Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực miền trung và miền nam việt nam

Nhândòng thành công và giải được bộ gen DNA-A của virus này, thông qua phân tích trình tự, đặc trưng phân tử và phả hệ cho thấy đây là 1 loài mới thuộc chi Begomovirus gây hại trên ớt và

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cán bộ, công nhân viên thuộc Trung tâmBệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nộng nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điềukiện cho tôi làm việc trong suốt quá trình thực tập tại Trung tâm.

Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành tới các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ mônCông nghệ sinh học thực vật cũng như các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, trường Đạihọc Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi học tập ởtrường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, người thân các anh chị em và bạn bè đã giúp đỡ,động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

PCR Polymerase Chain Reaction

RCA Rolling circle amplification

TAE Tris – acetate – EDTA

β- ME Beta- Mercaptoethanol

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gen củamộtbipartite begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây

ớt đã được Nguyễn Đức Anh phân lập năm 2013 Kết quả là toàn bộ bộ gen của mẫu

begomovirus đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue Chúng tôi

cũng đã giải trình tự và thu được toàn bộ bộ gen của mẫu virus với kích thước khoảng 2.7 kb

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về begomovirus trên ớt và cà chua ở miền Trung vàmiền Nam Việt Nam, begomovirus mới gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt ở hai vùng này Nhândòng thành công và giải được bộ gen DNA-A của virus này, thông qua phân tích trình tự, đặc

trưng phân tử và phả hệ cho thấy đây là 1 loài mới thuộc chi Begomovirus gây hại trên ớt và được chúng tôi đặt tên là Chilli leaf curl virus (CLCV).

kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet và Stanley, 2005), lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn

(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.

Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai

phân tử DNA-A và DNA-B) Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNA-A đã gây triệu chứngđiển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệuchứng bệnh Gần đây, một loại phân tử DNA vòng đơn nữa, có kích thước khoảng 1 nửa bộ gen

begomovirus thường được phát hiện thấy có liên quan với nhiều bệnh do begomovirus gây ra

và được gọi là các DNA-β Các phân tử DNA-β này phụ thuộc vào begomovirus để nhân lên và

do đó được xem là các phần tử vệ tinh của begomovirus Vai trò của phân tử DNA-β trong hình

thành triệu chứng bệnh không thống nhất, một số begomovirus chỉ có thể tạo ra triệu chứngbệnh với sự có mặt của phân tử DNA-β trong khi các loài khác lại không cần Do đó việcphòng trừ bệnh xoăn vàng lá càng trở nên khó khăn hơn

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh

xoăn vàng lá cà chua – một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế

giới(Moriones và cộng sự, 2007) Hiện nay, có tới 50 begomovirusphân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet và cộng sự, 2008) Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa);

mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rấtthấp Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử (Moriones vàNavas-Castillo, 2000)

Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus(Ha, 2007) Mặc dù vậy số lượng loài begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít

chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại(Green và cộng sự,2001),(Ha, 2007).Theo điều tra hiện nay, bệnh do begomovirus gây hại trên diện rộng và không

chỉ gây bệnh trên cà chua, chúng còn gây bệnh trên nhiều loài cây khác như ớt, họ đậu đỗ, đu

đủ, bầu bí Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam”

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục tiêu

- Giải trình tự mẫu virus mới được phân lập

- Phân tích đặc trưng phân tử của các mẫu virus trên ớt và cà chua ở miền Trung và miềnNam Việt Nam

- Nhân dòng và giải trình tự các mẫu virus trên ớt và cà chua đã được chọn, bước đầuđịnh danh các virus

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

II.1 Những nghiên cứu nước ngoài

II.1.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua

Ớt là một loại quả của các cây thuộc chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae) Ớt có nguồn gốc

từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau,

và thuốc Hiện nay, Ấn Độ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗinăm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt

Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban Nha lan

truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu Cà chua là loàitrái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trênThế giới trong năm 2009 Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng mộtphần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ Các khu vực chế biếntại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz và cộng

sự, 1997)

