Enzyme thủy phân thực phẩm

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM MƠN HĨA HỌC THỰC PHẨM  MỤC LỤC  HÌNH Lời mở đầu Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Bản chất enzyme protein nên enzyme có tính chất tương tự protein Các tác nhân gây biến tính protein nhiệt độ, acid, kiềm, tác động học…đều làm enzyme biến tính thuận nghịch khơng thuận nghịch Enzyme khác protein chỗ: cấu tạo enzyme cấu trúc đặc biệt gọi trung tâm hoạt động Không phải tất phần enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác mà có trung tâm hoạt động mang tính đặc hiệu phân tử enzyme tham gia xúc tác phản ứng Phần lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên enzyme thủy phân có đầy đủ đặc điểm chất xúc tác Điểm khác enzyme so với xúc tác khác khả xúc tác đặc hiệu cường lực xúc tác mạnh nhiều so với xúc tác thông thường Trong giờ, 1g pepxin thủy phân đến 5kg protein trứng luộc nhiệt độ bình thường Sỡ dĩ phản ứng enzyme diễn nhanh lượng hoạt hoá phản ứng enzyme hạ xuống thấp so với trường hợp khơng có xúc tác nhỏ nhiều so với xúc tác khác Vì có tính đặc hiệu cao nên phản ứng thủy phân enzyme tạo thành sản phẩm phụ gây độc cho người sử dụng Enzyme thủy phân 1.1 • Thế enzyme thủy phân? Là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân hợp chất hữu với tham gia nước • Phản ứng tổng quát: XY + H2O XOH + YH • Cách gọi tên: Tên chất tách hydrolase • Các enzyme thường gặp amylase, protease, lipase  Tính chất chung nhóm enzym xúc tác phản ứng thủy phân, nghĩa phân giải hợp chất phức tạp với tham gia nước, thành hợp chất đơn giản Các hyddrolase phần lớn enzyme thành phần nên chúng không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác Trung tâm hoạt động chúng bao gờm tổ hợp nhóm định chức axitamin khơng tham gia tạo thành trục sợi polypeptide Các nhóm định chức xa mạch polypeptide lại gần không gian, định hướng xác định không gian cách khoảng cách định cho chúng tương tác với q trình xúc tác  Nhóm hyddrolase ( EC3) chia thành 11 phân nhóm sau: 3.1 : enzym thủy phân liên kết ester 3.2 : enzym thủy phân liên kết glycoside 3.3 : enzym thủy phân liên kết eter 3.4 : enzym thủy phân liên kết peptide 3.5 : enzym thủy phân liên kết C—N peptide (các amide) 3.6 : enzym thủy phân liên kết anhydride acid 3.7 : enzym thủy phân liên kết C—C 3.8 : enzym thủy phân liên kết haloid – rượu 3.9 : enzym thủy phân liên kết P—N 3.10 : enzym thủy phân liên kết S—N 3.11 : enzym thủy phân liên kết C—P 1.2 Cơ chế tác dụng enzym thủy phân  Sự khuyết electron liên kết bị thủy phân yếu tố quan trọng định khả dễ dàng phản ứng thủy phân.Tác dụng xúc tác enzyme phụ thuộc vào từng trường hợp phân bố electron đã tờn trước định Enzyme tác dụng bằng cách khác Cơ chế đơn giản cho phép liên hệ "phần dương" liên kết bị thủy phân với tác dụng enzyme là: tâm nhân enzyme tương tác trực tiếp với hai nguyên tử tích điện dương liên kết bị thủy phân Sự tạo thành phức hợp trực tiếp với trung tâm phản ứng làm cho đứt liên kết thủy phân dễ dàng, thuận lợi Enzym colinesterase nhiều esterase khác tác dụng thủy phân chất theo chế Một chế khác liên hệ tính tác dụng enzyme với khuyết electron liên kết bị thủy phân là: enzyme làm tăng khuyết electron vốn đã tồn trước bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với chất vị trí nhiều gần gũi với liên kết bị thủy phân Nhờ vậy, làm cho phân bố electron phân tử chất bị thay đổi theo chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết dễ dàng khiến cho hai nguyên tử liên kết tương tác với tác nhân nhân 1.3 Đặc điểm trung tâm hoạt động enzyme thủy phân Trung tâm hoạt động enzyme thủy phân thường không chứa nhóm ngoại mà chứa acid amine đặc hiệu