Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực miền trung và miền nam việt nam

Giới thiệu Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loàiFauquet và Stanley, 2005.Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về

Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành tới các Thầy giáo, Cô giáo trong bộmôn Công nghệ sinh học thực vật cũng như các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học,trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôihọc tập ở trường.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, người thân các anh chị em và bạn bè đã giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này.Tôi xin chân thành cảm ơn!

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

PCR Polymerase Chain Reaction

RCA Rolling circle amplification

Rep Replication protein

TAE Tris – acetate – EDTA

β- ME Beta- Mercaptoethanol

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gencủa mộtbipartite begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hạitrên cây ớt đã được Nguyễn Đức Anh phân lập năm 2013 Kết quả là toàn bộ bộ gen của

mẫu begomovirus đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue Chúng

tôi cũng đã giải trình tự và thu được toàn bộ bộ gen của mẫu virus với kích thước khoảng2.7 kb

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về begomovirus trên ớt và cà chua ở miền Trung vàmiền Nam Việt Nam, begomovirus mới gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt ở hai vùng này Nhândòng thành công và giải được bộ gen DNA-A của virus này, thông qua phân tích trình tự,

đặc trưng phân tử và phả hệ cho thấy đây là 1 loài mới thuộc chi Begomovirus gây hại trên

ớt và được chúng tôi đặt tên là Chilli leaf curl virus (CLCV).

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Giới thiệu

Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài(Fauquet và Stanley,

2005).Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả

về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.Begomovirus(được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi

vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet và Stanley, 2005), lan truyền trên đồng ruộng

bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.

Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai

phân tử DNA-A và DNA-B) Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNA-A đã gây triệu chứngđiển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ratriệu chứng bệnh Gần đây, một loại phân tử DNA vòng đơn nữa, có kích thước khoảng 1

nửa bộ gen begomovirus thường được phát hiện thấy có liên quan với nhiều bệnh do begomovirus gây ra và được gọi là các DNA-β Các phân tử DNA-β này phụ thuộc vào begomovirus để nhân lên và do đó được xem là các phần tử vệ tinh của begomovirus Vai trò

của phân tử DNA-β trong hình thành triệu chứng bệnh không thống nhất, một sốbegomovirus chỉ có thể tạo ra triệu chứng bệnh với sự có mặt của phân tử DNA-β trong khicác loài khác lại không cần Do đó việc phòng trừ bệnh xoăn vàng lá càng trở nên khó khănhơn

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh

xoăn vàng lá cà chua – một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thếgiới(Moriones và cộng sự, 2007) Hiện nay, có tới 50 begomovirusphân lập từ cà chua (có từ

tomato ở đầu tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet và cộng sự, 2008) Trên cây

cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình

thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậuquả rất thấp Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử(Moriones và Navas-Castillo, 2000)

Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus(Ha,

2007) Mặc dù vậy số lượng loài begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn

ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại(Green và cộng

sự, 2001),(Ha, 2007).Theo điều tra hiện nay, bệnh do begomovirus gây hại trên diện rộng vàkhông chỉ gây bệnh trên cà chua, chúng còn gây bệnh trên nhiều loài cây khác như ớt, họ

đậu đỗ, đu đủ, bầu bí Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam”

2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1. Mục tiêu

- Giải trình tự mẫu virus mới được phân lập

- Phân tích đặc trưng phân tử của các mẫu virus trên ớt và cà chua ở miền Trung và miềnNam Việt Nam

- Chuẩn đoán begomovirus trên ớt và cà chuavới các mẫu thu được tại khu vực miền Trung

và miền Nam Việt Nam sử dụng cặp mồi chung phát hiện begomovirus là BegoA-For1 vàBegoA-Rev1

- Chọn lọc các mẫu dương với BegoA để kiểm tra với các mồi đặc hiệu đã được xác định nhưmồi ToLVHnV (F1/R2); TB101 (F1/ R2); VB65 (F1/R1); TY (F4/R4);To (F4/R4); To100(F1/R1);TYKa-A (F1/R1), VNP93A (F1/R1), VNP93B (F1/R1)

- Nhân dòng và giải trình tự các mẫu virus trên ớt và cà chua đã được chọn, bước đầu địnhdanh các virus

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

II.1. Những nghiên cứu nước ngoài

II.1.1. Tầm quan trọng của ớt và cà chua

Ớt là một loại quả của các cây thuộc chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae) Ớt có nguồn

gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia

vị, rau, và thuốc Hiện nay, Ấn Độ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệutấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt

Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban Nha lan

truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu Cà chua làloài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất

ra trên Thế giới trong năm 2009 Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếmkhoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ Các khu vực chếbiến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz

Bệnh đã được báo cáo tại vùng Đông Nam Á (Thái Lan và Đài Loan) châu Phi và Châu Âuvào những năm 80 Bệnh lần đầu tiên được công bố tại Châu Mỹ vào năm 1993 Hiện nay,bệnh xoăn vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thếgiới(Picó và cộng sự, 1996; Ghanim và cộng sự, 2001; Moriones và cộng sự, 2007)

2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá

2.3 Đặc điểm của Begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá

2.3.1 Phân loại chi Begomovirus

Việc phân loại virus gây bệnh được chẩn đoán theo Uỷ ban Quốc tế về Phân loại Virus(International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV) dựa vào đặc điểm cấu tạo, hìnhthái của virus cũng như mối quan hệ huyết thanh và các đặc tính khác như đặc điểm lantruyền, lây nhiễm, phạm vi kí chủ đặc biệt là các đặc điểm của DNA Tên gọi của virus hạithực vật quy định dùng tiếng Anh bao gồm tên của cây kí chủ chính, triệu chứng bệnh trên

cây kí chủ đó và cuối cùng là từ virus Ví dụ: virus gây bệnh khảm thuốc lá - Tobacco mosaic virus - viết tắt là TMV.

Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm Tân

thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực báncầu đông bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á(Rybicki, 1994; Padidam và cộng sự, 1999)

Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn

tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki, 1994) Begomovirus ở cụm Tân thế giới cóchuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có

mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison và cộng sự, 2002).

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổtiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay Các virus này sau đótiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới

Gần đây dựa trên phân tích hệ thống phát sinh phát hiện ra rằng CoYVV ở Việt Nam không

có ORF AV2 và có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong protein vỏ (CP), virus này giống vớicụm Tân thế giới hơn là cụm Cựu thế giới Sự có mặt của CoYVV ở Việt Nam đã đưa ra giảthuyết rằng virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu thế giới trước khi bịphân chia ở kỷ Gondwana (Ha và cộng sự, 2008)

Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi phân tử DNA-A Theo Fauquet et al.,2008, việc phân loại loài trong chi begomovirus tuân thủ một

số tiêu chuẩn sau:

(i) Thành phần của genome có hay không có DNA-B

(ii) Tổ chức bộ gen có hay không có gen AV2

(iii) Protein Rep không có khả năng tái bản trans trong thành phần bộ gen thì có thể ghi nhận

loài mới Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ một thay đổi nhỏ ở vị trí liên kết với Rep có thể ngăncản sự tương tác chức năng và sự tái tổ hợp của virus

(iv) Đặc điểm của protein vỏ Mức độ tương đồng của trình tự aminoacid <90% thì ghi nhận là

loài mới, tuy nhiên mức độ tương đồng nucleotide của toàn bộ bộ gen vẫn là cần thiết choviệc xác nhận phân loại virus

2.3.2 Hình thái của Begomovirus

Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà

chua nói riêng và begomovirrus nói chung

thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus).

Các Geminivirus đều có cấu trúc phân tử

(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu

20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác

đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗihình

cầu đa diện kép (gemini) Do nối với nhau

nên 2 hình cầu này không

2.1Hinh thái của begomovirus

(http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk)

hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếpthành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer) Kếtquả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái(Gafni và Epel, 2002; Zhang

và cộng sự, 2010)

2.3.3 Cấu trúc genome của Begomovirus

Begomovirus có bộ gen đơn có phân tử DNA-A hoặc bộ gen kép bao gồm hai phân tử DNA-A

và DNA-B Cấu trúc của DNA-A là tương tự nhau ở hai nhóm virus này

2.3.3.1 Cấu trúc của phân tử DNA-A

Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm có 6 ORF được sắp xếp theo hai chiều ngượcnhau Theo chiều kim đồng hồ có hai gen AV1 và AV2 Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có

chức năng lan truyền Begomovirus qua vector và nhập nhân tế bào Gen AV2 mã hóa

Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus.Ngược chiều kim đồng hồ gồm có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4 Trong đó, gen AC1(rep) mãhóa protein tái bản (Rep protein) có chức năng tái sinh và tương tác với Protein của ký chủđiều khiển chu kỳ tế bào Gen AC2 (TrAP) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng

ức chế phản ứng phòng thủ cuả cây Gen AC4 (Ren) mã hóa protein tăng cường tái sinh cóchức năng tương tác với protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào Gen AC4 mã hóa protein

có chức năng cảm ứng triệu chứng và di chuyển hệ thống (Ha và cộng sự, 2008)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus

