Đề tài: Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam

Trong nghiên cứu này tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gen của mộtbipartite begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây ớt đã được Nguyễn Đức Anh phân lập năm 2013. Kết quả là toàn bộ bộ gen của mẫu begomovirus đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue.

Tôi xin g i l i c m  n chân thành nh t đ n cán b , công nhân viên thu c Trung tâmử ờ ả ơ ấ ế ộ ộ  

B nh cây nhi t đ i ­ Trệ ệ ớ ường Đ i h c N ng nghi p Hà N i đã nhi t tình giúp đ  và t oạ ọ ộ ệ ộ ệ ỡ ạ  

đi u ki n cho tôi làm vi c trong su t quá trình th c t p t i Trung tâm.ề ệ ệ ố ự ậ ạ

Đ ng th i tôi cũng xin bày t  s  bi t  n chân thành t i các Th y giáo, Cô giáo trong b  mônồ ờ ỏ ự ế ơ ớ ầ ộ  Công ngh  sinh h c th c v t cũng nh  các th y cô trong khoa Công ngh  sinh h c, trệ ọ ự ậ ư ầ ệ ọ ườ  ng

Đ i h c Nông nghi p Hà N i đã nhi t tình d y d , ch  b o tôi trong su t th i gian tôi h cạ ọ ệ ộ ệ ạ ỗ ỉ ả ố ờ ọ  

t p   trậ ở ường

Cu i cùng tôi xin c m  n t i gia đình, ngố ả ơ ớ ười thân các anh ch  em và b n bè đã giúpị ạ  

đ , đ ng viên tôi trong su t quá trình h c t p cũng nh  hoàn thành báo cáo t t nghi p này.ỡ ộ ố ọ ậ ư ố ệTôi xin chân thành c m  n!ả ơ

1

TÓM T TẮ

Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành nhân dòng và gi i trình t  toàn b  b  genứ ế ả ự ộ ộ  

c a m tbipartite begomovirusủ ộ , được cho là ch a t ng đư ừ ược phát hi n   Vi t Nam gây h iệ ở ệ ạ  trên cây  t ớ đã được Nguy n Đ c Anh ễ ứ phân l p năm ậ 2013. K t qu  là ế ả toàn b  b  gen c aộ ộ ủ  

m u begomovirus đã đẫ ược nhân dòng thành công vào t  bào ế E.coli ch ng XL1­Blue. Chúngủ  tôi cũng đã gi i trình t  và thu đả ự ược toàn b  b  gen c a  m u virus v i kích thộ ộ ủ ẫ ớ ước kho ngả  2.7 kb

Chúng tôi ti n hành nghiên c u v  begomovirus trên  t và cà chua   mi n Trung vàế ứ ề ớ ở ề  

mi n Nam Vi t Nam, begomovirus m i gây b nh xoăn vàng lá trên  t   hai vùng này. Nhânề ệ ớ ệ ớ ở  dòng thành công và gi i đả ược b  gen DNA­A c a virus này, thông qua phân tích trình t , đ cộ ủ ự ặ  

tr ng phân t  và ph  h  cho th y đây là 1 loài m i thu c chi ư ử ả ệ ấ ớ ộ Begomovirus gây h i trên  t vàạ ớ  

được chúng tôi đ t tên là ặ Chilli leaf curl virus (CLCV).

3

I. Đ T V N ĐẶ Ấ Ề

1. Gi i thi uớ ệ

H  ọ Geminiviridae  là h  virus th c v t l n nh t, có kho ng 200 loài(ọ ự ậ ớ ấ ả Fauquet và Stanley, 

2005).Trong đó begomovirus là chi l n nh t và quan tr ng nh t trong h  ớ ấ ọ ấ ọ Geminiviridae c  vả ề 

s  lố ượng loài và b nh do chúng gây ra v i cây tr ng.ệ ớ ồ Begomovirus(được đ t tên t  ặ ừ Bean  golden mosaic virus) có hình thái phân t  d ng hình c u kép (hình chùy) và b  gen DNA s iử ạ ầ ộ ợ  vòng đ n, kích thơ ước kho ng 2,7 kb (ả Fauquet và Stanley, 2005), lan truy n trên đ ng ru ngề ồ ộ  

b ng b  ph n (ằ ọ ấ Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn.ể ề ữ ầ

Begomovirus có th  có b  gen đ n (g m m t phân t  DNA­A) ho c có b  gen kép (g m haiể ộ ơ ồ ộ ử ặ ộ ồ  phân t  DNA­A và DNA­B).   m t s  lo i cây ch  c n phân t  DNA­A đã gây tri u ch ngử Ở ộ ố ạ ỉ ầ ử ệ ứ  