II.1.2 Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây họ cà

Lịch sử bệnh xoăn vàng lá cà chua

Bệnh xoăn lá cà chua được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel Các

vụ dịch bệnh đã xuất hiện rải rác vào những năm 60, trở thành nghiêm trọng vào đầu nhữngnăm 70 khi thiệt hại năng suất có thể đạt 100 % Vào cuối những năm 70, tất cả các vùng trồng

cà chua tại Trung Đông đã bị nhiễm bệnh

Bệnh đã được báo cáo tại vùng Đông Nam Á (Thái Lan và Đài Loan) châu Phi và Châu Âu vàonhững năm 80 Bệnh lần đầu tiên được công bố tại Châu Mỹ vào năm 1993 Hiện nay, bệnhxoăn vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới(Picó vàcộng sự, 1996; Ghanim và cộng sự, 2001; Moriones và cộng sự, 2007)

2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá

2.3 Đặc điểm của Begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá

2.3.1 Phân loại chi Begomovirus

Việc phân loại virus gây bệnh được chẩn đoán theo Uỷ ban Quốc tế về Phân loại Virus(International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV) dựa vào đặc điểm cấu tạo, hình thái

của virus cũng như mối quan hệ huyết thanh và các đặc tính khác như đặc điểm lan truyền, lâynhiễm, phạm vi kí chủ đặc biệt là các đặc điểm của DNA Tên gọi của virus hại thực vật quyđịnh dùng tiếng Anh bao gồm tên của cây kí chủ chính, triệu chứng bệnh trên cây kí chủ đó và

cuối cùng là từ virus Ví dụ: virus gây bệnh khảm thuốc lá - Tobacco mosaic virus - viết tắt là

TMV

Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế

giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực bán cầuđông bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á(Rybicki, 1994; Padidam và cộng sự, 1999)

Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm

bộ gen Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus

của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của

cụm Tân thế giới (Rybicki, 1994) Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của

cụm Cựu thế giới (Harrison và cộng sự, 2002)

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổtiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay Các virus này sau đó tiếnhóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới

Gần đây dựa trên phân tích hệ thống phát sinh phát hiện ra rằng CoYVV ở Việt Nam không cóORF AV2 và có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong protein vỏ (CP), virus này giống với cụmTân thế giới hơn là cụm Cựu thế giới Sự có mặt của CoYVV ở Việt Nam đã đưa ra giả thuyếtrằng virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu thế giới trước khi bị phân chia ở

kỷ Gondwana (Ha và cộng sự, 2008)

Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi phân tử DNA-A Theo Fauquet et al.,2008, việc phân loại loài trong chi begomovirus tuân thủ một số

tiêu chuẩn sau:

(i) Thành phần của genome có hay không có DNA-B

(ii) Tổ chức bộ gen có hay không có gen AV2

(iii) Protein Rep không có khả năng tái bản trans trong thành phần bộ gen thì có thể

ghi nhận loài mới Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ một thay đổi nhỏ ở vị trí liên kết với Rep có thểngăn cản sự tương tác chức năng và sự tái tổ hợp của virus

(iv) Đặc điểm của protein vỏ Mức độ tương đồng của trình tự aminoacid <90% thìghi nhận là loài mới, tuy nhiên mức độ tương đồng nucleotide của toàn bộ bộ gen vẫn là cầnthiết cho việc xác nhận phân loại virus

2.3.2 Hình thái của Begomovirus

Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà

chua nói riêng và begomovirrus nói chung

thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus).

Các Geminivirus đều có cấu trúc phân tử

(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu

20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác

đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗihình

cầu đa diện kép (gemini) Do nối với nhau

nên 2 hình cầu này không

2.1Hinh thái của begomovirus

2.3.3 Cấu trúc genome của Begomovirus

Begomovirus có bộ gen đơn có phân tử DNA-A hoặc bộ gen kép bao gồm hai phân tử DNA-A và

DNA-B Cấu trúc của DNA-A là tương tự nhau ở hai nhóm virus này

2.3.3.1 Cấu trúc của phân tử DNA-A

Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm có 6 ORF được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau.Theo chiều kim đồng hồ có hai gen AV1 và AV2 Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức

năng lan truyền Begomovirus qua vector và nhập nhân tế bào Gen AV2 mã hóa Protein có chức

năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus Ngược chiều kimđồng hồ gồm có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4 Trong đó, gen AC1(rep) mã hóa protein tái bản(Rep protein) có chức năng tái sinh và tương tác với Protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế

bào Gen AC2 (TrAP) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòngthủ cuả cây Gen AC4 (Ren) mã hóa protein tăng cường tái sinh có chức năng tương tác vớiprotein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào Gen AC4 mã hóa protein có chức năng cảm ứng triệuchứng và di chuyển hệ thống (Ha và cộng sự, 2008).

