xa phải cố định chắn để tránh bị hỏng kính bị lắc mạnh Khơng sờ tay vào đầu vật kính thị kính Nếu phát thấy vật kính, thị kính bị bụi bẩn phải dùng giấy riêng để lau kính hay khăn lụa để lau, lau phải nhẹ nhàng Khi dùng xong, sử dụng vật kính dầu trước hết phải dùng giấy mềm vải lụa để lau nhẹ cho dầu, sau lau lại xylen benzen cho hết dầu đầu vật kính Xoay phận kính chỗ qui định Không để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào kính Khơng tháo lắp phận kính, khơng tự ý cho dầu vào phận giới kính Phải để nơi khơ thống, khơng nóng, bụi bẩn B PHƯƠNG PHÁP LÀM VÀ NHUỘM CÁC TIÊU BẢN PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TƯƠI KHÔNG NHUỘM Tiêu “giọt ép” Tiêu “giọt ép” dùng để xác định hình thái, kích thước, xếp phương thức sinh bào tử tế bào vi sinh vật Cách làm: Dùng phiên kính (lame) khơ, sạch, lấy giọt nước vơ trùng đặt lên phiên kính Sau dùng que cấy vơ trùng thêm vào tế bào vi sinh vật hay vật liệu cần nghiên cứu (nước dưa, sữa ….), trộn Dùng kính (lamella) đậy lên giọt dung dịch vi sinh vật (hình) Chú ý: Tránh đậy nhanh, mạnh gây nên bọt khí làm cho giọt dịch bắn lung tung Tiêu “giọt treo”: Được dùng để quan sát sinh sản vi sinh vật, hình thành nảy mầm bào tử, phát khả di động mối quan hệ tế bào vi sinh vật với kích thích hố học Cách làm: Dùng que cấy đầu tròn lấy giọt dịch huyền phù vi sinh vật đặt lên kính khơ Bơi lớp vazơlin mỏng quanh chỗ lõm phiến kính để gắn chặt kính bên trên, tránh khơ dịch quan sát Quay ngược kính xuống phía đặt lên phiến kính lõm cho giọt dịch nằm chỗ lõm Tiêu vết: Dùng để nghiên cứu phân bố tự nhiên tế bào khuẩn lạc vi sinh vật, hình thái bào tử & cuống sinh bào tử xạ khuẩn, nấm mốc Cách làm: Cách 1: dùng kính ép nhẹ lên đám vi sinh vật mộc dày đặc hay phía khuẩn lạc riêng rẽ Đặt tiêu nhận lên phiến kính có sẵn giọt nước hay giọt dung dịch xanh metylen 1/40 Cách 2: dùng phiến kính ép nhẹ lên bề mặt vi sinh vật bề mặt khuẩn lạc Lấy làm tiêu “vết” PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN NHUỘM Mục đích: quan sát rõ ràng hoạt động sống tế bào vi sinh vật Cách làm: giống tiêu “giọt treo” “giọt ép”, cho thêm dung dịch thuốc nhuộm xanh metylen …% PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH VÀ NHUỘM MÀU TIÊU BẢN Cố định nhuộm màu tiêu dùng để quan sát kỹ phần cấu trúc tế bào Những tiêu có tác dụng bảo tồn tiêu loại hình vi sinh vật cho nghiên cứu sau Việc chuẩn bị tiêu gồm bước: chuẩn bị vết bôi, làm khô, cố định nhuộm màu (hình) Chuẩn bị vết bơi: Đặt vật liệu nghiên cứu lên phiến kính theo kiểu làm giọt ép, dùng que cấy dàn vật liệu diện tích 1-2cm Làm khơ vết bơi: Tiêu làm khơ khơng khí, khơ chậm hơ phiên kính lên phía cao lửa đèn cồn Tránh làm q nóng vết bơi vi sinh vật bị biến dạng Cố định: Mục đích - Gắn tế bào vi sinh vật lên phiến kính - Tránh bị rửa trơi - Làm cho vết bôi dễ bắt thuốc nhuộm tế bào chết dễ nhuộm màu tế bào sống, an tồn sử dụng vết bơi hơn, sử dụng vi sinh vật gây bệnh Nhuộm màu: - Người ta chia loại thuốc nhuộm thành hai loại: thuốc nhuộm axit thuốc nhuộm bazơ - Tế bào vi sinh vật nhuộm màu chủ yếu thuốc nhuộm bazơ - Thuốc nhuộm axit gồm: eozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin zit…, chúng liên kết chặt chẽ với cá thành phần tế bào chất (có tính bazơ) tế bào - Thuốc nhuôm bazơ: xanh metylen, fuchsin kiềm, tím gentian, tím kết tinh, safranin…., chúng liên kết với thành phần chất nhân (có tính axit) tế bào - Người ta chia cách nhuộm: nhuộm đơn nhuộm phân biệt a Nhuộm đơn: quan sát tồn hình dạng kích thước tế bào Dùng thuốc nhuộm như: xanh metylen, fuchsin, tím getian b Nhuộm phân biệt: dùng để nhuộm phân biệt để nghiên cứu số cấu trúc tế bào, đặc tính xác định vi sinh vật Cách làm: Đối với nhuộm đơn nhuộm phân biệt: - Đặt phiến kính cố định giá thuỷ tinh - Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm lên tiêu - Rửa nhẹ tiêu nước tới thấy nước c Nhuộm Gram (nhuộm kép) Dựa vào khác thành phần hoá học thành tế bào tế bào vi khuẩn Sử dụng phối hợp loại thuốc nhuộm để phân biệt khác Cách làm (hình…) Nội dung tường trình - Làm tiêu tươi khơng nhuộm nhuộm loài vi sinh vật nhóm: + Vi khuẩn (Sarcina, Staphylococcus, Bacillus subtilis, E.coli) + Nấm men: (Saccharomyces cerevisiae) + Nấm mốc (Mucor, Aspergillus, Rhizopus) - Miêu tả hình thái loại vi khuẩn - Miêu tả hình thái nảy chồi nấm men - Miêu tả hình thái quan mang bào tử bảo tử nấm mốc - Nhuộm Gram loại vi khuẩn Vẽ hình thái xác định bắt màu chúng Chuẩn bị dụng cụ hố chất Dụng cụ Kính hiển vi, dầu soi kính Que cấy tròn nhọn Phiến kính thường lõm, kính Đèn cồn Giá chậu thuỷ tinh Hoá chất o Cồn 96 Xanh metylen axit phenic Tím gentian KI I2 Axeton Safranin Fucshin BÀI - MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VSV MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Khả tổng hợ p cách thức thu nhận lượng khác tuỳ thuộc vào loại vi sinh vật Do nhu cầu chất dinh dưỡng chúng khác Môi trường dinh dưỡng cần thiết cho việc ni cấy tích luỹ, phân lập, bảo quản giống ni cấy với mục đích nghiên cứu q trình trao đổi chất thu nhận sản phẩm trao đổi chất có giá trị vi sinh vật Mơi trường dinh dưỡng cần phải chứa đựng tất thành phần cần thiết trình hình thành cấu trúc lượng tế bào Đó nguồn dinh dưỡng cacbon, nitrogen, nguyên tố khoáng nguyên tố vi lượng Tuy nhiên mơi trường phải có điều kiện lý, hoá phù hợp với điều kiện sống vi sinh vật như: độ pH, thể oxy hố khử, nồng độ chất, độ thống khí… A CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG Căn vào thành phần, nguồn gốc chất dinh dưỡng có mơi trường Mơi trường tự nhiên: Mơi trường hình thành từ sản phẩm có nguồn gốc động vật thực vật như: nước ép rau, quả, tổ chức mô động vật, màu pha lỗng, sữa, … nước chiết thu chế tạo từ chất tự nhiên thịt, phân, đất, phận thực vật … Trên môi trường tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật phát triển tốt có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật Tuy nhiên mơi trường có thành phần hóa học phức tạp, không ổn định, không thuận lợi cho việc nghiên cứu sinh lý, trao đổi chất vi sinh vật Các môi trường tự nhiên chủ yếu dùng để nic cấy tích luỹ sinh khối để định tên vi sinh vật Môi trường tổng hợp: Môi trường hình thành từ hợp chất hố học tinh khiết, xác định lấy với nồng độ phù hợp Ưu điểm: biết rõ thành phần số lượng thành phần đưa vào môi trường nên nghiên cứu nhu cầu chuyển hoá chúng thành sản phẩm trao đổi chất tương ứng Nhược điểm: giá thành cao Môi