(http://wcrc.confex.com)

2.3.3.2 Cấu trúc của phân tử DNA-B.

DNA-B của các begomovirus kép mã hóa cho 2 protein BV1 và BC1 cả hai protein này đều

liên quan trong việc di chuyển của virus

BV1 là một protein con thoi:BV1 có chức năng như là một protein con thoi, nó có chức năng

vận chuyển virus vào và ra khỏi tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân củavirus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP

BV1 tương tác với BC1 trong việc di chuyển giữa các tế bào:Bắt đầu từ nhân BV1 tạo một

phức hợp với ssDNA, phức hợp này đi ra tế bào chất và kết hợp với BC1 tạo thành phức hợpBV1 : ssDNA : BC1 sau đó di chuyển đến sợi liên bào và chuyển sang tế bào khác(Gafni vàEpel, 2002).Vùng C cuối của BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) được xác định là yếu tốcần thiết cho sự tương tác với BC1

BC1 là một protein vận chuyển.Chức năng của BV1 giống như là một protein vận chuyển đã được làm rõ trong hai trường hợp sau: (1) BV1 của virus Bean dwarf mosaic virus (BDMV)

đã làm tăng size exclusion limit (SEL) của sợi liên bào (Tice và cộng sự, 2000); (2) BV1

của Squash leaf curl virus (SqLCV) đã kích thích tạo ra các cấu trúc dạng ống bắt nguồn từ

luới nội chất, các ống này làm cho virus dễ dàng di chuyển giữa các tế bào (VARMA vàMalathi, 2003) Như đã được đề cập ở trên, BC1 tương tác với BV1 thông qua phức hợpBV1:BC1:ssDNA để vận chuyển virus giữa các tế bào (Gafni và Epel, 2002)

BC1 có liên quan trong tính gây bệnh.Sự kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã được

chứng minh thông qua thí nghiệm chuyển gen Thuốc lá và cà chua đã được chuyển gen

BC1 của Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình của

virus xâm nhiễm đã được nhận thấy

bản (ori) có tổ chức bao gồm một cấu trúc thòng lọng (Stem-loop), cấu trúc này chứa một

trình tự nuleotide bất biến ngắn TAATATTAC, tại vị trí T7-C8 cần cho việc cắt và nối DNAcủa virus trong quá trình tái bản IR có một cấu trúc nhận biết đặc hiệu của virus đã được xácđịnh nằm dưới cấu trúc stem-loop, nó chứa một motif được gọi là Interon(Argüello-Astorga vàRuiz-Medrano, 2001), cần thiết cho nhận biết và bám vào sợi DNA của virus để bắt đầu tái bản

Sự tái tổ hợp của virus phụ thuộc vào motif này Các virus có chung motif ở vùng IR có khảnăng tái tổ hợp với nhau Mỗi một motif sẽ tương ứng với một trình tự đặc trưng trên đầu N(Interon related domain – IRD) của protein REP

2.3.3.4 Cấu trúc của phân tửDNA-β.

Một phân tử vệ tinh DNA dạng vòng đơn (DNA-β) đã được tìm thấy kết hợp với các

begomovirus có bộ gen đơn xâm nhiễm trên các cây trồng và cây dại bao gồm bông (cotton),

mướp tây (okar), dâm bụt (hibiscus), cây thục quỳ (hollyhock), cây đay cẩm quỳ (malvaceae),cây kim ngân (Caprifoliaceae), cây cà chua (tomato), cây thuốc lá (tobacco), và cây ớt(solanaceae), squash (Cucurbitaceae), cây hoa cúc và ageratum (Asteraceae)(Briddon, 2003)

(Zhou et al., 2003) Phân tử DNA-β đã thu hút được sự chú ý kể từ khi (Briddon, 2003)chứng

minh rằng triệu chứng điển hình trên cây ageratum (bệnh vàng gân trên cây ageratum) và cây

bông (bệnh cuốn lá bông) chỉ có thể hình thành khi Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus (CLCV) cũng được lây nhiễm với một phân tử DNA – β tương ứng.

