Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol tt

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Hiện nay, nhu cầu lượng vấn đề nan giải quốc gia giới Trong số nguồn lượng thay dầu mỏ sử dụng (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), lượng sinh học xu phát triển tất yếu, nước nông nghiệp nhập nhiên liệu Dựa vào nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành hệ: Thế hệ I (từ tinh bột ngơ, sắn, mía đường), hệ II (từ sinh khối thực vật thân lúa, ngơ, lúa mỳ, bã mía), hệ thứ III (từ loài vi tảo) hệ IV nhiên liệu tiên tiến (dựa chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa) Chúng phân thành ba nhóm dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) bioethanol (ethanol sinh học) Trong đó, bioethanol quan tâm từ ngày 01/01/2018 phủ ban hành định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay xăng RON 92 toàn quốc Do vậy, nhu cầu sản xuất tiêu thụ bioethanol ngày tăng cao Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung bioethanol theo hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) đường (mía) phổ biến Bên cạnh đó, bioethanol sản xuất từ lignocellulose theo hệ thứ II Nguồn nguyên liệu chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân ngơ…là sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến số phụ phẩm công-nông nghiệp Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu sử dụng chưa hiệu mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống làm chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt Do vậy, việc tận dụng nguồn chất để sản xuất bioethanol giải pháp thích hợp, đặc biệt với quốc gia với nông nghiệp Việt Nam Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose phổ biến khó khăn để tận dụng hiệu nguồn sinh khối cho sản xuất sản phẩm có giá trị cao chủ yếu lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm giải pháp thích hợp để chuyển hóa hiệu vật liệu thành dạng lượng có ích ngày trở nên cấp thiết Theo phương thức truyền thống sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hóa lý (nghiền/nổ hơi) Tuy nhiên, hướng để giải nhiệm vụ sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ loài nấm), chúng biết có hệ enzyme xúc tác hiệu giúp chúng phân hủy tốt lignocellulose để giải phóng đơn vị đường cần thiết cho q trình lên men bioethanol Tuy nhiên, nhìn chung enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu sử dụng trực tiếp chất thơ việc xúc tác chuyển hóa hiệu chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng Với mục đích đề tài NCS “Nghiên cứu phối hợp esterase hệ enzyme thủy phân từ nấm chuyển hóa phụ phẩm cơng-nơng nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy cấu trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rào thay nguồn nguyên liệu truyền thống (vd: ngũ cốc, bắp, sắn), mặt khác tạo thành nguồn lượng giúp giải vấn đề ô nhiễm môi trường đốt xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh lượng thực quốc gia Đây khâu then chốt công nghệ lên men sản xuất bioethanol hệ II Mục tiêu nghiên cứu Hiên nay, khả chuyển hóa vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose phương pháp truyền thống nhiều mặt hạn chế Do vậy, mục tiêu đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu sinh khối giàu lignocellulose từ phụ phẩm công-nông nghiệp thành đường (C C6) có khả lên men cho sản xuất bioethanol Đặc biệt, luận án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả chuyển hóa sinh học Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với enzyme cơng mạch (cellulase/xylanase) mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose Mục tiêu đánh giá khả lên men nguồn dịch đường sau thủy phân “enzyme cocktail” thành bioethanol Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu thực hiện: - Phân lập, sàng lọc tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)]; - Sinh tổng hợp tinh protein enzyme hoạt tính FAE AE từ mơi trường ni cấy nấm xác định đặc tính enzyme tinh - Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành đường đơn (hexose pentose) có khả lên men sử dụng đơn enzyme “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase esterase xúc tác hiệp đồng - Tối ưu quy trình chuyển hóa nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mơ phòng thí nghiệm Những đóng góp luận án - 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) nấm Đảm (Basidiomycota) phân lập sàng lọc khả sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase acetyl esterase) - Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha phân lập tinh từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose Trong đó, feruloyl esterase từ Alt tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg Acetyl esterase từ X polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử M w = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1 U/mg Hai enzyme có độ bền cao khoảng nhiệt độ 40 đến 45 0C pH 5,0 - Enzyme carbohydrate esterases tinh kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) tối ưu thành phần sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thơ (vd mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành đường đơn có khả lên men bioethanol Trong đó, bã mía chọn làm chất phù hợp để sản xuất đường C 5/C6 (vd: glucose, xylose) Bằng quy hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía “enzyme cocktail” 400C, pH 5.0, 48 hoạt độ enzyme cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khô Khi đó, tổng đường lên men 251,86 mg/g Kết hợp xử lý bã mía “enzyme cocktail” axit H2SO4 lỗng (0,1%) đường lên men sinh 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8% - Các đường đơn thu chuyển hóa enzyme chứng minh có khả lên men bioethanol (cồn sinh học) chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) đường (mía), bioethanol sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose loại sinh khối (biomass) phổ biến sinh Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối giải pháp thích hợp, đặc biệt với quốc gia với nông nghiệp Việt Nam Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp nước sản sinh hàng trăm triệu phụ phẩm giàu lignocellulose nguồn cung cấp nguyên liệu vô dồi cho sản xuất lượng sạch, mặt khác giải vấn đề ô môi trường không xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống Theo tài liệu công bố kinh nghiệm nghiên cứu chúng tơi cho thấy, nhìn chung enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) chất thơ Điều khắc phục việc sử dụng hỗn hợp enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa để phân hủy cấu trúc polymer phức tạp Ngoài ra, sàng lọc enzyme ni cấy vi sinh vật có vai trò quan trọng việc tìm enzyme với hoạt tính xúc tác thủy phân cao đặc tính hữu ích Đề tài luận án khơng nhằm giải toàn bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thơ thành bioethanol mà mục tiêu nhằm khai thác sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả lên men Đây khâu then chốt công nghệ lên men sản xuất bioethanol hệ II Bố cục luận án Luận án gồm 163 trang với 21 bảng, 58 hình, 144 tài liệu tham khảo Bố cục luận án: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan (39 trang), Chương 2: Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (26 trang), Chương 3: Kết thảo luận: (67 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) Phụ lục (39 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học, tính mới, nhiệm vụ nội dung nghiên cứu luận án Chương Tổng quan Phần trình bày: Tổng quan phụ phẩm cơng - nơng nghiệp giàu lignocellulose, trình bày nguồn gốc, trạng sử dụng phụ phẩm công-nông nghiệp Việt Nam nói chung nguồn gốc, trạng sử dụng, vấn đề môi trường từ bã mía Việt Nam nói riêng hóa Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose xúc tác sinh học Trong làm bật chế chuyển enzyme thủy phân lignocellulose, nguồn enzyme từ đa dạng nấm Việt Nam, enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm vai trò enzyme carbohydrat esterase thủy phân lignocellulose Tổng quan tình hình sản xuất bioethanol nghiên cứu, sản xuất bioethanol nước Chương 2: Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật + Quả thể nấm tươi thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình sử dụng để phân lập nấm, sàng lọc tinh enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu + Một số chủng nấm chọn lọc từ chủng giống lưu giữ phòng thí nghiệm Sinh học thực nghiệm, Viện + Enzyme thương mại tinh từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and glucuronoxylanase; 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany) hoạt động tối ưu pH 5.0-5.5, nhiệt độ 40-45oC + Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 cung cấp phòng Vi sinh mơi trường, Viện Công nghệ môi trường 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm; Nuôi cấy bảo quản nấm men; Lên men bioethanol 2.2.2 Định danh nấm: Định danh phương pháp hình thái giải phẫu; Định danh phương pháp sinh học phân tử 2.2.3 Sàng lọc hoạt tính esterase lựa chọn chủng nấm 2.2.4 Đánh giá hoạt độ acetyl esterase feruloyl esterase 2.2.5 Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase 2.2.6 Tinh protein enzyme 2.2.7 Phương pháp hóa sinh: Sắc ký mòng (TLC); Sắc kí lỏng hiệu cao HPLC; Xác định peptide phương pháp phổ khối (MS); Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS); Xử lý nguyên liệu (bằng kiềm, axít gia nhiệt); Xác định hàm lượng bioethanol 2.2.8 Xúc tác chuyển hóa sinh học vật liệu giàu lignocellulose 2.2.9 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.10 Phương pháp xử lý số liêu 2.3 Xây dựng sơ đồ nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ xác định điều kiện thích hợp cho mơ hình tối ưu thực nghiệm 2.3.2 Sơ đồ thủy phân bã mía phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” 2.3.3 Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc nấm Từ mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) phân lập 44 chủng nấm thuộc 13 họ định tên khoa học đến loài Các taxon nấm phân lập được: 3.1.1 Ngành nấm đảm Basidiomycota Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr consors, Tr gibbosa, Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G applanatum, Ganoderma sp Họ Coriolaceae: Poria versipora Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates Họ Mycenaceae: Mycena galericulata Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca 3.1.2 Ngành nấm túi Ascomycota Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp (CP564), Nodulisporium sp (CP582) Họ Helotiaceae: Bisporella citrine Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66) Họ Bionectriaceae: Bionectria sp (CP587) 3.2 Khả sinh tổng hợp esterase lựa chọn chủng nấm 3.2.1 Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE) Khả sinh tổng hợp feruloyl esterase 44 chủng nấm lựa chọn đánh giá qua khả phân giải chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) đĩa thạch Chủng Alt tenuissima SP66 biểu hoạt tính feruloyl esterase cao nên lựa chọn cho nghiên cứu để xác định điều kiện nuôi cấy thời gian, chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ pH 3.2.2 Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE) Dịch lên men 44 chủng nấm sau ly tâm để loại bỏ sinh khối thành phần tạp để xác định hoạt tính acetyl esterase (AE) qua khả thủy phân chất p-nitrophenyl acetate Chủng X polymorpha A35 biểu hoạt tính acetyl esterase cao nên lựa chọn cho nghiên cứu tiếp Sau sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase acetyl esterase lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao Alt tenuissima SP66 X polymorpha A35 Sau nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh đặc tính AE FAE sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose thực 3.3 Định danh nấm phương pháp sinh học phân tử SP66 A35 A SP66 A35 M B Hình 3.1 (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số gel agarose 1% (B) Sản phẩm PCR nấm SP66 A35 Từ kết phân loại phương pháp sinh học phân tử phân tích hình thái bào tử kết luận mẫu nấm phân lập ký hiệu SP66 loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae chủng nấm A35 Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae 3.4 Động học sinh tổng hợp enzyme esterase Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase feruloyl esterase hai chủng nấm X polymorpha A35 Alt tenuissima Sp66 sau: Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X