(v)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus

(http://wcrc.confex.com)

2.3.3.2 Cấu trúc của phân tử DNA-B.

DNA-B của các begomovirus kép mã hóa cho 2 protein BV1 và BC1 cả hai protein này đều liên

quan trong việc di chuyển của virus

BV1 là một protein con thoi:BV1 có chức năng như là một protein con thoi, nó có chức năng vận

chuyển virus vào và ra khỏi tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus tronglúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP

BV1 tương tác với BC1 trong việc di chuyển giữa các tế bào:Bắt đầu từ nhân BV1 tạo một phức

hợp với ssDNA, phức hợp này đi ra tế bào chất và kết hợp với BC1 tạo thành phức hợp BV1 :ssDNA : BC1 sau đó di chuyển đến sợi liên bào và chuyển sang tế bào khác(Gafni và Epel,

2002).Vùng C cuối của BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) được xác định là yếu tố cần thiết

cho sự tương tác với BC1

BC1 là một protein vận chuyển.Chức năng của BV1 giống như là một protein vận chuyển đã được làm rõ trong hai trường hợp sau: (1) BV1 của virus Bean dwarf mosaic virus (BDMV) đã

làm tăng size exclusion limit (SEL) của sợi liên bào (Tice và cộng sự, 2000); (2) BV1 của

Squash leaf curl virus (SqLCV) đã kích thích tạo ra các cấu trúc dạng ống bắt nguồn từ luới nội

chất, các ống này làm cho virus dễ dàng di chuyển giữa các tế bào (VARMA và Malathi, 2003)

BC1 có liên quan trong tính gây bệnh.Sự kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã được chứng

minh thông qua thí nghiệm chuyển gen Thuốc lá và cà chua đã được chuyển gen BC1 của

Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình của virus xâm

nhiễm đã được nhận thấy

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus(Ha và cộng sự, 2008)

2.3.3.3 Đặc điểm của vùng IR

Các đơn vị sao chép ngược nhau trên phân tử DNA-A và DNA-B cách nhau bởi vùng liên gen(itergenic region (IR)), ở hầu hết các trường hợp chúng chia sẻ 1 vùng lặp cao xấp xỉ 200nucleotide, gọi là vùng chung (common region (CR)) Vùng CR có chứa một điểm bắt đầu tái

bản (ori) có tổ chức bao gồm một cấu trúc thòng lọng (Stem-loop), cấu trúc này chứa một trình

tự nuleotide bất biến ngắn TAATATTAC, tại vị trí T7-C8 cần cho việc cắt và nối DNA của virustrong quá trình tái bản IR có một cấu trúc nhận biết đặc hiệu của virus đã được xác định nằm dướicấu trúc stem-loop, nó chứa một motif được gọi là Interon(Argüello-Astorga và Ruiz-Medrano,2001), cần thiết cho nhận biết và bám vào sợi DNA của virus để bắt đầu tái bản Sự tái tổ hợp củavirus phụ thuộc vào motif này Các virus có chung motif ở vùng IR có khả năng tái tổ hợp vớinhau Mỗi một motif sẽ tương ứng với một trình tự đặc trưng trên đầu N (Interon related domain –IRD) của protein REP

2.3.3.4 Cấu trúc của phân tửDNA-β.

Một phân tử vệ tinh DNA dạng vòng đơn (DNA-β) đã được tìm thấy kết hợp với các

begomovirus có bộ gen đơn xâm nhiễm trên các cây trồng và cây dại bao gồm bông (cotton), mướp

tây (okar), dâm bụt (hibiscus), cây thục quỳ (hollyhock), cây đay cẩm quỳ (malvaceae), cây kimngân (Caprifoliaceae), cây cà chua (tomato), cây thuốc lá (tobacco), và cây ớt (solanaceae),

squash (Cucurbitaceae), cây hoa cúc và ageratum (Asteraceae)(Briddon, 2003)(Zhou et al.,

2003) Phân tử DNA-β đã thu hút được sự chú ý kể từ khi (Briddon, 2003)chứng minh rằng triệuchứng điển hình trên cây ageratum (bệnh vàng gân trên cây ageratum) và cây bông (bệnh cuốn lá

bông) chỉ có thể hình thành khi Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus

(CLCV) cũng được lây nhiễm với một phân tử DNA – β tương ứng Phân tử DNA-β có bộ gensợi vòng đơn với kích thước xấp xỉ 1350 nucleotide mang 3 vùng đặc trưng (Briddon, 2003)

Vùng bảo thủ của vệ tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này khoảng 200 nucleotide

bao quanh cấu trúc stem-loop có mang một chuỗi trình tự ngắn TAT/ATATTAC đặc trưng của

Nanovuruses và Geminiviruses và một vùng bảo thủ cao với trên 100 nucleotide đã được xác

định nằm ở phía bên phải của đầu 5’ của stem-loop Vùng bảo thủ này có rất nhiều GC xấp xỉkhoảng 70% (Briddon, 2003)

Vùng giàu A (A rich region): Phân tử DNA-β chứa một vùng giàu A (đặc trưng 160-180

nucleotide có khoảng 60 % A) (Briddon, 2003) Vị trí được xác định nằm giữa nucleotide ±700

và ±1000 (Zhou et al., 2003) Có ý kiến rằng vùng giàu A này đã được thêm vào nhằm tăng

thêm kích thước của chúng để trở thành có kích thước xấp xỉ kích thước ½ kích thước của bộ

gen virus (Mansoor et al., 2003) Bằng cách này phân tử DNA-β có thể lắp ráp được thông qua

cơ chế chọn lọc kích thước nghiêm ngặt trong phân tử virus

Vùng ngược nghĩa mã hóa: Phân tử DNA-β mang một khung đọc mở βC1 trên sợi phía

bên phải của genome Khung đọc mở này mã hóa 1 protein với kích thước đặc trưng (điển

hình) 118 amino acids Thông qua phân tích đột biến (Zhou et al., 2003) đã chứng minh sản

phẩm βC1 có chức năng trong biểu hiện triệu chứng Gần đây protein vệ tinh βC1 (Y10β) của

virus Tomato yellow leaf curl China virus chủng Y10 (TYLCCNV-Y10) đã được chứng minh

là có khả năng ngăn chặn phản ứng phòng thủ của cây (Cui et al., 2005).

SCR=Satellite Conserved Region

Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử DNA-β

(http://wcrc.confex.com)

2.3.4 Tái sinh của Begomovirus

Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism) Cơ chế vòng lăn có

thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Picó và cộng sự, 1996)P(1) Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòngkép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus vàmột sợi tương đồng virus Pha này vẫn chưa được hiểu rõ

(2) Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tạichuỗi bảo toàn TATATTAC Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợivirus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mớiđược tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoànchỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra

bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh

2.3.5 Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus

Cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thường bị nhiễm hai hoặc nhiều geminivirus

(Harrison và cộng sự, 2002; Ribeiro và cộng sự, 2006; Briddon và cộng sự, 2008)(Harrison vàcộng sự, 2002; Briddon, 2003; Ribeiro và cộng sự, 2006) Trong cây virus tương tác với nhautạo ra phức hợp bệnh (complex disease) (Moriones và Navas-Castillo, 2000; Chakraborty vàcộng sự, 2003) Kiểu tương tác đồng nhiễm bệnh của các virus (co-infection virus) tạo ra triệu

chứng rõ rệt hơn khi quan sát ở cây bị từng loại virus riêng Tương tác có thể là sự bổ trợ(complementation) hoặc tái tổ hợp.

Tác dụng phối hợp giữa hai Geminivirus tái tổ hợp mới có thể xảy ra, và tạo ra nhiều triệu

chứng hơn Ví dụ như ở Cameroon, tái tổ hợp kép (double recombinant) được tạo thành khi

đồng xâm nhiễm các isolate của African cassava mosaic virus, đã tạo ra nhiều triệu chứng hơn

so với cây bị nhiễm từng isolate riêng Một ví dụ khác là sự tái tổ hợp tự nhiên giữa hai

begomovirus là TYLCSV và TYLCV (Tây Ban Nha), đã tạo ra virus khỏe hơn hai virus ban

đầu (Moriones và Navas-Castillo, 2000)

Tái tổ hợp được cho là đóng vai trò quyết định tới sự tiến hóa của virus, đặc biệt là ở quần thể

Geminivirus, góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền(Sarkar và Kulshreshtha, 1978) Tái tổ hợp của begomovirus có thể xảy ra ở mức độ chủng loài (Markham và cộng sự, 1996; Briddon, 2003) chi, và ngay trong cùng một họ (Jones, 2003)