Phân tử DNA-β có bộ gen sợi vòng đơn với kích thước xấp xỉ 1350 nucleotide mang 3 vùngđặc trưng (Briddon, 2003)

Vùng bảo thủ của vệ tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này khoảng 200

nucleotide bao quanh cấu trúc stem-loop có mang một chuỗi trình tự ngắn TAT/ATATTAC

đặc trưng của Nanovuruses và Geminiviruses và một vùng bảo thủ cao với trên 100

nucleotide đã được xác định nằm ở phía bên phải của đầu 5’ của stem-loop Vùng bảo thủnày có rất nhiều GC xấp xỉ khoảng 70% (Briddon, 2003)

Vùng giàu A (A rich region): Phân tử DNA-β chứa một vùng giàu A (đặc trưng 160-180

nucleotide có khoảng 60 % A) (Briddon, 2003) Vị trí được xác định nằm giữa nucleotide

±700 và ±1000 (Zhou et al., 2003) Có ý kiến rằng vùng giàu A này đã được thêm vào nhằm

tăng thêm kích thước của chúng để trở thành có kích thước xấp xỉ kích thước ½ kích thước

của bộ gen virus (Mansoor et al., 2003) Bằng cách này phân tử DNA-β có thể lắp ráp được

thông qua cơ chế chọn lọc kích thước nghiêm ngặt trong phân tử virus

Vùng ngược nghĩa mã hóa: Phân tử DNA-β mang một khung đọc mở βC1 trên sợi

phía bên phải của genome Khung đọc mở này mã hóa 1 protein với kích thước đặc trưng

(điển hình) 118 amino acids Thông qua phân tích đột biến (Zhou et al., 2003) đã chứng

minh sản phẩm βC1 có chức năng trong biểu hiện triệu chứng Gần đây protein vệ tinh βC1

(Y10β) của virus Tomato yellow leaf curl China virus chủng Y10 (TYLCCNV-Y10) đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn phản ứng phòng thủ của cây (Cui et al., 2005).

SCR=Satellite Conserved Region

Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử DNA-β

(http://wcrc.confex.com)

2.3.4 Tái sinh của Begomovirus

Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism) Cơ chế vòng lăn có

thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Picó và cộng sự,1996)P

(1) Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNAvòng kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợivirus và một sợi tương đồng virus Pha này vẫn chưa được hiểu rõ

(2) Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virustại chuỗi bảo toàn TATATTAC Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tếbào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus Protein Rep lại tiếp tục cắtsợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành mộtsợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu củamạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh

2.3.5 Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus

Cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thường bị nhiễm hai hoặc nhiều geminivirus

(Harrison và cộng sự, 2002; Ribeiro và cộng sự, 2006; Briddon và cộng sự, 2008)(Harrison

và cộng sự, 2002; Briddon, 2003; Ribeiro và cộng sự, 2006) Trong cây virus tương tác vớinhau tạo ra phức hợp bệnh (complex disease) (Moriones và Navas-Castillo, 2000;Chakraborty và cộng sự, 2003) Kiểu tương tác đồng nhiễm bệnh của các virus (co-infectionvirus) tạo ra triệu chứng rõ rệt hơn khi quan sát ở cây bị từng loại virus riêng Tương tác cóthể là sự bổ trợ (complementation) hoặc tái tổ hợp

Tác dụng phối hợp giữa hai Geminivirus tái tổ hợp mới có thể xảy ra, và tạo ra nhiều triệu

chứng hơn Ví dụ như ở Cameroon, tái tổ hợp kép (double recombinant) được tạo thành khi

đồng xâm nhiễm các isolate của African cassava mosaic virus, đã tạo ra nhiều triệu chứng

hơn so với cây bị nhiễm từng isolate riêng Một ví dụ khác là sự tái tổ hợp tự nhiên giữa hai

begomovirus là TYLCSV và TYLCV (Tây Ban Nha), đã tạo ra virus khỏe hơn hai virus ban

đầu (Moriones và Navas-Castillo, 2000)

Tái tổ hợp được cho là đóng vai trò quyết định tới sự tiến hóa của virus, đặc biệt là ở quần

thể Geminivirus, góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền(Sarkar và Kulshreshtha, 1978) Tái

tổ hợp của begomovirus có thể xảy ra ở mức độ chủng loài ( Markham và cộng sự, 1996 ;

Briddon, 2003 ) chi, và ngay trong cùng một họ (Jones, 2003)

2.3.6 Triệu chứng bệnh

Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và pháttriển đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi

trường, giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh(Picó vàcộng sự, 1996) Do phải dựa hoàn to

àn vào vật chất của tế bào thực vật để sinh sản, các virus đã phát triển mạnh trên cây non và

tế bào non trong một cây Ở các cây già cỗi, quá trình này sẽ chậm lại hay hầu như ngừnghẳn Chính vì vậy, tuổi cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh Các điềukiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinhdưỡng, chăm sóc Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan làinterferon có thể sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập Với nồng độ thấp khoảngmột phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus Chính vì những lý do trênbệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá Sự huỷ diệt chỉxảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, nhưtrong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những năm 1960

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong Về sau, lá không có hình

dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp Cuống lá có thể xoắn vặn.

Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không

ra quả do hoa bị rụng (Picó và cộng sự, 1996) Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiếtnóng như hè thu và xuân hè

Hình 2.6 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua

(httpwww.avrdc.org)

2.3.7 Lan truyền của Begomovirus

Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới

và chủ yếu là do bọ phấn Bemisia tabaci chích hút

từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe theo kiểu bền

vững tuần hoàn Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ

cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều Bọ phấn dùng vòi

chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch

phloem Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua

màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước

bọt và cuối cùng vào ống nước bọt Hình 2.7 Bọ phấn Bemisia tabaci

2.3.8 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như

bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhấttrên cà chua khắp thế giới (Moriones và Navas-Castillo, 2000)Các bệnh nguy hiểm tương tự

là bệnh khảm lá sắn (Legg và Fauquet, 2004), bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003) Trong đógây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua

Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng Bệnh đã trởthành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới vàcận nhiệt đới (Picó và cộng sự, 1996)

Những năm gần đây công nghệ gen bước đầu được ứng dụng trong việc sản xuất giốngkháng bệnh bằng biện pháp bắn gen, chuyển gen Chương trình sản xuất giống cà chuakháng bệnh đã được bắt đầu từ cuối năm 1960 và được phát triển mạnh sau đó Cơ sở củachương trình này là việc lai để chuyển gen kháng bệnh từ các loài cà chua dại sang loài cà chuatrồng Có từ 1-5 gen kháng bao gồm cả gen trội và gen lặn đã được công bố bởi (Picó và cộng

sự, 1996) Năm 1998, Vidavski & Czosnek cho biết tính chịu được quyết định chủ yếu bởigen trội còn tính kháng được quyết định bởi từ 2-3 gen lặn

Cơ chế RNA slencing cũng đã được ứng dụng để tạo ra giống kháng được begomovirus Ở

Việt Nam hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành đề tài nghiên cứu về vấn đềnày Tuy nhiên, có một vấn đề gặp phải là RNA silencing là một cơ chế của cây chống lạivirus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây Người ta đã chứng minh

bằng thực nghiệm rằng AC4 của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing

của cây ký chủ trong tế bào chất

Biện pháp đang đươc áp dụng hiện tại để phòng bệnh do begomovirus gây ra là diệt trừ bọ phấn,

biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh.Sử dụng thuốc hoá học để trừ bọ phấn là mộtbiện pháp đã được tiến hành và cho hiệu quả cao Tuy nhiên việc sử dụng thuốc không chỉ gây ô

nhiễm môi trường sống mà còn làm tăng tính kháng thuốc của bọ phấn.Chúng ta cũng có thể sửdụng biện pháp dùng bẫy dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng.

2.4. Phương pháp RCA (rolling circle amplification )

Là phương pháp dùng để nhân một lượng lớn DNA dưới dạng các polymer theo cơ chếvòng lăn (tương tự như quá trình tái sinh của virus) nhờ một đoạn mồi ngẫu nhiên (Randomhexamer), và enzyme phi 29 DNA polymerase hoạt động ở nhiệt độ 300C trong vòng 18 giờ

để tổng hợp và kéo dài sợi mới có kích thước lên tới 10kb Các sợi mới được hình thành lạitrở thành đoạn khuôn để tổng hợp các sợi tiếp theo

2.5. Kỹ thuật xác định trình tự

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày nay đều dựatrên phương pháp của Frederick Sanger (1977), có cải tiến Phương pháp này còn được gọi làphương pháp enzyme học hay phương pháp dideoxy

Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dàiAND khi tổng hợp Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) CácddNTP có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp qua nhóm 5 triphosphat nhưng lạikhông thể tiếp tục kết hợp được với phân tử desoxynucleosid triphosphat tiếp theo Do đókhi trộn lẫn lượng nhỏ dideoxynucleosid triphosphat với 4 loại desoxynucleosid triphosphatrồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ DNA polymerase thì sẽ thu được một loạt các đoạn DNAđược kết thúc đặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotit Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi phảnứng bổ sung 1 loại dideoxy nucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn DNA có kết thúc bằngcác dideoxy nucleotit khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit Chạy điện di các đoạn này rồihiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự của chuỗi DNA quan tâm

