Mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học.
I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Hiện nay, nhu cầu lượng vấn đề nan giải quốc gia giới Trong số nguồn lượng thay dầu mỏ sử dụng (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), lượng sinh học xu phát triển tất yếu, nước nông nghiệp nhập nhiên liệu Dựa vào nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành hệ: Thế hệ I (từ tinh bột ngơ, sắn, mía đường), hệ II (từ sinh khối thực vật thân lúa, ngơ, lúa mỳ, bã mía), hệ thứ III (từ loài vi tảo) hệ IV nhiên liệu tiên tiến (dựa chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa) Chúng phân thành ba nhóm dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) bioethanol (ethanol sinh học) Trong đó, bioethanol quan tâm từ ngày 01/01/2018 phủ ban hành định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay xăng RON 92 toàn quốc Do vậy, nhu cầu sản xuất tiêu thụ bioethanol ngày tăng cao Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung bioethanol theo hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) đường (mía) phổ biến Bên cạnh đó, bioethanol cịn sản xuất từ lignocellulose theo hệ thứ II Nguồn nguyên liệu chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân ngơ…là sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến số phụ phẩm công-nông nghiệp Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu sử dụng chưa hiệu mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống làm chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt Do vậy, việc tận dụng nguồn chất để sản xuất bioethanol giải pháp thích hợp, đặc biệt với quốc gia với nông nghiệp Việt Nam Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose phổ biến khó khăn để tận dụng hiệu nguồn sinh khối cho sản xuất sản phẩm có giá trị cao chủ yếu lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm giải pháp thích hợp để chuyển hóa hiệu vật liệu thành dạng lượng có ích ngày trở nên cấp thiết Theo phương thức truyền thống sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hóa lý (nghiền/nổ hơi) Tuy nhiên, hướng để giải nhiệm vụ sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ loài nấm), chúng biết có hệ enzyme xúc tác hiệu giúp chúng phân hủy tốt lignocellulose để giải phóng đơn vị đường cần thiết cho q trình lên men bioethanol Tuy nhiên, nhìn chung enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu sử dụng trực tiếp chất thơ việc xúc tác chuyển hóa hiệu chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng Với mục đích đề tài NCS “Nghiên cứu phối hợp esterase hệ enzyme thủy phân từ nấm chuyển hóa phụ phẩm cơng-nơng nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy cấu trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rào thay nguồn nguyên liệu truyền thống (vd: ngũ cốc, bắp, sắn), mặt khác tạo thành nguồn lượng giúp giải vấn đề ô nhiễm môi trường đốt xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh lượng thực quốc gia Đây khâu then chốt công nghệ lên men sản xuất bioethanol hệ II Mục tiêu nghiên cứu Hiên nay, khả chuyển hóa vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose phương pháp truyền thống nhiều mặt hạn chế Do vậy, mục tiêu đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu sinh khối giàu lignocellulose từ phụ phẩm công-nông nghiệp thành đường (C5 C6) có khả lên men cho sản xuất bioethanol Đặc biệt, luận án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả chuyển hóa sinh học Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với enzyme cơng mạch (cellulase/xylanase) mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose Mục tiêu đánh giá khả lên men nguồn dịch đường sau thủy phân “enzyme cocktail” thành bioethanol Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu thực hiện: - Phân lập, sàng lọc tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)]; - Sinh tổng hợp tinh protein enzyme hoạt tính FAE AE từ mơi trường ni cấy nấm xác định đặc tính enzyme tinh - Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành đường đơn (hexose pentose) có khả lên men sử dụng đơn enzyme “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase esterase xúc tác hiệp đồng - Tối ưu quy trình chuyển hóa nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mơ phịng thí nghiệm Những đóng góp luận án - 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) nấm Đảm (Basidiomycota) phân lập sàng lọc khả sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase acetyl esterase) - Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha phân lập tinh từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose Trong đó, feruloyl esterase từ Alt tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg Acetyl esterase từ X polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1 U/mg Hai enzyme có độ bền cao khoảng nhiệt độ 40 đến 450C pH 5,0 - Enzyme carbohydrate esterases tinh kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) tối ưu thành phần sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thơ (vd mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành đường đơn có khả lên men bioethanol Trong đó, bã mía chọn làm chất phù hợp để sản xuất đường C5/C6 (vd: glucose, xylose) - Bằng quy hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía “enzyme cocktail” 400C, pH 5.0, 48 hoạt độ enzyme cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khơ Khi đó, tổng đường lên men 251,86 mg/g Kết hợp xử lý bã mía “enzyme cocktail” axit H2SO4 lỗng (0,1%) đường lên men sinh 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8% - Các đường đơn thu chuyển hóa enzyme chứng minh có khả lên men bioethanol (cồn sinh học) chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) đường (mía), bioethanol sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose loại sinh khối (biomass) phổ biến sinh Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối giải pháp thích hợp, đặc biệt với quốc gia với nông nghiệp Việt Nam Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp nước sản sinh hàng trăm triệu phụ phẩm giàu lignocellulose nguồn cung cấp nguyên liệu vô dồi cho sản xuất lượng sạch, mặt khác giải vấn đề ô môi trường không xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống Theo tài liệu công bố kinh nghiệm nghiên cứu chúng tơi cho thấy, nhìn chung enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) chất thô Điều khắc phục việc sử dụng hỗn hợp enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa để phân hủy cấu trúc polymer phức tạp Ngoài ra, sàng lọc enzyme ni cấy vi sinh vật có vai trị quan trọng việc tìm enzyme với hoạt tính xúc tác thủy phân cao đặc tính hữu ích Đề tài luận án không nhằm giải tồn bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thơ thành bioethanol mà mục tiêu nhằm khai thác sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả lên men Đây khâu then chốt công nghệ lên men sản xuất bioethanol hệ II Bố cục luận án Luận án gồm 163 trang với 21 bảng, 58 hình, 144 tài liệu tham khảo Bố cục luận án: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan (39 trang), Chương 2: Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (26 trang), Chương 3: Kết thảo luận: (67 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) Phụ lục (39 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học, tính mới, nhiệm vụ nội dung nghiên cứu luận án Chương Tổng quan Phần trình bày: - Tổng quan phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose, trình bày nguồn gốc, trạng sử dụng phụ phẩm công-nông nghiệp Việt Nam nói chung nguồn gốc, trạng sử dụng, vấn đề mơi trường từ bã mía Việt Nam nói riêng - Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose xúc tác sinh học Trong làm bật chế chuyển hóa enzyme thủy phân lignocellulose, nguồn enzyme từ đa dạng nấm Việt Nam, enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm vai trò enzyme carbohydrat esterase thủy phân lignocellulose - Tổng quan tình hình sản xuất bioethanol nghiên cứu, sản xuất bioethanol nước Chương 2: Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật + Quả thể nấm tươi thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình sử dụng để phân lập nấm, sàng lọc tinh enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu + Một số chủng nấm chọn lọc từ chủng giống lưu giữ phịng thí nghiệm Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên + Enzyme thương mại tinh từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and glucuronoxylanase; 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany) hoạt động tối ưu pH 5.0-5.5, nhiệt độ 40-45oC + Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 cung cấp phịng Vi sinh mơi trường, Viện Cơng nghệ mơi trường 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm; Nuôi cấy bảo quản nấm men; Lên men bioethanol 2.2.2 Định danh nấm: Định danh phương pháp hình thái giải phẫu; Định danh phương pháp sinh học phân tử 2.2.3 Sàng lọc hoạt tính esterase lựa chọn chủng nấm 2.2.4 Đánh giá hoạt độ acetyl esterase feruloyl esterase 2.2.5 Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase 2.2.6 Tinh protein enzyme 2.2.7 Phương pháp hóa sinh: Sắc ký mịng (TLC); Sắc kí lỏng hiệu cao HPLC; Xác định peptide phương pháp phổ khối (MS); Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS); Xử lý nguyên liệu (bằng kiềm, axít gia nhiệt); Xác định hàm lượng bioethanol 