2.3.6 Triệu chứng bệnh

Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triểnđầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi trường,giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh(Picó và cộng sự,1996) Do phải dựa hoàn to

àn vào vật chất của tế bào thực vật để sinh sản, các virus đã phát triển mạnh trên cây non và tếbào non trong một cây Ở các cây già cỗi, quá trình này sẽ chậm lại hay hầu như ngừng hẳn.Chính vì vậy, tuổi cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh Các điều kiệnngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng,chăm sóc Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon cóthể sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập Với nồng độ thấp khoảng một phần triệugram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus Chính vì những lý do trên bệnh virus không gâyđược tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môitrường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnhlúa vàng lụi ở nước ta những năm 1960

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong Về sau, lá không có hình

dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp Cuống lá có thể xoắn vặn Cây lùn còi

cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bịrụng (Picó và cộng sự, 1996) Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu vàxuân hè

Hình 2.6 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua

(httpwww.avrdc.org)

2.3.7 Lan truyền của Begomovirus

Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới

và chủ yếu là do bọ phấn Bemisia tabaci chích hút

từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe theo kiểu bền

vững tuần hoàn Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ

cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều Bọ phấn dùng vòi

chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch

phloem Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua

màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước

bọt và cuối cùng vào ống nước bọt Hình 2.7 Bọ phấn Bemisia tabaci

2.3.8 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh

bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên càchua khắp thế giới (Moriones và Navas-Castillo, 2000)Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh

khảm lá sắn (Legg và Fauquet, 2004), bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003) Trong đó gây thiệthại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua.

Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng Bệnh đã trở thànhbệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệtđới (Picó và cộng sự, 1996)

Cơ chế RNA slencing cũng đã được ứng dụng để tạo ra giống kháng được begomovirus Ở Việt

Nam hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành đề tài nghiên cứu về vấn đề này Tuynhiên, có một vấn đề gặp phải là RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì viruscũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm

rằng AC4 của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế

bào chất

Biện pháp đang đươc áp dụng hiện tại để phòng bệnh do begomovirus gây ra là diệt trừ bọ phấn,

biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh.Sử dụng thuốc hoá học để trừ bọ phấn là mộtbiện pháp đã được tiến hành và cho hiệu quả cao Tuy nhiên việc sử dụng thuốc không chỉ gây ônhiễm môi trường sống mà còn làm tăng tính kháng thuốc của bọ phấn.Chúng ta cũng có thể sửdụng biện pháp dùng bẫy dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng

2.4 Phương pháp RCA (rolling circle amplification )

Là phương pháp dùng để nhân một lượng lớn DNA dưới dạng các polymer theo cơ chế vònglăn (tương tự như quá trình tái sinh của virus) nhờ một đoạn mồi ngẫu nhiên (Randomhexamer), và enzyme phi 29 DNA polymerase hoạt động ở nhiệt độ 300C trong vòng 18 giờ đểtổng hợp và kéo dài sợi mới có kích thước lên tới 10kb Các sợi mới được hình thành lại trởthành đoạn khuôn để tổng hợp các sợi tiếp theo.

2.5 Kỹ thuật xác định trình tự

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày nay đều dựa trênphương pháp của Frederick Sanger (1977), có cải tiến Phương pháp này còn được gọi là phươngpháp enzyme học hay phương pháp dideoxy

Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dài ANDkhi tổng hợp Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) Các ddNTP

có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không thể tiếptục kết hợp được với phân tử desoxynucleosid triphosphat tiếp theo Do đó khi trộn lẫn lượngnhỏ dideoxynucleosid triphosphat với 4 loại desoxynucleosid triphosphat rồi tiến hành tổnghợp DNA nhờ DNA polymerase thì sẽ thu được một loạt các đoạn DNA được kết thúc đặc hiệubởi gốc dideoxy nucleotit Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi phản ứng bổ sung 1 loạidideoxy nucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn DNA có kết thúc bằng các dideoxy nucleotitkhác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta cóthể xác định trình tự của chuỗi DNA quan tâm