đi n hình, còn   m t s  lo i c y khác thì c n có c  phân t  DNA­A và DNA­B m i gây raể ở ộ ố ạ ấ ầ ả ử ớ  tri u ch ng b nh. G n đây, m t lo i phân t  DNA vòng đ n n a, có kích thệ ứ ệ ầ ộ ạ ử ơ ữ ước kho ng 1ả  

n a b  gen  ử ộ begomovirus  thường được phát hi n th y có liên quan v i nhi u b nh doệ ấ ớ ề ệ  

begomovirus  gây ra và được g i là các DNA­ọ β. Các phân t  ử DNA­  này ph  thu c vàoβ ụ ộ  

begomovirus đ  nhân lên và do đó để ược xem là các ph n t  v  tinh c a ầ ử ệ ủ begomovirus. Vai trò 

c a   phân   t  ủ ử DNA­   trong   hình   thành   tri u   ch ng   b nh   không   th ng   nh t,   m t   sβ ệ ứ ệ ố ấ ộ ố begomovirus ch  có th  t o ra tri u ch ng b nh v i s  có m t c a phân t  ỉ ể ạ ệ ứ ệ ớ ự ặ ủ ử DNA­  trong khiβ  các loài khác l i không c n. Do đó vi c phòng tr  b nh xoăn vàng lá càng tr  nên khó khănạ ầ ệ ừ ệ ở  

h n.ơ

Nhi u b nh nghiêm tr ng trên cây tr ng đề ệ ọ ồ ược xác đ nh là do ị begomovirus gây ra nh  b như ệ  xoăn vàng lá cà chua – m t b nh độ ệ ược xem là nguy hi m nh t trên cà chua kh p thể ấ ắ ế 

gi iớ (Moriones và c ng s , 2007ộ ự ). Hi n nay, có t i 50 ệ ớ begomovirusphân l p t  cà chua (có tậ ừ ừ 

tomato   đ u tên virus) đã đở ầ ược công b  trên th  gi i (ố ế ớ Fauquet và c ng s , 2008ộ ự ). Trên cây 

cà chua, các begomovirus t o tri u ch ng gi ng nhau, đi n hình là: cu n lá (cong l i hìnhạ ệ ứ ố ể ố ạ  thìa); mép lá (đ c bi t   lá non) bi n vàng; lá nh  h p; cây nhi m s m còi c c v i t  l  đ uặ ệ ở ế ỏ ẹ ễ ớ ọ ớ ỷ ệ ậ  

qu  r t th p. Danh tính virus ch  có th  đả ấ ấ ỉ ể ược xác đ nh d a vào các phân tích phân tị ự ử (Moriones và Navas­Castillo, 2000)

Vi t Nam đệ ược ch ng minh là trung tâm đa d ng quan tr ng c a  ứ ạ ọ ủ begomovirus(Ha, 

2007). M c dù v y s  lặ ậ ố ượng loài begomovirus xác đ nh trên th c v t c a Vi t Nam v n cònị ự ậ ủ ệ ẫ  

4

ít ch  g m 19 loài đỉ ồ ược phân l p t  nhi u loài cây, trong đó có nhi u cây d i(ậ ừ ề ề ạ Green và c ngộ  

s , 2001ự ),(Ha, 2007).Theo đi u tra hi n nay, b nh do begomovirus gây h i trên di n r ng vàề ệ ệ ạ ệ ộ  không ch  gây b nh trên cà chua, chúng còn gây b nh trên nhi u loài cây khác nh   t, h  đ uỉ ệ ệ ề ư ớ ọ ậ  

đ , đu đ , b u bí  Chính vì v y chúng tôi ti n hành đ  tài: ỗ ủ ầ ậ ế ề “ Nghiên c u begomovirus trên ứ  

t và cà chua   khu v c Mi n Trung và Mi n Nam Vi t Nam”

2. M c tiêu và yêu c u c a đ  tàiụ ầ ủ ề

2.1. M c tiêuụ

­ Gi i trình t  m u virus m i đả ự ẫ ớ ược phân l pậ

­ Phân tích đ c tr ng phân t  c a các m u virus trên  t và cà chua   mi n Trung vàặ ư ử ủ ẫ ớ ở ề  

­ Ch n l c các m u dọ ọ ẫ ương v i BegoA đ  ki m tra v i các m i đ c hi u đã đớ ể ể ớ ồ ặ ệ ược xác 

đ nh   nh   m i   ToLVHnV   (Fị ư ồ 1/R2);   TB101   (F1/   R2);   VB65   (F1/R1);   TY   (F4/R4);To   (F4/R4); To100(F1/R1); TYKa­A (F1/R1), VNP93A (F1/R1), VNP93B (F1/R1)

­ Nhân dòng và gi i trình t  các m u virus trên  t và cà chua đã đả ự ẫ ớ ược ch n, bọ ước đ uầ  