polymorpha A35 ni cấy mơi trường có bổ sung nguồn chất rơm, nguồn nitơ pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, đó, hoạt tính acetyl esterase cao đạt 135,4 U/l Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt tenuissima nuôi cấy môi trường có bổ sung nguồn chất rơm, thời gian ni cấy 12 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, đó, hoạt tính acetyl esterase cao đạt 1154,4 U/l 3.5 Tinh enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm 3.5.1 Tinh đặc tính acetyl esterase nấm X polymorpha A35 (XpoAE) Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau tuần cô đặc siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off) Sau đó, protein enzyme biểu hoạt tính XpoAE chất p-nitrophenyl acetate tinh sắc ký lỏng Bước trình rửa giải protein thực qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose kết thu phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II III) Tổng thể tích rửa giải phân đoạn hoạt tính enzyme cao (phân đoạn III) nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75 Sau bước sắc ký lọc gel này, phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE thu (Hình 3.2) Sau q trình tinh thu lượng protein enzyme tinh 20,6 mg, tương đương 27 U hiệu suất 26,8 % với độ tinh 18,3 lần Phân đoạn enzyme tinh sử dụng cho nghiên cứu đặc tính protein enzyme nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng 3.1) Hình 3.2 Tinh XpoAE từ nấm X polymorpha A35 qua bước sắc ký lỏng (A) nm sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ λ=280 (●) hoạt tính XpoAE chất p-nitrophenyl acetate Bảng 3.1 Các bước tinh enzyme XpoAE Các bước tinh Dịch chiết thô Siêu lọc 30-10 kDa DEAE Sepharose (phân đoạn III) SuperdexTM 75 Đặc tính hóa-lý XpoAE: Điện di SDS-PAGE phân đoạn III qua bước tinh cho thấy vạch protein hoạt tính XpoAE sau nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử M W = 44 kDa Trong đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy vạch protein gần kề có giá trị pI 3,5 3,6 (Hình 3.3) Đặc tính hóa-lý XpoAE tương ứng với đặc tính AE cơng bố (34-56 kDa) Hình 3.3 Protein tinh (1,3) biểu hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) gel điện di SDS-PAGE (A) IEF (B); (2,4) protein marke Nhiệt độ pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng enzyme XpoAE tinh chất p-nitrophenyl acetate tiến hành khoảng nhiệt độ từ 35-70°C Kết cho thấy, hoạt tính XpoAE tăng dần từ 40% nhiệt độ 35°C lên cực đại 42°C (100%) Sau đó, tăng nhiệt độ hoạt tính enzyme giảm dần 51% 61°C (Hình 3.4-B) Giá trị pH 5,0 thích hợp Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% pH 6,5 xuống 57% pH 7.0 (Hình 3.4-A) Hình 3.4 Ảnh hưởng pH (A) nhiệt độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh Hình 3.11 Quy trình chiết tách tinh XpoAE từ nấm X polymorpha A35 13 + Tinh enzyme AltFAE từ nấm Alt tenuissima SP66 Quy trình lên men sinh tổng hợp tinh esterase bao gồm bước sau: Ni cấy nấm sinh tổng hợp enzyme môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ): Nấm Alt.tenuissima SP66 nuôi cấy mơi trường bản, sau đó, bổ sung nguồn chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25 oC, pH bình Erlenmeyer 1000 ml thiết bị lên men AmAr (Mumbai, Ấn Độ) điều kiện có sục khí lắc liên tục 200 v/ph Chiết tách dịch enzyme thô siêu lọc: Sau nuôi cấy điều kiện tối ưu, enzyme lọc sơ qua vải thô giấy lọc (GF6 RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc) Dịch chiết có hoạt tính enzyme esterase loại khuẩn ty nấm chất ly tâm 5000-10000 v/ph siêu lọc 10 30 kDa cut-off (UFP 30MW, Amersham BioScience, Vivaflow 200, Polyethersulfon 10MW, Sartorius 5MW, Millipore) 11 0C Tinh protein enzyme sắc ký: Dịch enzyme thơ biểu hoạt tính esterase tinh qua bước sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose Superdex TM 75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với đệm rửa giải Na-acetate (10mM; pH 4,5), NaCl từ 0-1 M cột Superdex 75, đệm Na-acetate (50mM; pH 6,5) Protein rửa giải xác định trực tiếp sử dụng đầu dò λ=280nm phương pháp so màu theo quy trình Bradforf (1976) λ=590/450nm Các phân đoạn có hoạt tính