2.6 Kỹ thuật agroinoculation

Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A.tumerfaciens được gọi là

agroinoculation Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi phải thiết kế 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm

bộ gen virus (hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được nối

vào 1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên Cấu trúc xâm nhiễm sẽ được

biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumerfaciens Khi lây nhiễm, tế bào vi khuẩn sẽ tiếp xúc với tế

bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên Ti plasmid) sẽ chuyển toàn bộ phần DNAnằm giữa bờ trái và bờ phải của cấu trúc xâm nhiễm vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợpphần DNA này vào bộ gen tế bào cây ký chủ Trong tế bào chuyển gen, gen Rep của virus sẽđược biểu hiện thành protein Rep Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bào cây tại vịtrí đặc hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn Bộ gen virus nguyên vẹnnày sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh

A: Agrobacterium tumefaciens B: Agrobacterium genome C: Ti Plasmid : a: T-DNA , b: Vir

genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes D: Plant cell E: Mitochondria F:Chloroplast G: Nucleus

Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được nhúng trong dungdịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhậpvào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vàomô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào đất

2.7 Kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification)

Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling CircleAmplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng Kỹ thuật RCAdùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch(strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành cácmultimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ đượccắt bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thôngthường Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gen DNAmạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh (Inoue-Nagata và cộng sự, 2004; Haible và cộng

sự, 2006; Knierim và Maiss, 2007)

Hình 2.10 Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle

Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA (Fujii và cộng sự, 2006)

Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus Sảnphẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp trong điều kiệnkhông triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer(nhiều bộ gen) Chỉ các sản phẩm dimer được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị

nguyên Bằng cách đơn giản này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo rakhá nhanh chóng (Inoue-Nagata và cộng sự, 2004; Knierim và Maiss, 2007; Ferreira và cộng

sự, 2008; Wu và cộng sự, 2008; Wyant và cộng sự, 2011)

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Địa điểm, thời gian, đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.1: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Trung Việt Nam.

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP911 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm từ trong ra, xoăn lá

Bảng 3.2: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Nam Việt Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP82 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Khảm vàng, lá nhăn

Bảng 3.3: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Trung Việt Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP436 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP441 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP727 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP893 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP894 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Khảm vàng

VNP895 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn chết hoại, đốm

VNP896 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Vàng, chết hoại gân, cuống láVNP897 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP898 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm vàng Chết hoại gânVNP899 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNO90

0

Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP901 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm xanh, chết hoại

VNP902 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP903 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP904 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xanh đốm, chết hoại

VNP905 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP906 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

Bảng 3.4: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Nam Việt Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 6/2013 đến tháng 12/2013

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu

3.1.4.1 Chất kháng sinh

Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin, kanamycin, streptomycin,tetracylin Các kháng sinh được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc như sau:

- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol

- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %

Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 200C, trong đó rifampicin và kanamycin đượcbọc kín bằng giấy bạc

3.1.4.2 Cấu trúc xâm nhiễm

Các cấu trúc xâm nhiễm gồm toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β) được nối vào một vector nhịnguyên pCAMBIA-2300 mang gen kháng kanamycin đối với cả chọn lọc thực vật và chọn lọc

vi khuẩn Đây đây là một vector nhị nguyên thuộc nhóm vector pCAMBIA được tạo ra bởi việnCAMBIA (http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html) pCAMBIA-2300 là vector tốithiểu cho chuyển gen thực vật và được sử dụng tốt trong thí nghiệm agroinoculation

Phần gen virus (hoặc DNA-β) được xây dựng sao cho toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β) có 2vùng nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu

Các chủng vi khuẩn sử dụng

Chủng vi khuẩn A Tumefaciens khả biến

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404 Chủng này chứa Ti plasmid

pAL4404 Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còn gen kháng streptomycinnằm trên Ti plasmid pAL4404

H

ình 3.2: Hinh thái vi khuẩn A tumefaciens

Chủng vi khuẩn E Coli khả biến

Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue Chủng này chứa gen kháng Tetracylinnằm trên bộ gen của vi khuẩn

Hình 3.3: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1

3.1.4.3 Thành phần cho phản ứng PCR, RCA, Điện di

Cặp mồi chung DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 & Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong et

ToLCHnV-F1 TCAGTTATTCGTGCTAAGGAC 1260 bp Tomato leaf Curl

DNA tổng số từ mô lá được chiết theo các phương pháp:

+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993):

Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 M vào

tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá Lấy 100 µl dung dịch đệm

Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube

1,5mL chứa dung dịch đệm Tris 0,1M, pH = 8 Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR

+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium Bromide ) theo mô tả của Doyle & Doyle (1987), Wang et al., 1993 như sau:

Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol) Sau

đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1 DNA tổng

số được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn DNA 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn

DNA trong không khí ít nhất 30 phút Hoà cặn DNA trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô

trùng, bảo quản DNA ở -200C.