Thường vòng amidazol histidine nhóm hydroxyl số gốc serine Các thành phần trung tâm hoạt động hình thành liên kết yếu để chất gắn vào Cụ thể nhóm hydroxyl serine hình thành liên kết hydro với ngun tử nitrogen vòng amidazol Chính nhờ liên kết yếu nhóm chức trung tâm hoạt động linh động Khi có cảm ứng chất, theo thuyết enzyme Koshland, nhóm chức di chuyển, định hướng xác để gắn vào  Thứ tự xếp acid amine quanh trung tâm hoạt động: Kimotripxin A — Gly — Asp — Ser — Gly — Tripxin — Gly — Asp — Ser — Gly — Trombin — Asp — Ser — Gly — Kimotripxin — Asp — Ser — Gly — Colinesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala — Carboxylesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala — 1.4 Đặc điểm các chất bị enzyme thủy phân Các chất enzyme thủy phân thường polyme protein, glucid, lipid, cellulose…các chất chứa liên kết bị thủy phân phân tử tích điện dương tạo nên mà Bernard Pullman Albert Pullman gọi “liên kết nhị dương” Ví dụ: liên kết peptide, liên kết glycoside Hình Liên kết glycoside Chính vậy, enzyme muốn thủy phân chất đó, chất phải phù hợp khơng gian phù hợp tĩnh điện trung tâm hoạt động 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme thủy phân  Ảnh hưởng nhiệt độ Sự ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme theo quy luật Vận tốc xúc tác enzyme tăng theo nhiệt độ giới hạn xác định mà phân tử enzyme chưa bị biến tính Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tăng hoạt tính enzyme tăng theo Khi tăng đến nhiệt độ tới hạn hoạt tính xúc tác giảm nhiệt độ tiếp tục tăng enzyme bị biến tính hoạt tính xúc tác Thơng thường đa số enzyme bị biến tính hồn tồn nhiệt độ lớn bằng 70 oC Khi nhiệt độ thấp 0oC enzyme bị biến tính thuận nghịch giảm hoạt tính xúc tác khơng thể hoạt tính xúc tác Mỗi loại enzyme có nhiệt độ tối thích mà thể hoạt tính xúc tác cao Nhiệt độ thích hợp phụ thuộc vào loại enzyme, nguồn thu enzyme, pH, kim loại, chất bảo vệ Thông thường vào khoảng 40 – 50oC  Ảnh hưởng pH pH ảnh hưởng tương tự nhiệt độ pH làm thay đổi trạng thái ion hóa enzyme chất pH thích hợp cho enzyme hoạt động giá trị pH mà enzyme chất tích điện trái dấu mà kết hợp với dễ dàng Đại đa số enzyme thích hợp với pH từ đến 9, có loại hoạt động pH thấp (3,5) cao (11) pH thích hợp loại enzyme phụ thuộc vào ng̀n thu enzyme, chất enzyme thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ, chất  Ảnh hưởng nồng độ chất enzyme Nồng độ chất, enzyme ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme Khi chất thừa, nờng độ enzyme tăng vận tốc phản ứng tăng Khi hết chất, tăng nồng độ enzyme vận tốc phản ứng không tăng Khi nờng độ chất giảm mức độ tiếp xúc enzyme chất giảm nên phản ứng enzyme giảm Khi tăng lượng chế phẩm enzyme sử dụng phản ứng thủy phân xảy nhanh hơn, đồng thời, lượng sản phẩm tạo thành nhiều  Ảnh hưởng chất hoạt hóa ức chế Chất hoạt hóa chất thêm vào phản ứng enzyme làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme chuyển enzyme từ dạng không hoạt động sang dạng hoạt động Do có mặt chất hoạt hóa vận tốc phản ứng enzyme tăng Chất ức chế có mặt phản ứng enzyme làm giảm hoạt tính hoạt tính xúc tác enzyme Các chất kìm hãm hoạt động enzyme thường ion kim loại nặng, phần tử vô cơ, chất hữu cơ, protein chất hay sản phẩm phản ứng Amylase 2.1 Giới thiệu chung Enzyme Amylase Năm 1831,Erhard Friedrich Leuchs (1800-1837) mô tả trình thủy phân tinh bột bằng nước bọt, diện loại enzyme nước bọt “ptyalin”, amylase Lịch sử đại enzyme bắt đầu vào năm 1833 , nhà hóa học Phỏp Anselme Payen v Jean-Franỗois Persoz cụ lp mt phc tạp amylase từ nảy mầm lúa mạch đặt tên “diastase” Năm 1862, Alexander Jakulowitsch Danilewsky (1838-1923) tách amylase tụy từ trypsin Enzyme amylase hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho q trình thủy phân tinh bột, glicogen xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước RR’ +H-OH → RH + R’OH Enzyme amylase có nước bọt, dich tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men vi khuẩn Amylase loại enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt ngành công nghệ thực phẩm 2.2 Phân loại Amylase Endoamylase Exoamylase β-amylase Enzyme khử nhánh γ-amylase α- amylase Khử trực tiếp Khử gián tiếp α- dextrin 6-Glucanohydrolase Oligo-1,6-glucosidase Hiện người ta có 6(Pullulanase) loại enzyme amylase xếp vào (2Transglucosylase) nhóm : Và Amylo-1,6-glucosidase • Endoamylase (enzyme nội bào): gờm có α-amylase nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh chia thành hai loại: khử trực tiếp pullulanase (hay α-dextrin-6-glucanohydrolase) ; khử gián tiếp transglucosylase ( hay oligo-1,6-glucosidase) amylo-1,6-glucosidase • Exoamylase ( enzyme ngoại bào): gờm có β-amylase glucoamylase  Sự khác biệt loại enzyme amylase: - Các loại enzyme amylase khơng khác đặc tính mà khác pH hoạt động tính ổn định với nhiệt - Tốc độ phẩn ứng amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa chất Các enzyme amylase có ng̀n gốc khác có tính chất, chế tác dụng sản phẩm cuối trình thủy phân khác - Amylase có ng̀n gốc khác có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu đặc điểm thủy phân khác • Có loại enzyme amylase thường gặp α-amylase, β-amylase γ-amylase 2.2.1 α-amylase: α-amylase enzyme loại protein thủy phân liên kết α polysaccharide chứa liên kết α tinh bột gycogen, tạo glucose maltose Đây dạng chủ yếu amylase tìm thấy người động vật có vú khác Nó có mặt loại hạt giống sử dụng tinh bột loại lượng dự trữ, chất tiết nhiều loại nấm Như có nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm,tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn  Tính chất:  α-amylase tương đối bền với nhiệt amylase khác lại kém bền với acid  Ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian phân tử enzyme Mặc dù tìm thấy nhiều mơ, amylase chủ yếu có dịch tụy nước bọt, có dạng riêng α-amylase người Chúng có khác tập trung đẳng điện, tách thử nghiệm bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng đặc biệt • Amylase nước bọt (Ptyalin) Amylase tìm thấy nước bọt phân giải tinh bột thành maltose dextrin Nó phân giải phân tử tinh bột lớn khơng hòa tan thành tinh bột hòa tan (amylodextrin, erythrodextrin, achrodextrin), tạo đoạn tinh bột nhỏ cuối maltose Ptyalin hoạt động mối liên kết α (1,4) glycosidic thẳng, hợp chất thủy phân đòi hỏi loại enzym hoạt động sản phẩm phân nhánh Amylase nước bọt bị bất hoạt dày acid dày Hình Enzyme Amilaza nước bọt người Điều kiện tối ưu cho ptyalin :  Tối ưu pH - 5,6-6,9  Nhiệt độ thể người: 37 °C  Sự diện số anion hoạt hóa ( Chloride bromide o hiệu Iodide - hiệu Sulfate phosphate kém hiệu ) • Amylase tuyến tụy α-amylase tụy phân cắt ngẫu nhiên liên kết α (1-4) glycosidic amylose tạo dextrin, maltose, maltotriose Nó thơng qua chế chuyển đơi với giữ cấu hình anomeric Các thử nghiệm amylase thực dễ dàng lipase, làm cho kiểm tra chủ yếu sử dụng để phát theo dõi viêm tụy Các phòng thí nghiệm thường đo amylase tụy amylase tổng số Nếu đo amylase tụy có tăng khơng thể phân biệt với quai bị chấn thương 10 3.4.8 Trong cơng nghiệp xà phòng, các chất tẩy rửa, mỹ phẩm, sản xuất bánh kẹo số ngành khác Người ta bổ sung thêm enzyme protease loại xà phòng diệt khuẩn, kem dưỡng da, xà phòng có tính tẩy rửa cao Ứng dụng enzyme sản xuất bánh kẹo làm tăng mùi vị bánh Ngoài protease ứng dụng nhiều ngành khác như: • Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị • thực phẩm sản xuất số thức ăn kiêng Protease nấm mốc vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn • chăn nuôi gia súc gia cầm Điều chế môi trường dinh dưỡng vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh • Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm Enzyme Lipase ( triacylglyxerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3 ) 4.1 Giới thiệu enzyme lipase  Lipase enzyme tham gia trình xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triaxiglixerol ( dầu thực vật, mỡ động vật ) điều kiện bình thường tạo thành glixerin axit béo tương ứng Lipase xúc tác phản ứng thủy phân từng liên kết α – ester phân tử cắt đứt ba liên kết ester lúc Lipase có hoạt tính mạnh chất khơng tan nước, thể hoạt tính bề mặt  Lipase khác với enzyme esterase điểm thủy phân chất khơng tan nước hoạt tính tăng cường bề mặt phân chia pha chất – nước (interfacial activation) Vì hoạt tính tối ưu lipase thể hệ nhũ tương (dầu nước) ngồi hoạt động mạnh hệ nhũ đảo (nước dầu) dầu hòa tan dung môi hữu Hơn lipase linh hoạt xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester tổng hợp ester đặc hiệu cấu hình khơng gian với đa dạng chất phản ứng 25  Cũng đa số enzyme thủy phân khác, lipase khơng có nhóm ngọai mà có trung tâm họat động với acid amin đặc biệt imidazol histidin nhóm hydroxyl số gốc serine Hình - Lipase thủy phân liên kết ester Hình 7- Khi lipase gắn vào bề mặt lipid nằm bề mặt phân lipid phân pha chất lipidvà nước Trong nước, trung tâm họat động chứa vòng xoắn helix di chuyển cho phép serine bị khóa lại vòng xoắn helix gắn vào trung tâm họat động  Việc ứng dụng lipase ngày trở nên đa dạng đầy tiềm tiến quan trọng gần đã nghiên cứu cấu trúc tinh thể lipase sâu chế xúc tác, hoạt tính bề mặt, tính đặc hiệu chất trung tâm hoạt động 4.2 Nguồn thu enzyme Lipase 4.2.1 Lipase từ động vật Lipase thu nhận từ quan, mô số loại động vật hữu nhũ toàn diện lipase có ng̀n gốc từ người số lipase từ tuyến tụy Những enzyme tuyến tụy tiết tá tràng xúc tác cho thủy phân tryacylglixeron tạo thành axit béo glixeron Bản chất chúng glycoprotein, hoạt tính với phospholipit lại ức chế muối mật Pancreatic lipase : gọi tuyến tụy triacylglycerol lipase, enzyme hòa tan nước tiết tuyến tụy Giống lipase khác, chức để phá vỡ lipid (chất béo) đường ruột Nhưng không giống 26 enzym tuyến tụy khác, chẳng hạn trypsinogen chymotrypsin, tiết enzyme hoạt động không cần phải trải qua chuyển đổi để tiêu hóa chất béo Tuy nhiên, trở nên hiệu có mặt colipase tá tràng Ngồi ra, enzyme có khả phá vỡ chất béo thực phẩm qua phản ứng thủy phân bằng cách phá vỡ liên kết hyđro Hình Mô pancreatic lipase người 4.2.2 Lipase từ thực vật Lipase từ thực vật không ý nhiều so với nguồn thu nhận khác Tuy nhiên gần loại enzyme đã bắt đầu quan tâm nghiên cứu phổ biến Trong lipase từ hạt có dầu quan tâm Những enzyme khác từ nguồn nguyên liệu thu nhận tính đặc hiệu chất, pH tối ưu, khả phản ứng sulfuhydryl, tính kỵ nước khác Những enzyme có quan hệ mật thiết với triacylglyxeron có thân hạt dầu tổng hợp trình nảy mầm hạt 4.2.3 Lipase từ vi sinh vật Đây nguồn enzyme quan tâm sản xuất nhiều theo quy mô công nghiệp Khác với thực vật động vật, vi sinh vật cấu tạo từ tế bào, có uu điểm hẳn thực vật động vật Vi sinh vật có khả tổng hợp lượng enzyme lớn thời gian ngắn ta tự điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme sản xuất Lipase thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men nấm mốc enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tụy Các loại nấm có khả sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus spp, Mucor spp, Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichum spp Đối với nấm men gồm loại: Torulopsis spp, Candida spp Và vi khuẩn có khả sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp, Achromobacter spp, Staphylococcus spp 27 Bảng Một số vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme lipase Vi sinh vật Giống Bacteria (Gram – positive) Bacillus Staphylococcus Fungi Rhizopus Yeasts Candida Actinomycetes Streptomyces Loài B megaterium B cereus B stearothermophilus B subtilis B brevis B themocatemilatus B coagulans B acidocaldarius B themoleovorans S canosus S aureus S hyicus S epidermidis S warneri Rhizop Delemar Rhizop Oryzae Rhizop arrhizus Rhizop nigricans Rhizop nodosus Rhizop microsporous Rhizop Niveus C rugosa C tropicalis C antarctica C cylindracea C parapsilosis C deformans Streptomyces fradiae NCIB 8233 Streptomyces sp PCB27 Streptomyces sp CCN 33 4.3 Phân loại cấu tạo lipase 4.3.1 Phân loại  Theo nguồn gốc: + Lipase từ động vật : thu nhận thường khó hiệu kinh tế khơng cao + Lipase từ thực vật + Lipase từ vi sinh vật : vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để 28 sản xuất enzym với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu nhận chế phẩm dễ dàng thoã mãn mức độ lớn nhu cầu ngành công nghiệp khác  Theo tính chất: + Lipase có tính đặc hiệu vị trí (1) C (cylindracae) rugosa (2) Corynebacterium (3) Staphylococus aureus + Lipase có tính đặc hiệu chất : Cơ chất có khả kết hợp vào trung tâm hoạt động enzyme bị chuyển hoá tác dụng enzym (1’) C rugosa (C18:1 cis-9) (2’) A niger (C10 C12 C18:1 cis-9) (3’) M miehei (C12) 4.3.2 Cấu trúc lipase  Lipase từ động vật + Cấu tạo lipase tuyến tụy từ người gồm hai tiểu phần, phần lớn chứa đuôi N, phần nhỏ chứa đuôi C + Nhân tiểu phần N hình thành sợi xếp song song mặt phẳng gấp nếp β + Tiểu phần C hình thành hai lớp mặt phẳng khơng song song + Tiểu phần N chứa trung tâm hoạt động, liên kết với nhóm glycosyl, liên kết với Ca2+ liên kết với heparin + Trung tâm hoạt động bị che vòng xoắn α mạch ngắn gọi nắp hay nút đậy  Lipase từ nấm + Khơng có tương đờng cấu trúc với lipase tuyến tụy ngồi mối liên hệ chuỗi Gly-X-Ser-X-Gly có liên hệ với trung tâm hoạt động + Cũng có cấu trúc nắp đậy  Lipase từ vi khuẩn + Một số lipase từ chủng Pseudomonas P cepacia, P.glumae, P.flourensence Có kích thước phân tử dao động từ 30-35kDa cho thấy có nhiều đờng đẳn Chuỗi G-X-S-X-G liên kết với trung tâm hoạt 29 động + Lipase từ lồi Bacillus: Có khối lượng phân tử khoảng 19kDa Chuỗi AX-S-X-G liên kết với trung tâm hoạt động 4.4 Tính chất enzyme lipase  Lipase có hoạt tính bề mặt phân pha nước/lipit thuỷ phân chất béo đã nhũ hóa Lipase khác với enzyme esterase khác điểm, esterase  thuỷ phân ester tan nước TAG Lipase có nhiều sữa, hạt có dầu (đậu nành, đậu phộng), ngũ cốc (lúa mạch, yến mạch), trái rau, hệ thống tiêu hóa động vật nhiều loại vi sinh vật Lipase thuỷ phân liên kết ester TAG thuỷ phân số liên kết ester định gốc –OH gốc acid phân tử acid lipit  Phân tử pancreatic lipase ( lipase tuyến tụy ) có đầu kỵ nước gắn với giọt dầu nhờ tương tác kỵ nước, tâm hoạt động enzyme gắn với phân tử chất tâm hoạt động có acid amin Ser, His, Asp có vai trò tham gia vào việc cắt liên kết ester ( tương tự serine proteinase ) Tâm hoạt động lipase chứa nhóm Leucine có tác dụng tạo liên kết kỵ nước với chất lipid đặt chất vào vị trí tâm hoạt động enzym Hoạt tính lipase tăng cường ion Ca 2+, axit béo tự tạo kết hợp với Ca2+ để tạo thành muối khơng tan  Hoạt tính lipase thực phẩm khơng hòan tòan dự đón độ bền thực phẩm qúa trình bảo quản Tính đặc hiêu chất lipase khác biệt nên axit béo tự tạo qúa trình thủy phân khó xác định Ngưỡng giá trị cảm nhận mùi vị axit béo thay đổi 30 khác nên ảnh hưởng lipase lên mùi thực phẩm khác biệt Các thơng tin xác có định lượng axit béo tạo qúa trình bảo quản bằng sắc kí khí Chú thích : HLL: Humicola lanuginosa PcamL: Penicillium camembertii RDL: Rhizopus delemar CLL: Candida lipolytica RJL: Rhizomucor javanicus ROL: Rhizopus oryzae GCL: Geotrichum candidum CRL: Candida rugosa PCL: Pseudomonas cepacia PFL: Pseudomonas fluorescens 4.5 Tính đặc hiệu enzyme 4.5.