2.2.8 Xúc tác chuyển hóa sinh học vật liệu giàu lignocellulose 2.2.9 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.10 Phương pháp xử lý số liêu 2.3 Xây dựng sơ đồ nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ xác định điều kiện thích hợp cho mơ hình tối ưu thực nghiệm 2.3.2 Sơ đồ thủy phân bã mía phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” 2.3.3 Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Phân lập sàng lọc nấm Từ mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) phân lập 44 chủng nấm thuộc 13 họ định tên khoa học đến loài Các taxon nấm phân lập được: 3.1.1 Ngành nấm đảm Basidiomycota Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr consors, Tr gibbosa, Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G applanatum, Ganoderma sp Họ Coriolaceae: Poria versipora Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates Họ Mycenaceae: Mycena galericulata Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca 3.1.2 Ngành nấm túi Ascomycota Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp (CP564), Nodulisporium sp (CP582) Họ Helotiaceae: Bisporella citrine Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66) Họ Bionectriaceae: Bionectria sp (CP587) 3.2 Khả sinh tổng hợp esterase lựa chọn chủng nấm 3.2.1 Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE) Khả sinh tổng hợp feruloyl esterase 44 chủng nấm lựa chọn đánh giá qua khả phân giải chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) đĩa thạch Chủng Alt tenuissima SP66 biểu hoạt tính feruloyl esterase cao nên lựa chọn cho nghiên cứu để xác định điều kiện nuôi cấy thời gian, chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ pH 3.2.2 Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE) Dịch lên men 44 chủng nấm sau ly tâm để loại bỏ sinh khối thành phần tạp để xác định hoạt tính acetyl esterase (AE) qua khả thủy phân chất p-nitrophenyl acetate Chủng X polymorpha A35 biểu hoạt tính acetyl esterase cao nên lựa chọn cho nghiên cứu tiếp Sau sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase acetyl esterase lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao Alt tenuissima SP66 X polymorpha A35 Sau nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh đặc tính AE FAE sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose thực 3.3 Định danh nấm phương pháp sinh học phân tử SP66 A35 A SP66 A35 M B Hình 3.1 (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số gel agarose 1% (B) Sản phẩm PCR nấm SP66 A35 Từ kết phân loại phương pháp sinh học phân tử phân tích hình thái bào tử kết luận mẫu nấm phân lập ký hiệu SP66 loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae chủng nấm A35 Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae 3.4 Động học sinh tổng hợp enzyme esterase Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase feruloyl esterase hai chủng nấm X polymorpha A35 Alt tenuissima Sp66 sau: Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X polymorpha A35 nuôi cấy môi trường có bổ sung nguồn chất rơm, nguồn nitơ pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, đó, hoạt tính acetyl esterase cao đạt 135,4 U/l Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt tenuissima ni cấy mơi trường có bổ sung nguồn chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, đó, hoạt tính acetyl esterase cao đạt 1154,4 U/l 3.5 Tinh enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm 3.5.1 Tinh đặc tính acetyl esterase nấm X polymorpha A35 (XpoAE) Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau tuần cô đặc siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off) Sau đó, protein enzyme biểu hoạt tính XpoAE chất p-nitrophenyl acetate tinh sắc ký lỏng Bước trình rửa giải protein thực qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose kết thu phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II III) Tổng thể tích rửa giải phân đoạn hoạt tính enzyme cao (phân đoạn III) nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75 Sau bước sắc ký lọc gel này, phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE thu (Hình 3.2) Sau trình tinh thu lượng protein enzyme tinh 20,6 mg, tương đương 27 U hiệu suất 26,8 % với độ tinh 18,3 lần Phân đoạn enzyme tinh sử dụng cho nghiên cứu đặc tính protein enzyme nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng 3.1) Hình 3.2 Tinh XpoAE từ nấm X polymorpha A35 qua bước sắc ký lỏng (A) sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ λ=280 nm (●) hoạt tính XpoAE chất p-nitrophenyl acetate Bảng 3.1 Các bước tinh enzyme XpoAE Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U mg-1) Hiệu suất (%) Độ tinh (lần) Dịch