esterase gộp chung, loại bớt dịch hòa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0 Mẫu lưu giữ -20 0C Bước tinh cuối thực với cột trao đổi anion pH 5,0 với đệm Na-acetate 50 mM Từ 5L dịch lên men sau trình tinh thu 13,5 mg protein enzyme FAE/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng 151,2 U Protein sau bước siêu lọc sắc ký đo hoạt độ, đánh giá độ tinh xác định trọng lượng phân tử điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) (Hình 3.12) 14 Dịch môi trường lên men Alt.tenuissima SP66 (5 L/mẻ; protein 1673 mg) Siêu lọc 10 kDa cut-off (cô đến 500 ml; 259,5 mg protein) Sắc ký DEAE Sepharose Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 Xácđịnh hoạt Cặn ly tâm (Loại bỏ) độ enzyme; định lượng protein Dịch sau ly tâm - Lọc chân không (Whatman GF6) - Ly tâm 5000 v/ph 10 phút Sắc ký Q Sepharose Feruloyl esterase tinh (13,5 mg protein; 151,2 U enzyme) Hình 3.12 Quy trình chiết tách tinh AltFAE từ nấm Alt tenuissima SP66 15 3.6 Sàng lọc nguồn chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa sinh học Tiến hành đánh giá sản phẩm đường khử sau chuyển hóa chất rơm rạ (RR), bã mía (MIA), bã cà phê (CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl = 50 U/gds, AltFAE = U/gds XpoAE = U/gds) theo thí nghiệm khác nhau, phản ứng ủ 24 , 40 0C, sản phẩm chuyển hóa xác định sắc ký mỏng (TLC) Hình 3.13 Vết chất đường đơn xuất mỏng Các chất chuẩn đường khử có khả lên men: glucose (R f (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)= 0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) mannose (Rf(Man) = 0,325) Hàm lượng đường khử thu sau chuyển hóa sinh học: Sử dụng phương pháp sắc ký mỏng (TLC) để xác định vết chất đường đơn dung dịch sau chuyển hóa hỗn hợp enzyme ( XpoAE, AltFAE Cell/xyl) chất: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ, rong, bã mía lựa chọn vật liệu nguyên cứu mỏng xuất vết đường đơn đậm nét tổng đường khử thu cao đạt 154,7mg/g Hình 3.14 Tổng đường khử tạo thành sau chuyển hóa đơn enzyme “enzyme cocktail” 3.7 Tối ưu hóa enzyme cocktail mơ hình quy hoạch thực nghiệm Áp dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho hỗn hợp enzyme cocktail để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành đường lên men, phản ứng diễn 40 0C, pH thời gian ủ 48 Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến với phương trình quy hồi mơ tả hiệu chuyển hóa 16 biểu thị qua tổng hàm lượng đường khử sinh phụ thuộc vào thành phần tham gia enzyme đơn với hoạt độ enzyme (x) tương ứng: Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2), XpoAE (x3), phương trình có dạng: y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 x12 , tương ứng hoạt độ (U) “enzyme cocktail” gram bã mía sử dụng Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds với giá trị ymax = 251,86 mg/g 3.8 Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu chuyển hóa 3.8.1 Kết hợp thủy phân bã mía kiềm “enzyme cocktail” Để nâng cao hiệu cho q trình chuyển hóa bã mía trước thủy phân “enzyme cocktail” điều kiện tối ưu, bã mía xử lý NaOH với nồng độ khác để đánh giá hiệu chuyển hóa Bảng 3.4 Tổng đường khử sau thủy phân bã mía kiềm “enzyme cocktail” Stt NaOH (M) (*) Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm dung dịch NAOH, 2,5 giờ, 85 0C Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds 10,8U XpoAE/gds), 48 giờ, 400C, pH 5.0 Các liệu trình bày trung bình hai lần lặp lại 3.8.2 Kết hợp thủy phân bã mía axít “enzyme cocktail” Bảng 3.5 Tổng đường khử sau thủy phân bã mía axít “enzyme cocktail” H2SO4 (C%) Stt 17 (*) Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm dung dịch H2SO4 2,5 giờ, 850C Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), 48 giờ, 400C, pH 5.0 Các liệu trình bày trung bình hai lần lặp lại 3.8.3 Kết hợp thủy phân bã mía thiết bị gia nhiệt “enzyme cocktail” Bảng 3.6 Tổng đường khử sau thủy phân bã mía thiết bị gia nhiệt “enzyme cocktail” Tổng hàm lượng đường khử (mg/g) (*) Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm nước cất thủy phân thiết bị gia nhiệt, 121 0C 120 phút áp suất atm Chuyển hóa sinh học