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng Enzym lipase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân 4.5.2 Đặc hiệu chất  Cơ chất chất có khả kết hợp vào trung tâm hoạt động enzyme chuyển hố tác dụng enzyme  Lipase có tính đặc hiệu tương đối: có khả tác dụng lên kiểu liên kết đinh phân tử chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo thành phần tham gia tạo thành mối liên kết Lipase có khả thuỷ phân tất mối liên kết ester carboxylic  Cơ chế tác dụng lipase: - Thông thường, phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ tạo thành phức hợp trung gian enzyme – chất mà chất hoạt hoá, lẽ chất kết hợp vào enzyme kết cực hóa, chuyển dịch electron biến dạng liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng, kết làm cho phân tử chất trở nên hoạt động mạnh hơn, nhờ tham gia phản ứng dễ dàng 31 - Quá trình tạo thành phức enzyme – chất (ES) biến đổi phức thành sản phẩm, giải phóng enzym tự thường trải qua giai đoạn : + Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với chất bằng liên kết yếu tạo thành phức ES không bền, phản ứng xảy nhanh đòi hỏi lượng hoạt hố thấp + Giai đoạn 2: Khi chất tạo phức với E bò thay đổi cấu hình khơng gian, mức độ bền vững liên kết Kết liên kết bò phá vỡ + Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm enzyme giải phóng dạng tự - Tâm nhân lipase tương tác với nguyên tử tích điện dương liên kết thuỷ phân Sự tạo thành phức hợp trực tiếp với trung tâm phản ứng làm cho đứt liên kết thuỷ phân dễ dàng thuận lợi - Một chế khác liên hệ tính tác dụng enzyme với khuyết electron liên kết thuỷ phân : Enzyme làm tăng khuyết electron vốn đã tờn trước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với chất vị trí nhiều gần gũi với liên kết thuỷ phân Nhờ mà làm cho phân bố electron phân tử chất thay đổi theo chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết dễ dàng khiến cho nguyên tử liên kết tương tác với tác nhân nhân AB + H2O AOH + BH Dưới tác dụng enzym lipase, hợp chất AB kết hợp với enzyme liên kết A-B kéo căng, kèm theo chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A-B gắn nhóm -OH nước vào phần B phân tử Sau hồn thành phản ứng enzyme giải phóng dạng tự Bảng Cho biết đặc tính đặc hiệu số enzym lipase Liên kết bị thuỷ phân Nguồn lipase Tuyến tuỵ, sữa, Pseudomonas fragi, Penicillium roqueforti Các gốc acyl vị trí 1,3 32 Các gốc acyl vị trí 1, Axit oleic linoleic vị trí 1,2 Yến mạch, hạt thầu dầu, Aspergillus flavus Geotrichum candidum ân tử acyl lipit 4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất enzym lipase Cơ chất - Hệ nhũ tương thường - Hệ nhũ tương đảo - Hệ nhũ tương nhỏ (các micell đảo) Nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt độ enzyme Để xác định nhiệt độ tối ưu lipase ta tiến hành xác định hoạt độ nhiệt độ 55, 60, 65, 70, 75°C bằng phương pháp chuẩn độ theo mô tả phần phương pháp nghiên cứu Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase tự cố định Nhiệt độ (ºC) 40 Hoạt độ lipase tự do(U/g) 19,5 55 60 65 70 75 80 27,0 29,7 27.5 20,5 16,5 12,5 Hoạt độ lipase cố định (U/g) 0.5 2,5 5,5 10,0 15,0 11,5 7,5 Lipase cố định bền vùng nhiệt độ 40oC- 60°C (sau 18 hoạt động 52,4 – 66,7% so với hoạt độ ban đầu)  pH pH