trường bán tổng hợp: Thuộc loại mơi trường tự nhiên có thành phần không xác định Trong thành phần chúng, ngồi hợp chất rõ chất hố học có chất chưa biết rõ thành phần Môi trường sử dụng phổ biến vi sinh vật học công nghiệp để thu nhận axit amin, vitamin sản phẩm quan trọng khác hoạt động sống vi sinh vật Căn công dụng môi trường Phân loại thành môi trường: mơi trường chọn lọc mơi trường chuẩn đóan phân biệt Môi trường sở: môi trường sử dụng rộng rãi sở mơi trường tạo mơi trường cần dùng khác Môi trường sở thường thấy môi trường nước pepton, môi trường nước thịt pepton Môi trường chọn lọc: Môi trường đảm bảo phát triển lồi hay nhóm vi sinh vật thuận lợi hồn tồn bất lợi dự phát triển vi sinh vật khác Các môi trường chọn lọc chủ yếu sử dụng để phân lập vi sinh vật từ môi trường sinh sống tự nhiên chúng dùng để ni cấy tích luỹ Mơi trường chuẩn đốn phân biệt (môi trường thị) Cho phép phân biệt nhanh loài vi sinh vật với loài vi sinh vật khác Thành phần mơi trường phải tính toán, chọn lựa cho phát rõ ràng đặc điểm lồi Các mơi trường thị dùng vi khuẩn học lâm sàng, nghiên cứu di truyền học định tên vi sinh vật Căn vào trạng thái vật lý môi trường Căn vào trạng thái vật lý môi trường, phân biệt thành dạng sau: Mơi trường lỏng: Hợp thành hoà tan chất dinh dưỡng cần thiết nước môi trường nước thịt, nước pepton, nước loại củ, carot, su hào, khoai tây, giá đỗ… Môi trường ứng dụng để phát đặc điểm sinh lý – sinh hố vi sinh vật, để tích lý sinh khối sản phẩm trao đổi chất, để giữ giống bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển tốt môi trường đặc Mơi trường bán lỏng: Được hình thành sở mơi trường lỏng có bổ sung số chất làm đơng giúp cho mơi trường đặc lại có độ đông Môi trường bán lỏng dùng để theo dõi di động vi khuẩn Môi trường rắn: Hình thành sở mơi trường lỏng có bổ sung chất làm đông nhiều môi trường bán lỏng nhằm tăng độ đông cứng môi trường Môi trường ứng dụng để tách giống khiết, nghiên cứu định tên (xác định hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng thạch nghiêng…), để giữ giống, để đếm số lượng vi sinh vật, để xác định tính đối kháng vi sinh vật nhiều trường hợp khác Môi trường xốp: Được ứng dụng vi sinh vật học công nghiệp Thuộc loại có kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng B CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG Đối với loại môi trường khác nhau, cách chế tạo có quy tắc chung giống Quy trình pha chế mơi trường Phối hợp hồ tan ngun liệu Cân xác ngun liệu mơi trường theo lượng định Cho vào dụng cụ nấu: - Nếu chế môi trường lỏng đun ý bổ sung lượng nước bốc - Nếu chế môi trường rắn: cân xác hố chất (từ lượng nhỏ tới lượng tăng dần), xác định lượng thách cần cho Bổ sung nước thể tích yêu cầu Ngoáy Đun bếp cho tan thạch Chú ý ngốy để tránh bọt khí phía bị cháy phía Kiểm tra độ pH Có thể dùng máy đo pH so màu Căn vào độ pH xác định, điều chỉnh độ pH môi trường theo yêu cầu nuôi cấy Thông thường điều chỉnh độ pH môi trường cao só với u cầu chút theo kinh nghiệm, môi trường sau khử trùng pH bị hạ thấp (môi trường thạch rắn hấp pH hạ 0,4; môi trường thạch mầm hạ 0,2; môi trường lỏng hạ 0,1 Muốn điều chỉnh pH thường dùng dung dịch HCl, NaOH, H2SO4, NaHCO3… pha với nồng độ xác định Lọc phân phối mơi trường Có thể dùng giấy lọc, vải xô, lọc thiết bị lọc chân không Phân phối môi trường vào dụng cụ cần làm Chú ý lượng môi trường không vượt tỉ lệ cho phép so với dung tích vật chứa để tránh bị trào - Khi hấp thạch nghiêng khơng đổ q 1/4 dung tích ống - Khi hấp thạch ống khơng đổ q 2/3 dung tích ống - Khi hấp thạch bình tam giác, lượng mơi trường khơng vượt q 2/3 dung tích bình Khử trùng Thông thường khử trung nồi hấp áp lực Nhiệt độ thời gian khử trùng tuỳ thuộc vào đặc tính mơi trường Do kả dễ biến đổi đặc tính hố học mơi trường có mặt chất q trình khử trùng, ta hấp riêng rẽ số chất, sau kết hợp lại với trước dùng để nuôi cấy Một số môi trường dễ bị phá hủy nhiệt độ cao, dùng phương pháp gián đoạn (phương pháp tyndal) để xử lý Kiểm định Sau hấp khử trùng, đặt môi trường tủ định ôn nhiệt độ 30 C Sau 2448h không thấy vi sinh vật xuất đạt yêu cầu Bảo quản Môi trường kiểm định chưa dùng phi bảo quản nhiệt độ thấp tránh ánh sáng giúp môi trường không bị khô, không bị oxy hố có biến đổi pH, đồng thời giữ cho môi trường không bị nhiễm tạp Chú ý: thời gian BQ không dài CÁCH PHA CHẾ MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG Cách pha chế số loại môi trường Môi trường tự nhiên Môi trường canh thịt – pepton (MPB): môi trường để nuôi cấy vi sinh dị dưỡng Cách làm: Thịt (loại bỏ xưng, mỡ, gân) xay nhỏ : 500g + lít nước -> lọc lấy nước -> đun sôi > lọc -> bổ sung nước tới mức ban đầu -> bổ sung 0.5% NaCl + 1% pepton -> khử trùng 1atm/20-30 phút Môi trường mạch nha: môi trường tốt với loại vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic, nấm men, nấm mốc loại vi sinh vật dị dưỡng thường dùng đường làm nguồn cacbon nguồn nguyên liệu lượng Cách làm : Đại mạch nảy mầm (thóc nẩy mầm) xay nhỏ : 250g + nước : lít -> đun nóng -> nâng nhiệt -> đường hố hết tinh bột (khơng có phán ứng màu với thuốc thử Iod) -> o lọc -> đo nồng độ dung dịch đường (độ Balling - B) o Nồng độ đường nước mạch nha thường đạt 16-18 B Muốn có nồng độ cần thiết, ta dùng nước để pha loãng o + Đối với nấm mốc, nồng độ 3-4 B o + Đối với men, nồng độ 6-8 B o + Đối với vi khuẩn lactic, nồng độ 8-12 B Nước mạch nha khử trùng 0,5atm/20-30 phút Môi trường khoai tây: sử dụng chủ yếu để phân lập ni cấy lồi giống Clostriodium đại diện vi khuẩn phân giải tinh bột khác Cách làm Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ : 200 g + lít nước -> đun sơi (15 phút) -> phân phối vào dụng cụ nuôi cấy -> khử trùng (1,5 atm/30 phút) -> CaCO3 môi trường nuôi cấy Môi trường tổng hợp Môi trường Hansen : sử dụng để nuôi cấy nấm men Nguyên liệu (g/l) Glucose(maltose, saccharose) : 50 g Pepton : 10g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 2-5g Thạch : 20g pH :… Cách làm Hoà tan hỗn hợp nguyên lieuẹ nước, đun cho tan hết thạch, hấp khử trùng, o 121 C/15 phút Mơi trường Saburaud PHƯƠNG PHÁP NI CẤY PHÂN LẬP VI SINH VẬT Trong công tác nghiên cứu vi sinh vật: cấy, phân lập có tầm quan trọng lớn công tác bảo tồn giống, tạo giống chủng hay giống Trong môi trường mới, vi sinh vật phát triển tốt, tăng nhanh số lượng tế bào Tuy nhiên sau thời gian nguồn dinh dưỡng cạn dần, tích luỹ sản phẩm trình trao đổi chất tăng lên gây tác dụng ức chế