sử dụng “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), 48 giờ, 400C, pH 5.0 Các liệu trình bày trung bình hai lần lặp lại 3.8.4 Hàm lượng đường đơn dung dịch sau chuyển hóa Bảng 3.7 Hàm lượng carbohydrate sau chuyển hóa sinh học Enzyme Hỗn hợp enzyme cocktail (Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE) Trong phương pháp thủy phân bã mía kiềm, axít, gia nhiệt kết hợp với hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE) Xác định phương pháp thủy phân bã mía axít H 2SO4 loãng (0,1%, 850C, 2,5 giờ) kết hợp thủy phân “enzyme cocktail” cho hiệu tốt với tổng đường khử đạt 319,5 mg/g chất Trong đó, hàm lượng glucose xylose, tương ứng 195,4 mg/g 60,4 mg/g đường lên men khác chiếm khoảng 18 % 3.9 Nghiên cứu sản xuất bioethanol 3.9.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường Nguồn dinh dưỡng số nhân tố tác động trực tiếp đến trình sinh trưởng, phát triển vi sinh vật nói chung nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 nói riêng Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu khảo sát để tìm mơi trường lên men bioethanol thích hợp Thí nghiệm tiến hành hai mơi trường BM (dịch đường sau chuyển hóa) mơi trường BM+ (dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thành phần từ môi trường hansen) Bổ sung 3% giống nấm men tổng thể tích dịch lên men, lên men 30 0C, pH = 4,8 Bảng 3.8 Hiệu suất trình lên men môi trường BM BM+ Thời gian Kết Tổng đường khử lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l) Hiệu suất (g/g) (1) Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa 18 (2) Mơi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm số thành phần môi trường Hansen 3.9.2 Thời gian lên men Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men tiến hành 30 0C; pH 4,8, bổ sung 3% giống nấm men theo thể tích sử dụng mơi trường bổ sung thành phần dinh dưỡng môi trường Hansen Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men Stt Thời gian (giờ) 12 24 30 36 48 54 60 72 78 81 10 11 3.9.3 Ảnh hưởng pH Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến trình lên men tiến hành 30 0C; thời gian lên men 78 bổ sung 3% giống nấm men Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men Stt pH 4,3 4,6 4,8 5,2 5,5 3.9.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men tiến hành pH 5.2; thời gian lên men 78 tỷ lệ nấm men bổ sung 3% 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men Stt Nhiệt độ 23 25 28 30 32 34 3.9.5 Tỷ lệ nấm men Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nấm men tiến hành 28 0C; pH 5.2; thời gian lên men 78 tỷ lệ nấm men (%) bổ sung Kết thí nghiệm thể bảng 3.22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men Stt Tỷ lệ nấm men (%) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Như vậy, hàm lượng bioethanol tạo thành cao 14,088 g/l Khi đó, hiệu suất chuyển hóa đạt 0,140 gram/cơ chất bã mía, tương ứng với lượng bioethanol thu 178,0 ml/kg bã mía Hiệu suất lên men bioethanol từ dịch đường sau chuyển hóa đạt 79,6% so với lý thuyết Trong nghiên cứu này, hiệu suất chuyển hóa bã mía thành bioethanol thu cao đạt 178 ml/kg Do vậy, lựa chọn phụ phẩm nơng nghiệp (bã mía) nguồn sinh khối giàu lignocellulose để làm đối tượng sản xuất bioethanol hướng mới, có ý nghĩa thực tiễn cao Việc sử dụng phế thải nơng nghiệp có ưu điểm hàm lượng cellulose phụ phẩm nông nghiệp cao thủy phân tạo lượng đường glucose lớn Bã mía số nhiều nguồn sinh khối phổ biến có nhiều tiềm Việt Nam với thành phần cellulose, lignocellulose chiếm 64%, nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol 20 3.10 Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía Từ kết đạt được, tóm tắt tồn q trình chuyển hóa bã mía thu hồi bioethanol theo sơ đồ sau: Bã mía (DS) (10% w/v) Nghiền nhỏ kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm Xử lý hóa học Điều chỉnh pH Enzyme cocktail: Cell/Xyl:100-160 U/gds, AltFAE:7.56 U/gds, XpoAE:10.8 U/gds, 400C, pH 5, 48 Thủy phân “enzyme cocktail” Dịch đường thủy phân Nguồn dinh dưỡng (g/l): Peptone: 10; KH2PO4: 3; MgSO4.7H2O: Bổ sung dinh dưỡng Điều chỉnh pH môi trường Khử trùng 