3.2.2 Phản ứng RCA (rolling circle amplification )

Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích là 20 μL trong đó có

20X Exo-Hexamer (500 μM, Fermentas) 0.25 μl

10XPhi29 buffer (Fermentas) 1.0 μl

Phi29 enzyme (10 U/μL, Fermentas) 0.25 μl

Pyrophosphate (0.1U/μL, Fermentas) 0.25 μl

Phản ứng được ủ ở 30oC trong 18h sau đó ủ ở 65oC để bất hoạt enzyme

Thực hiện phản ứng cắt sản phẩm RCA bằng BamHI với tổng thể tích là 10 μL với các thànhphần phản ứng như sau:

3.2.3.Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR.

3.2.4 Tinh chiết sản phẩm điện di

Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit Các bướctinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.2.5 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm

- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI

10X React 3 2 μL

Ủ ở 370C trong một giờ sau đó điện di và tinh chiết DNA plasmid từ gel agarose bằng kitAccuprep gel purification kit (Bioneer)

Dephosphorylation vector pCAMBIA-2300 sau khi được mở vòng bằng BamHI

pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30

10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4

Alkaline Phosphatase (Roche) 6

Sau đó ủ ở 370C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCR purification kit (Invitrogen)Nối vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gel purified)

Sau đó ủ ở 22oC trong 2h và để ở 4 oC qua đêm

3.2.6 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến

Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo An và cs (1988)

Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 370Ctrong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm)

Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng

trong lọ định mức ở 500 ml Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37 0C) cho tới khi mật độquang OD600 đạt 0,5 - 1,0

Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút Cho toàn bộ dung

dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4 0C

Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa) Hoà cặn vi khuẩn với 1

ml dung dịch CaCl2 100 mM đã được làm lạnh trước trong đá Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch

vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá Hoá đông vikhuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu - 800C

3.2.7 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng

phương pháp sốc nhiệt

- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80 oC ) cho lên khay đá vụn đểtan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy)

- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37 oC, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc

- Cho 150 μL vi khuẩn dã đông vào tube 1.5 ml đã đặt trên đá trước đó Cho 10 μL sảnphẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ

- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37 oC

- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL

Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa LB agar + Kanamycin + Tetracylin

- Nuôi qua đêm ở 37 oC trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc

3.2.8 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc

Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại kháng sinh) ở 37

oC, lắc 250 vòng/ phút qua đêm Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa cặn vi khuẩn hai lần bằngnước vô trùng Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn vi khuẩn và để trong tủ -20oC ít nhất

30 phút Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút, đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR

3.2.9 Tinh chiết plasmid

DNA plasmid được chiết từ tế vi khuẩn theo kỹ thuật chiết plasmid (miniprep) của Sambrook

và cs (1989)

Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa kháng sinh

cho vào mỗi tube Eppendorf loại 1,5 ml

Bước 2: Ly tâm 3 phút ở máy ly tâm để bàn để lắng cặn vi khuẩn Loại bỏ dịch trong để

nguyên cặn trong tube

Bước 3: Cho tiếp 1,5 ml dịch vi khuẩn vào tube và lặp lại bước 2.

Bước 4: Ly tâm 3 phút để lắng cặn vi khuẩn, loại bỏ dịch trong để nguyên cặn trong

tube Dùng pipes hút hết dịch trên tủa Để tube trên đá khoảng 3 phút

Bước 5: Cho 100 μl dung dịch I đã được để lạnh trên đá vào tube Cho tiếp 2 μl RNAse

A (dung dịch gốc 10 mg/mL) Votex để hòa tan vi khuẩn

Bước 6: Cho 200 μl dung dịch II vào tube (cần kiểm tra xem SDS có bị kết tủa không

nếu có cần làm ấm dung dịch để hoà tan SDS) Ở bước này không cần trộn tube và phải để tube

trên đá và không được để dịch tan quá 2 phút vì plasmid dễ bị biến tính ở nồng độ kiềm cao.Bước này là bước phá huỷ vách tế bào giải phóng DNA genom và DNA plasmid nên dịch tantrở nên rất nhầy.