vi sinh vật chí thay đơỉ đặc tính gây chết tế bào Do nên cần cấy truyền sang môi trường Qua phân lập người ta sàng lọc chủng loại vi sinh vật riêng biệt Trên sở để nhận biết chủng giống theo yêu cầu người PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP Dùng phương pháp cấy thạch đĩa nhằm tạo khuẩn lạc riêng rẽ, thuận lợi cho việc nhận xét, phân biệt hay chọn lọc chủng vi sinh vật có mẫu Phương pháp phân lập tiến hành theo bước sau: Lấy mẫu Tuỳ theo mẫu đem phân lập mà có cách lấy mẫu khối lượng mẫu lấy khác Cần bảo đảm điều kiện chung - Số lượng phải đủ để phân lập tiến hành phân tích tiêu khác (nếu cần) - Phải ghi rõ ràng thời gian địa điểm lấy mẫu phân lập - Thời gian lấy mẫu tiến hành nhanh - Chú ý công tác vô trùng chọn lọc mẫu có tính đại diện Xử lý mẫu Mẫu rắn: Bao gồm mẫu đất, mẫu thức ăn bột, mẫu thịt….Cân xác 10g mẫu cho vào cối vơ trùng nghiền kỹ, sau pha lỗng tới 100ml nước cất vô trùng Lắc hút lấy 1ml dịch mẫu để làm bước pha loãng Mẫu lỏng: không cần xử lý trước, cần hút lấy 1ml dịch mẫu để pha loãng Phương pháp pha loãng mẫu cấy Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng dung dịch NaCl 9% vô trùng, số lượng ống tuỳ theo ước đoán số vi sinh vật mẫu nhiều hay Cách làm (hình) Chú ý: chuyển chuyển sang nồng độ mới, cần thay pipet Cấy môi trường thạch đĩa: môi trường chuẩn bị kiểm nghiệm từ trước Cấy từ độ pha loãng phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật có Dùng pipet vơ trùng lấy thể tích định (thường 0,05; 0,1; 0,2 ml) dịch có độ pha lỗng tương ứng, cấy lên bề mặt thạch có chứa đĩa Petri, dùng que gạt dàn lên khắp bề mặt môi trường Từ độ pha loãng cần lặp lại từ 3-5 lần Mỗi lần sử dụng pipet que gạt vô trùng Các đĩa chứa môi trường cấy đặt vào tủ định ơn với nhiệt độ thích hợp để theo dõi phát triển vi sinh vật cần phát Nói chúng, sau 24 giờ, vi sinh vật sinh trưởng phát triển tốt, hình thành khuẩn lạc môi trường Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc hết, xác định thời gian nuôi cấy sau: vi khuẩn 36-48 giờ, nấm men 48-72 giờ, nấm mốc 96120 Nội dung thực tập tường trình Phần làm mơi trường - Chia thành nhóm thực tập làm mơi trường: canh thịt Pepton, môi trường khoai tây, môi trường Hansen môi trường Saburaud - Tiến hành đổ môi trường thạch nghiêng, thạch đĩa môi trường Hansen Saburaud - Nêu tóm tắt cách làm mơi trường xác định hiệu khử trùng mơi trường Dụng cụ, hố chất nguyên liệu Dụng cụ Cốc nấu: 1000ml, 500ml, 250ml Phễu thuỷ tinh Hộp lồng Ống nghiệm: 16x160ml Bình tam giác: 100ml, 200 ml, 250ml Bình định mức: 250ml, 500ml, 1000ml Đèn cồn Đũa thuỷ tinh Hộp so màu pH kế Bếp điện Nồi hấp áp lực Hoá chất nguyên liệu Dung dịch axit: HCl 0,1N H2SO4 0,1N Dung dịch bazơ: NaOH 0,1N NaHCO3 0,1N K2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O NaCl CaCO3 Đường Glucose PeptonThạch Phần phân lập - Chia thành nhóm thực tập phân lập vi sinh vật mơi trường rắn: Bánh biscuit, thóc, mẻ; môi trường lỏng: nước sinh hoạt, nước dưa chua, sữa tươi - - Tiến hành làm ống nghiệm có chứa dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng để pha loãng mẫu - Theo dõi xuất khuẩn lạc khả phát triển chúng Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào Vẽ hình minh hoạ