có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, enzyme hoạt động mạnh dải pH khác Tiến hành xác định hoạt độ lipase tự cố định với giá trị pH thay đổi từ 6,5 – 9,0 với chất dầu đậu nành 5%, nhiệt độ 65°C  Chất hoạt hóa ức chế 33 - Canxi (Ca) hoạt hóa lipase phản ứng thủy phân theo chế: + Kết hợp với enzyme làm thay đổi cấu trúc + Giúp lipase dễ dàng hấp thụ lên bề mặt chất nước + Khử acid béo (sản phẩm phản ứng thủy phân), giảm khả ức chế acid với enzyme - Muối mật hoạt hóa lipase từ tuyến tụy người - Một vài chất ức chế như: + Các hợp chất bề mặt có chứa anion + Protein + Ion kim loại + Acid boronuc + Các hợp chất chứa photpho cabarmate, β- lactone…  Nước Nước môi trường khuyếch tán enzyme chất mà tác nhân tham gia vào phản ứng Nước có ảnh hưởng đến vận tốc chiều hướng phản ứng thủy phân enzyme Nước yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân enzyme, dùng nước làm nhân tố tăng cường hay kìm hãm phản ứng thủy phân có enzyme xúc tác  Áp suất: Áp suất tối ưu Lipozym 17Mpa phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo tristearin Áp suất tối ưu 15mbar cho lipase dùng tổng hợp dẫn xuất AHA ngành mỹ phẩm 34 4.7 Vai trò ứng dụng enzyme lipase 4.7.1 Vai trò enzyme lipase  Lipase thực vai trò quan trọng q trình tiêu hóa , vận chuyển xử lý chất béo hầu hết chế độ ăn uống (ví dụ triglycerides, chất béo, dầu ) tất sinh vật sống Các gen mã hóa lipase chí có mặt số virus  Hầu hết hoạt động lipase vị trí cụ thể trụ glycerol chất lipid (A1, A2 A3) (ruột non) Ví dụ, tuyến tụy lipase người (HPL), enzyme mà phá vỡ chất béo từ chế độ ăn uống nhân hệ thống tiêu hóa, chuyển chất triglyceride tìm thấy loại dầu ăn vào monoglycerides hai axit béo  Một số lipase thể tiết sinh vật gây bệnh nhiễm trùng Đặc biệt, Candida albicans có số lượng lớn lipaza khác nhau, phản ánh hoạt động lipolytic rộng, góp phần tính bền bỉ độc hại C.albicans mô người  Lipase chủ yếu để xúc tác thủy phân acylglyceride số ester khác thiol, polyol hay polyacid ester Ngòai lipase sử dụng làm chất xúc tác phản ứng tổng hợp acylglyceride hay ester có giá trị ứng dụng cao đời sống Lipase có chất globulin sản xuất từ tuyến tụy màng dày động vật Tuy nhiên sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật mang lại độ khiết hiệu suất cao 4.7.2 Ứng dụng enzyme lipase Lipase sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp chế biến dầu béo, thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp hóa chất dược phẩm, sản xuất giấy loại mỹ phẩm Ngồi lipase sử dụng để thúc đẩy phản ứng phân hủy chất thải dạng béo (fatty waste) Một số ứng dụng quan trọng lipase tổng hợp bảng Phần lớn chế phẩm lipase thu nhận từ vi khuẩn, nấm men, nấm móc 35 Bảng Ứng dụng lipase công nghiệp Ngành công nghiệp Chất tẩy rửa Sữa thực phẩm từ sữa Bánh kẹo Thức uống Nước sốt (Food Dressings) Phản ứng Thủy phân chất béo Thực phẩm chất béo sữa, làm chín phơ mai, thay đổi thành phần bơ sữa Cải thiện mùi vị Tăng cường hương vị Cải thiện chất lượng Thực phẩm dinh dưỡng Thịt cá Dầu béo Chuyển hóa ester Cải thiện mùi vị Chuyển hóa ester, thủy phân Hóa chất Phản ứng tổng hợp đặc hiệu Dược phẩm Chuyển hóa ester, thủy phân Mỹ phẩm Giấy Thuộc da Tổng hợp Thủy phân Thủy phân Sản phẩm ứng dụng Loại bỏ dầu mỡ vải Tăng cường hợp chất tạo hương vị cho sữa, phô mai bơ Kéo dài thời gian bảo quản Thức uống Mayonnaise, dressings, whippings Thực phẩm dinh dưỡng Sản phẩm thịt cá loại mỡ Bơ ca cao, margarine, acid béo, glyceron, mono, diglyxeride Hợp chất vòng chiral, hóa chất Chất hỗ trợ tiêu hóa, trao đổi chất Chất nhũ hóa, chất làm ẩm Giấy chất lượng cao Sản phẩm thuộc da 4.7.2.1 Công nghiệp chất tẩy rửa Nhờ vào khả thủy phân chất béo, lipase