Bước 7: Cho 150 μl dung dịch III đã để lạnh trước trên đá vào tube, trộn đều bằng lắc

tube nhiều lần Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genom (vì có kích thước lớn) sẽ

bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên vẫn hoà tan trong dung dịch Để tubetrên đá khoảng 3 phút

Bước 8: Ly tâm dung dịch 5 phút để kết tủa prtein và DNA genomic Chuyển dịch trên

tủa (khoảng 400 μl) có chứa DNA plasmid sang một tube mới, loại bỏ tube cũ và cặn bên trongtube

Bước 9: Cho một thể tích tương đương (khoảng 400 μl) isopropanol vào tube Trộn đều

bằng đảo tube nhiều lần Để tube ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút Trong bước này isopropanol

sẽ làm kết tủa DNA plasmid

Bước 10: Ly tâm 5 phút để kết tủa DNA plasmid Loại bỏ dịch trong giữ lại cặn DNA

plasmid Ly tâm nhanh để lắng tất cả dịch bám trên thành tube xuống dưới và dùng pipes húthết dịch

Bước 11: Cho 500 μl cồn 70 % vào tube để rửa cặn, loại bỏ cồn (trong bước này rửa cồn

càng nhiều lần càng tốt) Để loại bỏ hết cồn ra khỏi tube, thì sau khi đổ hết cồn ra ly tâm ngắnkhoảng vài giây để lắng tất cả cồn bám trên thành tube xuống dưới và dùng pipes hút hết cồn

Bước 12: Để khô cặn DNA trong không khí khoảng 30 phút.

Bước 13: Hoà cặn DNA plasmid với 50 μl dd H2O vô trùng hoặc đệm TE (pH = 8) DịchDNA bây giờ có thể được dùng cho các phản ứng enzyme hoặc bảo quản ở -200C

3.2.10 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens khả biến (competent cells)

Tế bào A tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo An và cs (1988)

Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 28 oCtrong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm)

Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng

trong lọ định mức ở 500 ml Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28 oC) cho tới khi mật độquang OD600 đạt 0,5 - 1,0

Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút Cho toàn bộ dung

dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4oC

Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa) Hoà cặn vi khuẩn với 1

ml dung dịch CaCl2 20 mM đã được làm lạnh trước trong đá Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch

vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá Hoá đông vikhuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 80oC

3.2.11 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens khả biến

Các cấu trúc xâm nhiễm vừa được thiết kế được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biếntheo phương pháp đông tan (Hofgen & Willmitzer, 1988) Trong điều kiện phòng thí nghiệm,bước đông tan được thưc hiện với tủ lạnh sâu – 80 oC thay vì bằng nitơ lỏng Các bước cụ thểlà:

Bước 1: Lấy tế bào A tumefaciens từ tủ lạnh - 80 oC Để vi khuẩn tan đông trong đá

Bước 2: Lấy 10 μl dịch DNA của mỗi cấu trúc cho vào tube tế bào vi khuẩn và trộn đều Bước 3: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào tủ lạnh sâu – 80oC trong vòng 15 phút

Bước 4: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37 oC trong vòng 5 phút

Bước 5: Cho dịch vi khuẩn đã được transfomation vào ống nghiệm chứa 1 ml môi

trường LB lỏng, ủ ống nghiệm trong tủ ấm có lắc ở 28 oC trong 1giờ

Bước 6: Chuyển dịch vi khuẩn vào tube 1,5 ml.

Bước 7: Ly tâm trong 3 phút, lấy phần dịch trên tủa, loại cặn, sau đó cho tiếp 100 μl

môi trường LB lỏng

Bước 8: Dịch vi khuẩn ở bước 8 được cấy trên đĩa môi trường LB - agar có 3 loại kháng

sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100 μg/mL)

Bước 9: Các đĩa petri được ủ ở 28 oC trong vòng 2 ngày Kiểm tra sự hình thành khuẩnlạc

Bước 10: Dùng tăm nhọn đã được hấp khử trùng lấy một ít vi khuẩn ở mỗi khuẩn lạc rồi

thả vào trong ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB lỏng chứa 3 kháng sinh ở trên

Bước 11: Các ống nghiệm được ủ 24 giờ trong tủ ấm có lắc (200 rpm / 28 oC)

Bước 12: Kiểm tra đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường LB lỏng và

kiểm tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm trong vi khuẩn bằng PCR sau khi chiết DNAplasmid