chiết thô 1408,0 1009 0.7 100 1,0 Siêu lọc 30-10 kDa 872,1 944 1.1 93,6 1,5 DEAE Sepharose (phân đoạn III) SuperdexTM 75 86,0 432 5.0 42,8 7,0 20,6 270 13.1 26,8 18,3 Các bước tinh Đặc tính hóa-lý XpoAE: Điện di SDS-PAGE phân đoạn III qua bước tinh cho thấy vạch protein hoạt tính XpoAE sau nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW = 44 kDa Trong đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy vạch protein gần kề có giá trị pI 3,5 3,6 (Hình 3.3) Đặc tính hóa-lý XpoAE tương ứng với đặc tính AE cơng bố (34-56 kDa) Hình 3.3 Protein tinh (1,3) biểu hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) gel điện di SDS-PAGE (A) IEF (B); (2,4) protein marke Nhiệt độ pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng enzyme XpoAE tinh chất p-nitrophenyl acetate tiến hành khoảng nhiệt độ từ 35-70°C Kết cho thấy, hoạt tính XpoAE tăng dần từ 40% nhiệt độ 35°C lên cực đại 42°C (100%) Sau đó, tăng nhiệt độ hoạt tính enzyme giảm dần cịn 51% 61°C (Hình 3.4-B) Giá trị pH 5,0 thích hợp Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% pH 6,5 xuống 57% pH 7.0 (Hình 3.4-A) Hình 3.4 Ảnh hưởng pH (A) nhiệt độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh Độ bền nhiệt pH enzyme XpoAE: Enzyme tương đối bền nhiệt độ 400C sau ủ, sau giảm 50% hoạt tính ủ thời gian lâu Hoạt tính enzyme giảm nhanh 600C hầu hết hoạt tính sau ủ nhiệt độ Enzyme tinh cho thấy bền hoạt tính pH 5,0 90% hoạt tính thời gian ủ điều kiện axít mạnh (pH 3; Hình 3.5) Enzyme XpoAE tinh từ nấm X polymorpha A35 tương đối bền khoảng nhiệt độ 40°C pH Hình 3.5 Độ bền enzyme XpoAE tinh từ nấm X polymorpha A35 điều kiện nhiệt độ (A) pH (B) khác nhau: (A): ♦ 40 oC, ▲60 oC; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 3.5.2 Tinh đặc tính feruloyl esterase Alt tenuissima SP66 (AltFAE) Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau tuần siêu lọc 10 kDa cut-off, qua protein tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ loại bỏ Sau đó, protein enzyme biểu hoạt tính feruloyl esterase chất methyl ferulate tinh sắc ký lỏng Bước trình rửa giải protein thực qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose Sau bước sắc ký thứ độ tinh tăng khơng đáng kể (từ 1,4 lần) loại phần lớn chất mầu (có thể hợp chất polyphenolic) khỏi protein hoạt tính FAE đích Tổng thể tích rửa giải phân đoạn hoạt tính enzyme cao nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75 Hiệu tinh cao bước sắc ký lọc gel này, thể độ tinh tăng từ ~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%) Trong đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình 3.6) bước độ tinh tăng lên 35,8 lần lượng protein tổng hoạt tính tương ứng với hiệu suất tinh giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.2) Như vậy, bước tinh cuối cần thiết cho nghiên cứu (yêu cầu độ tinh tối đa), nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ Alt tenuissima SP66 sử dụng sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao tiết kiệm thời gian, chi phí Hình 3.6 Tinh AltFAE từ nấm Alt tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q Sepharose® (●) Hoạt tính AltFAE chất methyl ferulate, (─) protein hấp thụ λ=280 nm Bảng 3.2 Tinh enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt tenuissima SP66 Các bước tinh Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U mg-1) Hiệu suất (%) Độ tinh (lần) Dịch chiết thô 1673,2 523,7 0,3 100 1,0 Siêu lọc 10 kDa 259,5 421,7 1,6 80,5 5,2 DEAE Sepharose 79,1 305,4 3,9 58,3 12,3 SEC SuperdexTM 75 24,1 228,3 9,5 43,6 30,3 Q Sepharose® 13,5 151,2 11,2 28,9 35,8 Đặc tính hóa-lý AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh cuối qua cột Q Sepharose® cho thấy băng protein biểu hoạt tính FAE (cơ chất methyl ferulate) sau nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3 kDa (Hình 3.7) Hình 3.7 Protein tinh (1) biểu hoạt tính feruloyl esterase (AltFAE) gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker Nhiệt độ pH tối ưu: Nhiệt độ enzyme AltFAE xác định khoảng từ 30-800C pH từ 4,0-9,0 Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% pH 7.0 xuống 84% pH 9.0 (Hình 3.8-A) Enzyme tinh ổn định suốt ủ pH trung hịa với hoạt tính cịn lại 97% pH 6.0 89% pH 8.0 Ngược lại, ủ môi trường axit (pH 4.0) làm hoạt độ enzyme 57% sau ủ Khi ủ 600C làm cho hoạt tính 50% vòng giờ, nửa hoạt độ ban đầu xác định sau ủ 400C, nhiệt độ tăng lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm cịn 30% Do vậy, nhiệt độ tối ưu enzyme AltFAE 42°C pH (Hình 3.8-B) Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ (A) pH (B) lên enzyme AltFAE Phản ứng thực nhiệt độ từ 30-80°C pH từ 4-9 Các thí nghiệm thực ba lần, độ lệch chuẩn (SD)