2.6. Kỹ thuật agroinoculation

Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A.tumerfaciens được gọi

là agroinoculation Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi phải thiết kế 1 cấu trúc xâm nhiễm bao

gồm bộ gen virus (hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và

được nối vào 1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên Cấu trúc xâm

nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumerfaciens Khi lây nhiễm, tế bào vi

khuẩn sẽ tiếp xúc với tế bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên Ti plasmid) sẽchuyển toàn bộ phần DNA nằm giữa bờ trái và bờ phải của cấu trúc xâm nhiễm vào nhân tếbào cây ký chủ và tổng hợp phần DNA này vào bộ gen tế bào cây ký chủ Trong tế bàochuyển gen, gen Rep của virus sẽ được biểu hiện thành protein Rep Protein Rep sẽ cắt bộgen virus khỏi bộ gen tế bào cây tại vị trí đặc hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ genvirus nguyên vẹn Bộ gen virus nguyên vẹn này sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây

bệnh

A: Agrobacterium tumefaciens B: Agrobacterium genome C: Ti Plasmid : a: T-DNA , b:

Vir genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes D: Plant cell E:Mitochondria F: Chloroplast G: Nucleus

Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được nhúng trong dungdịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâmnhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vikhuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào đất

2.7 Kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification)

Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling CircleAmplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng Kỹ thuật RCAdùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển

mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòngthành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩmRCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vectordòng hóa thông thường Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu cácvirus có bộ gen DNA mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh (Inoue-Nagata và cộng

sự, 2004; Haible và cộng sự, 2006; Knierim và Maiss, 2007)

Hình 2.10 Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle

Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA (Fujii và cộng sự, 2006)

Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus Sảnphẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp trong điềukiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) vàmultimer (nhiều bộ gen) Chỉ các sản phẩm dimer được tinh chiết khỏi gel agarose và nốivào vector nhị nguyên Bằng cách đơn giản này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus cóthể được tạo ra khá nhanh chóng (Inoue-Nagata và cộng sự, 2004; Knierim và Maiss, 2007;Ferreira và cộng sự, 2008; Wu và cộng sự, 2008; Wyant và cộng sự, 2011)

III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Địa điểm, thời gian, đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.1: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Trung Việt Nam.

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứngVNP62

VNP626

VNP62

VNP635

Điện Bàn – Quảng Nam ớt Begomovirus nhẹ

VNP86

VNP870

VNP87

VNP875

Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Lá nhăn nhỏ, già

VNP87

VNP880

VNP911 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm từ trong ra, xoăn lá

Bảng 3.2: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Nam Việt Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

Bảng 3.3: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Trung Việt

Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP436 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP441 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP725 Vinh – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP727 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP893 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP894 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Khảm vàng

VNP895 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn chết hoại, đốm

VNP896 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Vàng, chết hoại gân, cuống láVNP897 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP898 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm vàng Chết hoại gânVNP899 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNO90

0

Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP901 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm xanh, chết hoại

VNP902 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP903 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP904 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xanh đốm, chết hoại

VNP905 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

VNP906 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

Bảng 3.4: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Nam Việt Nam

Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng

VNP86 Playku – Gia Lai Cà chua Xoăn ngọn, chùn ngọn

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol

- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %

Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 200C, trong đó rifampicin và kanamycin đượcbọc kín bằng giấy bạc

3.1.4.2 Cấu trúc xâm nhiễm

Các cấu trúc xâm nhiễm gồm toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β) được nối vào một vectornhị nguyên pCAMBIA-2300 mang gen kháng kanamycin đối với cả chọn lọc thực vật vàchọn lọc vi khuẩn Đây đây là một vector nhị nguyên thuộc nhóm vector pCAMBIA đượctạo ra bởi viện CAMBIA (http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html) pCAMBIA-

2300 là vector tối thiểu cho chuyển gen thực vật và được sử dụng tốt trong thí nghiệmagroinoculation

Phần gen virus (hoặc DNA-β) được xây dựng sao cho toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β)

có 2 vùng nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu

Các chủng vi khuẩn sử dụng

Chủng vi khuẩn A Tumefaciens khả biến

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404 Chủng này chứa Ti plasmid

pAL4404 Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còn gen khángstreptomycin nằm trên Ti plasmid pAL4404

H

ình 3.2: Hinh thái vi khuẩn A tumefaciens

Chủng vi khuẩn E Coli khả biến

Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue Chủng này chứa gen khángTetracylin nằm trên bộ gen của vi khuẩn

3.1.4.3 Thành phần cho phản ứng PCR, RCA, Điện di

Cặp mồi chung DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 & Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong

et al., 2006).

BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*-3’

BegoA-For1 : 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* -3’

Hình 3.3: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1

* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T)

và i = inosine

Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng

Bảng 3.5 : Các mồi đặc hiệu

Các mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm Phát hiện virus

3.2 PHƯƠNG PHÁP

3.2.1 Chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ mô lá được chiết theo các phương pháp:

+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993):

Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 Mvào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá Lấy 100 µl dung dịchđệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vàotube 1,5mL chứa dung dịch đệm Tris 0,1M, pH = 8 Dịch hòa loãng này được dùng để chạyPCR

+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium Bromide ) theo mô

tả của Doyle & Doyle (1987), Wang et al., 1993 như sau:

Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol).Sau đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1.DNA tổng số được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn DNA 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và

để khô cặn DNA trong không khí ít nhất 30 phút Hoà cặn DNA trong 100µl nước cất hailần đã hấp vô trùng, bảo quản DNA ở -200C

3.2.2 Phản ứng RCA (rolling circle amplification )

Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích là 20 μL trong đó có

20X Exo-Hexamer (500 μM, Fermentas) 0.25 μl

10XPhi29 buffer (Fermentas) 1.0 μl

Phi29 enzyme (10 U/μL, Fermentas) 0.25 μl

Pyrophosphate (0.1U/μL, Fermentas) 0.25 μl

Phản ứng được ủ ở 30oC trong 18h sau đó ủ ở 65oC để bất hoạt enzyme

Thực hiện phản ứng cắt sản phẩm RCA bằng BamHI với tổng thể tích là 10 μL với cácthành phần phản ứng như sau:

Trộn đều và ủ tube ở 370C trong 5phút và bất hoạt enzyme bằng 0.5 μL EDTA 0.5M Điện

di sản phẩm cắt trên agarose gel 1 % và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide

3.2.3.Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR.

- Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp chuyêndụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số.

3.2.4 Tinh chiết sản phẩm điện di

Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit Cácbước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.2.5 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm

- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI

Dephosphorylation vector pCAMBIA-2300 sau khi được mở vòng bằng BamHI

pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30

10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4

Alkaline Phosphatase (Roche) 6

Sau đó ủ ở 370C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCR purification kit(Invitrogen)

Nối vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gel purified)

3.2.6 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến

Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo An và cs (1988)

Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ

370C trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm)

Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng

trong lọ định mức ở 500 ml Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37 0C) cho tới khi mật độquang OD600 đạt 0,5 - 1,0

Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút Cho toàn bộ dung

dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4 0C

Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa) Hoà cặn vi khuẩn

với 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM đã được làm lạnh trước trong đá Sau đó phân phối cứ0,1 ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá.Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu - 800C

3.2.7 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng

phương pháp sốc nhiệt

- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80 oC ) cho lên khay đá vụn

để tan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy)

- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37 oC, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc

- Cho 150 μL vi khuẩn dã đông vào tube 1.5 ml đã đặt trên đá trước đó Cho 10 μL sảnphẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ

- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37 oC

- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL

Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa LB agar + Kanamycin + Tetracylin

- Nuôi qua đêm ở 37 oC trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc

3.2.8 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc

Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại kháng sinh) ở

bằng nước vô trùng Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn vi khuẩn và để trong tủ -20oC

ít nhất 30 phút Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút, đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đichạy PCR

3.2.9 Tinh chiết plasmid

DNA plasmid được chiết từ tế vi khuẩn theo kỹ thuật chiết plasmid (miniprep) củaSambrook và cs (1989)

Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa kháng

sinh cho vào mỗi tube Eppendorf loại 1,5 ml

Bước 2: Ly tâm 3 phút ở máy ly tâm để bàn để lắng cặn vi khuẩn Loại bỏ dịch trong

để nguyên cặn trong tube

Bước 3: Cho tiếp 1,5 ml dịch vi khuẩn vào tube và lặp lại bước 2.

Bước 4: Ly tâm 3 phút để lắng cặn vi khuẩn, loại bỏ dịch trong để nguyên cặn trong

tube Dùng pipes hút hết dịch trên tủa Để tube trên đá khoảng 3 phút

Bước 5: Cho 100 μl dung dịch I đã được để lạnh trên đá vào tube Cho tiếp 2 μl

RNAse A (dung dịch gốc 10 mg/mL) Votex để hòa tan vi khuẩn

Bước 6: Cho 200 μl dung dịch II vào tube (cần kiểm tra xem SDS có bị kết tủa

không nếu có cần làm ấm dung dịch để hoà tan SDS) Ở bước này không cần trộn tube vàphải để tube trên đá và không được để dịch tan quá 2 phút vì plasmid dễ bị biến tính ở nồng