sử dụng phụ gia công nghiệp chất tẩy rữa Tuy nhiên, lipase phải thõa mãn điều kiện sau: (1) khơng đặc hiệu chất, có khả thủy phân dầu mỡ với thành phần khác nhau, (2) chịu đựng điều kiện khắc nghiệt (pH 10 – 13, 30 0C – 600C), (3) không bị tác động chất hoạt động bề mặt enzyme khác có hỗn hợp chất tẩy rữa Để đạt tính chất kỹ thuật tái tổ hợp di truyền phân tích protein đã nghiên cứu ni cấy thu nhận lipase từ vi sinh vật 4.7.2.2 Công nghiệp thực phẩm Chất béo thành phần quan trọng thực phẩm Tính chất chất béo phụ thuộc vào vị trí acid béo mạch glyceron, độ dài mạch mức độ không bão hòa acid béo Vì lipase có khả thay đổi 36 tính chất chất béo bằng cách thay đổi vị trí acid béo thay nhiều acid béo mạch glyxeron Bơ ca cao chứa thành phâng acid béo palmitic stearic, có điểm nóng chảy 370C, thành phần quan trọng sản xuất chocolate Với công nghệ sử dụng lipase thực phản ứng thủy phân tổng hợp liên kết ester, chất béo thay bơ ca cao đã sản xuất từ chất béo có giá trị khơng cao Một ứng dụng khác sử dụng lipase cố định Rhizumucor miehei thực phản ứng trao đổi ester để thay acid palmitic dầu cọ thành acid stearic, làm giảm hàm lượng acid béo mạch dài vị trí sn-2 bằng cách trao đổi với phân tử C18:0, C18:1 Trong công nghiệp sản xuất phô mai, lipase ứng dụng q trình làm chín để làm tăng thêm hương vị cho sản phẩm Đối với công nghiệp thịt cá, lipase loại bỏ chất béo không mong muốn ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm q trình bảo quản 4.7.2.3 Cơng nghiệp sản xuất giấy Thành phần không ưu nước gỗ, chủ yếu triglyceride sáp gây cản trở trình sản xuất giấy Lipase sử dụng để loại bỏ thành phần khỏi bột giấy trình làm giấy Ngành cơng nghiệp Nippon Paper Industries Nhật Bản đã ứng dụng thành công lipase Candida rugosa thủy phân đến 90% hàm lượng triglyceride có gỗ 4.7.2.4 Tổng hợp hữu Việc sử dụng lipase tổng hợp hóa học hữu ngày trở nên đa dạng tính chất đặc hiệu chất, vị trí cấu hình khơng gian enzyme Phần lớn lipase sử dụng có ng̀n gốc từ vi sinh vật Những enzyme hoạt động bề mặt phân chia hai pha kỵ ưu nước có khả hoạt động tốt dung môi hữu Ứng dụng quan trọng lipase tổng hợp liên kết ester, tạo thành hợp chất tạo hương nguồn nguyên liệu diesel quan trọng Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng mà enzyme thực phản ứng thủy phân tổng hợp liên kết ester 37 4.7.2.5 Chuyển hóa sinh học Sự chuyển hóa sinh học dựa chế phẩm enzyme vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lipase đặc hiệu Đối với vi sinh vật, trình gây đột biến áp dụng để tổng hợp nhiều loại enzyme đặc hiệu thực chuyển hóa chất thông qua vài phản ứng Một số nghiên cứu cho thấy phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đặc hiệu hiệu suất chuyển hóa cao gấp nhiều lần so với việc sử dụng chế phẩm enzyme Kết luận Ngày nay, với phát triển khoa hoc kĩ thuật, vấn đề liên quan đến enzyme ngày quan tâm nghiên cứu nhiều hơn, ứng dụng nhiều có hiệu thực tiễn Emzyme thuỷ phân enzyme quen thuộc sử dụng rộng rãi phổ biến Nó ưng dụng nhiều ngành cơng nghiệp,ngành dược phẩm, thực phẩm chức năng…Enzyme thuỷ phân có vai trò quan trọng cần thiết thề người 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 ... lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên enzyme thủy phân. .. 11 phân nhóm sau: 3.1 : enzym thủy phân liên kết ester 3.2 : enzym thủy phân liên kết glycoside 3.3 : enzym thủy phân liên kết eter 3.4 : enzym thủy phân liên kết peptide 3.5 : enzym thủy phân. .. ứng thủy phân enzyme tạo thành sản phẩm phụ gây độc cho người sử dụng 1 Enzyme thủy phân 1.1 • Thế enzyme thủy phân? Là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân hợp chất hữu với tham gia nước