1210C, 1atm, 20 phút Điều kiện lên men: 280C; pH 5.2; 78 5% nấm men Lên men Bioethanol Chưng cất Thu nhận bioethanol Hình 3.15 Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía 21 Các bước thực thiện: Xử lý học: Bã mía sau thu hoạch xử lý học cách xấy khô, xử lý cách nghiền nhỏ hệ thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) lọc qua rây để đạt kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm Việc nghiền nhỏ với mục đích phá vỡ phần cấu trúc tế bào, tăng diện tích tiếp xúc axít chất Tạo điều kiện cho trình thủy phân diễn với hiệu suất cao Xử lý axít H2SO4: Bã mía (10%; w/v) xử lý cách ngâm dung dịch H 2SO4 loãng nồng độ 0,1% ủ 85 C 2,5 Mục đích trình xử lý giúp tách loại phần lignin, phá vỡ cấu trúc phức tạp tăng khả xúc tác cấu trúc phân tử cellulose Bên cạnh đó, q trình xử lý hóa học thủy phân hemicellulose có thành phần sinh khối Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với chuỗi mạch ngắn so với cellulose Do đó, việc thủy phân hemicellulose dễ dàng thủy phân cellulose Hemicellulose bị thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân tiếp xúc thủy phân cellulose “enzyme cocktail” trình Điều chỉnh pH: Điều chỉnh dung dịch sau chuyển hóa pH nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho hỗn hợp “enzyme cocktail” chuyển hóa sinh học Bổ sung hỗn hợp “enzyme cocktail”: Dịch chuyển hóa sau điều chỉnh pH tiếp tục thủy phân hỗn hợp “enzyme cocktail” với thành phần bao gồm: Cell/Xyl: 100-160 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds XpoAE: 10,8 U/gds, hỗn hợp ủ 400C, pH 5, thời gian ủ 48 điều kiện có khuấy đảo liên tục 200 vòng/phút Bất hoạt enzyme cocktail: Dịch sau thủy phân bất hoạt enzyme cách đun cách thủy 90 oC 10 phút để dừng phản ứng chuyển hóa Ly tâm, loại bã xác định tổng hàm lượng đường khử: Lọc bỏ cặn bã mía thủy phân cách lọc ly tâm Dịch sau q trình chuyển hóa đem xác định tổng hàm lượng đường khử phương pháp DNS Bổ sung thành phần dinh dưỡng: Sau q trình chuyển hóa dịch đường thu bổ sung thêm số thành phần dinh dưỡng môi trường Hansen Điều chỉnh pH môi trường lên men: Điều chỉnh pH 5.2 môi trường lên men bioethanol, cơng đoạn nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 phát triển Lên men bioethanol: Để lên men bioethanol hiệu quả, trình lên men thực nhiệt độ 28 0C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men bổ sung 5%, môi trường lên men dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm thành phần từ môi trường hansen Chưng cất thu nhận bioethanol: 22 Kết thúc trình lên men tiến hành đo nồng độ bioethanol tạo thành dung dịch hệ thống chưng cất phân đoạn nhằm nâng cao độ tinh khiết sản phẩm bioethanol tạo thành Bioethanol bảo quản bình kín, thống gió, tránh ánh sáng nguồn nhiệt Xác định tổng hàm lượng đường khử lại dung dịch sau lên men: Sau kết thúc trình lên men dung dịch lượng định đường khử (nhóm đường pentose) mà nấm men chưa khơng tiêu thụ Để đánh giá hiệu suất trình lên men ngồi việc xác định hàm lượng bioethanol tạo thành việc xác định hàm lượng đường lại (chưa lên men) cần thiết 23 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút kết luận sau: Phân lập 44 chủng nấm thuộc 13 họ Trong đó, 16 chủng thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) 28 chủng thuộc ngành nấm Đảm (Basidiomycota) Sàng lọc chủng nấm Xylaria polymorpha A35 có khả sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase chủng Alternaria tenuissima SP66 có khả sinh tổng hợp enzyme enzyme feruloyl esterase cao Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hai enzyme từ hai chủng nấm tương ứng đạt 135,4 U/l 1154,4 U/l Enzyme feruloyl esterase tinh từ nấm Alt tenuissima SP66 (AltFAE) có trọng lượng phân tử M w = 30,3 kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 11,2 U/mg, enzyme hoạt động tối ưu 42 0C, bền pH Enzyme acetyl esterase tinh từ nấm X polymorpha A35 (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 13,1 Bã mía lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu phù hợp sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” thủy phân năm chất