độ kiềm cao Bước này là bước phá huỷ vách tế bào giải phóng DNA genom và DNAplasmid nên dịch tan trở nên rất nhầy

Bước 7: Cho 150 μl dung dịch III đã để lạnh trước trên đá vào tube, trộn đều bằng

lắc tube nhiều lần Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genom (vì có kích thướclớn) sẽ bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên vẫn hoà tan trong dung dịch

Để tube trên đá khoảng 3 phút

Bước 8: Ly tâm dung dịch 5 phút để kết tủa prtein và DNA genomic Chuyển dịch

trên tủa (khoảng 400 μl) có chứa DNA plasmid sang một tube mới, loại bỏ tube cũ và cặnbên trong tube

Bước 9: Cho một thể tích tương đương (khoảng 400 μl) isopropanol vào tube Trộn

đều bằng đảo tube nhiều lần Để tube ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút Trong bước nàyisopropanol sẽ làm kết tủa DNA plasmid

Bước 10: Ly tâm 5 phút để kết tủa DNA plasmid Loại bỏ dịch trong giữ lại cặn

DNA plasmid Ly tâm nhanh để lắng tất cả dịch bám trên thành tube xuống dưới và dùngpipes hút hết dịch

Bước 11: Cho 500 μl cồn 70 % vào tube để rửa cặn, loại bỏ cồn (trong bước này rửa

cồn càng nhiều lần càng tốt) Để loại bỏ hết cồn ra khỏi tube, thì sau khi đổ hết cồn ra lytâm ngắn khoảng vài giây để lắng tất cả cồn bám trên thành tube xuống dưới và dùng pipeshút hết cồn

Bước 12: Để khô cặn DNA trong không khí khoảng 30 phút.

Bước 13: Hoà cặn DNA plasmid với 50 μl dd H2O vô trùng hoặc đệm TE (pH = 8).

Dịch DNA bây giờ có thể được dùng cho các phản ứng enzyme hoặc bảo quản ở -200C

3.2.10 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens khả biến (competent cells)

Tế bào A tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo An và cs (1988)

Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ

28 oC trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm)

Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng

trong lọ định mức ở 500 ml Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28 oC) cho tới khi mật độquang OD600 đạt 0,5 - 1,0

Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút Cho toàn bộ dung

dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4oC

Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa) Hoà cặn vi khuẩn

với 1 ml dung dịch CaCl2 20 mM đã được làm lạnh trước trong đá Sau đó phân phối cứ 0,1

ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá.Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 80oC

3.2.11 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens khả

biến

Các cấu trúc xâm nhiễm vừa được thiết kế được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khảbiến theo phương pháp đông tan (Hofgen & Willmitzer, 1988) Trong điều kiện phòng thínghiệm, bước đông tan được thưc hiện với tủ lạnh sâu – 80 oC thay vì bằng nitơ lỏng Cácbước cụ thể là:

Bước 1: Lấy tế bào A tumefaciens từ tủ lạnh - 80 oC Để vi khuẩn tan đông trong đá

Bước 2: Lấy 10 μl dịch DNA của mỗi cấu trúc cho vào tube tế bào vi khuẩn và trộn

đều

Bước 3: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào tủ lạnh sâu – 80oC trong vòng 15phút

Bước 4: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37 oC trong vòng 5 phút

Bước 5: Cho dịch vi khuẩn đã được transfomation vào ống nghiệm chứa 1 ml môi

trường LB lỏng, ủ ống nghiệm trong tủ ấm có lắc ở 28 oC trong 1giờ

Bước 6: Chuyển dịch vi khuẩn vào tube 1,5 ml.

Bước 7: Ly tâm trong 3 phút, lấy phần dịch trên tủa, loại cặn, sau đó cho tiếp 100 μl

môi trường LB lỏng

Bước 8: Dịch vi khuẩn ở bước 8 được cấy trên đĩa môi trường LB - agar có 3 loại

kháng sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100 μg/mL)

Bước 9: Các đĩa petri được ủ ở 28 oC trong vòng 2 ngày Kiểm tra sự hình thànhkhuẩn lạc

Bước 10: Dùng tăm nhọn đã được hấp khử trùng lấy một ít vi khuẩn ở mỗi khuẩn lạc

rồi thả vào trong ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB lỏng chứa 3 kháng sinh ở trên

Bước 11: Các ống nghiệm được ủ 24 giờ trong tủ ấm có lắc (200 rpm / 28 oC)

Bước 12: Kiểm tra đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường LB lỏng và

kiểm tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm trong vi khuẩn bằng PCR sau khi chiết DNAplasmid