gồm: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ rong biển Áp dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail” để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành đường lên men thực nhiệt độ 40 0C, pH 5, thời gian ủ 48 Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến xác định phương trình quy hồi mơ tả hiệu q trình thủy phân biểu thị thơng qua tổng hàm lượng đường khử tạo thành phụ thuộc vào thành phần hoạt độ (x) “enzyme cocktail” [Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2) XpoAE (x3)] tham gia chuyển hóa, phương trình có dạng: y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 x12 , tương ứng với hoạt độ (U) “enzyme cocktail” gram chất bã mía sử dụng Cell/Xyl: 100 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds XpoAE: 10,8 U/gds với giá trị Ymax = 251,86 mg/g Quá trình chuyển hóa bã mía thực điều kiện tối ưu cách kết hợp xử lý hóa học acid H2SO4 loãng nồng độ 0,1%, ủ 2,5 giờ, 850C xúc tác sinh học hỗn hợp “enzyme cocktail” Khi đó, tổng hàm lượng đường khử sinh đạt 319,5 mg/g chất, hiệu suất chuyển hóa từ bã mía thành đường đạt 49,8% Trong đó, nồng độ glucose xylose tương ứng 195,4 mg/g 60,4 mg/g, đường lên men khác chiếm khoảng 18% Q trình lên men bioethanol thích hợp nhiệt độ 280C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men 5% môi trường với thành phần dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm chất dinh dưỡng môi trường Hansen Trong điều kiện này, hàm lượng bioethanol tạo thành 14,088g/l, hiệu suất lên men bioethanol từ bã mía đạt 0,141 gram/gram, tương ứng 178ml bioethanol/kg bã mía Hiệu suất lên men từ dịch đường chuyển hóa đạt 79,8% so với lý thuyết 24 DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN A Tạp chí quốc tế (SCIE): Do Huu Nghi , René Ullrich, Franco Moritz , Le Mai Huong, Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Martin Hofrichter, Christiane Liers The Ascomycete Xylaria polymorpha Produces an Acetyl Esterase That Solubilises Beech Wood Material to Release Water-soluble Lignin Fragments Journal Korean Soci Appl Biol Chem, 2015, 58 (3), 415-521 D.H Chi, V.D Giap, L.P.H Anh, and D.H Nghi An feruloyl esterase from Alternaria tenuissima that hydrolyses lignocellulosic material to release hydroxycinnamic acids Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53, (6), 654:660 B Tạp chí chuyên ngành nước: Đỗ Hữu Nghị, Vũ Đình Giáp Đỗ Hữu Chí .Nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme axetyl (xylan) esterase nấm Aureobasidium pullulans Var melanigenum SH1 chất phụ phẩm công-nông nghiệp giàu-lignicellulose Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn – kỳ tháng 3/2016, 5662 Vũ Đình Giáp, Đỗ Hữu Chí, Lê Mai Hương, Đỗ Hữu Nghị Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esteraza nấm môi trường nuôi cấy lỏng với chất giàu lignoxelluloza TC Nông nghiệp & PTNT, 2016, 12, 103:110 Đỗ Hữu Nghị, Lê Mai Hương, Lê Thị Bích Thảo, Vũ Đình Giáp, Nguyễn Trung Hiếu, Đỗ Hữu Chí Feruloyl esterase từ chủng nấm Alternaria tenuissima khảo sát hoạt tính chống oxy hóa sản phẩm phản ứng enzyme Tạp chí Y học VN, 2016, 445, 143:148 Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Pham Hong Hai, Tang Thi Chinh, Do Huu Nghi Using experimental planning to optimize the hydrolysis of sugar cane bagasse into fermentable sugars for bioethanol production by fungal enzyme mixture Vietnam Journal of Science and Technology, 2017, 55 (4), 419:428 25 ... (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu sinh khối giàu lignocellulose từ phụ phẩm công- nông nghiệp thành đường (C C6) có khả lên men cho sản xuất bioethanol Đặc biệt, luận án sử dụng enzyme. .. pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật + Quả thể nấm tươi thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình sử dụng để phân lập nấm, sàng lọc tinh enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu + Một số chủng nấm. .. chuyển hóa pH nhằm tạo điều kiện thu n lợi cho hỗn hợp enzyme cocktail” chuyển hóa sinh học Bổ sung hỗn hợp enzyme cocktail”: Dịch chuyển hóa sau điều chỉnh pH tiếp tục thủy phân hỗn hợp “enzyme