đ nh danh các virus.ị

5

II. T NG QUAN TÀI LI UỔ Ệ

II.1. Nh ng nghiên c u nữ ứ ước ngoài

II.1.1. T m quan tr ng c a  t và cà chuaầ ọ ủ ớ

t 

Ớ  là m t lo i qu  c a các cây thu cộ ạ ả ủ ộ  chi Capsicum c aủ  h  Càọ  (Solanaceae).  t có ngu nỚ ồ  

g c tố ừ châu Mỹ, ngày nay nó được tr ng kh p n i trên th  gi i và đồ ắ ơ ế ớ ược s  d ng làmử ụ  gia 

vị, rau, và thu cố  Hi n nay,ệ   n ĐẤ ộ là nướ ảc s n xu t  t l n nh t th  gi i v i kho ng 1 tri uấ ớ ớ ấ ế ớ ớ ả ệ  

t n m i năm, n i ch  riêng Chấ ỗ ơ ỉ ợ Guntur (l n nh t châu Á) có 1 tri u bao  t.ớ ấ ệ ớ

Cà chua (S.lycopersicum) có ngu n g c t  Nam M , nó đồ ố ừ ỹ ược người Tây Ban Nha lan truy n t i Pilippine, Đông Nam Á và toàn b  Châu Á, cu i cùng là Châu Âu. Cà chua là loàiề ớ ộ ố  trái cây vườn ph  bi n nh t   Hoa K  ổ ế ấ ở ỳ Kho ng 150 tri u t n cà chua đã đả ệ ấ ượ ảc s n xu t raấ  trên Th  gi i trong năm 2009. Trung Qu c là nế ớ ố ướ ảc s n xu t cà chua l n nh t, chi m kho ngấ ớ ấ ế ả  

m t ph n t  s n lộ ầ ư ả ượng toàn c u, ti p theo là Hoa K  vàầ ế ỳ   n ĐẤ ộ. Các khu v c ch  bi nự ế ế  

t iạ  California chi m 90% lế ượng s n xu t   M  và 35% lả ấ ở ỹ ượng s n xu t th  gi i (ả ấ ế ớ Hartz và 

b nh xoăn vàng lá đã tr  thành b nh virus quan tr ng nh t trên cây cà chua kh p thệ ở ệ ọ ấ ắ ế 

gi i(ớ Picó và c ng s , 1996ộ ự ; Ghanim và c ng s , 2001ộ ự ; Moriones và c ng s , 2007ộ ự )

2.2. Tình hình nghiên c u b nh xoăn vàng láứ ệ

2.3. Đ c đi m c a ặ ể ủ Begomovirus gây b nh xoăn vàng láệ

2.3.1. Phân loai chi ̣ Begomovirus

6

Vi c phân lo i virus gây b nh đệ ạ ệ ược ch n đoán theo U  ban Qu c t  v  Phân lo i Virusẩ ỷ ố ế ề ạ  (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV) d a vào đ c đi m c u t o, hìnhự ặ ể ấ ạ  thái c a virus cũng nh  m i quan h  huy t thanh và các đ c tính khác nh  đ c đi m lanủ ư ố ệ ế ặ ư ặ ể  truy n, lây nhi m, ph m vi kí ch  đ c bi t là các đ c đi m c a DNA. Tên g i c a virus h iề ễ ạ ủ ặ ệ ặ ể ủ ọ ủ ạ  

th c v t quy đ nh dùng ti ng Anh bao g m tên c a cây kí ch  chính, tri u ch ng b nh trênự ậ ị ế ồ ủ ủ ệ ứ ệ  cây kí ch  đó và cu i cùng là t  virus. Ví d : virus gây b nh kh m thu c lá ­  ủ ố ừ ụ ệ ả ố Tobacco  mosaic virus ­ vi t t t là TMV.ế ắ

Nghiên c u h  th ng phát sinh có th  chia ứ ệ ố ể begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm Tân 

th  gi i (New world) bao g m Châu M  và nhóm C u th  gi i (Old world) là khu v c bánế ớ ồ ỹ ự ế ớ ự  

c u đông bao g m châu Âu, châu Phi, châu Á(ầ ồ Rybicki, 1994; Padidam và c ng s , 1999ộ ự )

Các begomovirus c a hai nhóm tân th  gi i và c u th  gi i đủ ế ớ ự ế ớ ược phân bi t nhau b i đ cệ ở ặ  

đi m b  gen. T t c  các ể ộ ấ ả begomovirus   c m Tân th  gi i đ u có b  gen kép, trong khi đóở ụ ế ớ ề ộ  

các  begomovirus   c m C u th  gi i có c  b  gen đ n và kép, thêm vào đó t t c  cácở ụ ự ế ớ ả ộ ơ ấ ả  

begomovirus c a c m C u th  gi i có thêm m t gen AV2 trên DNA­A, gen này không t nủ ụ ự ế ớ ộ ồ  

t i   các virus c a c m Tân th  gi i (ạ ở ủ ụ ế ớ Rybicki, 1994). Begomovirus   c m Tân th  gi i cóở ụ ế ớ  chu i PWRsmaGT   đ u N trong v  protein (CP) mã hóa b i gen AV1, chu i này không cóỗ ở ầ ỏ ở ỗ  

m t   ặ ở begomovirus c a c m C u th  gi i (ủ ụ ự ế ớ Harrison và c ng s , 2002ộ ự )

Rybicki (1994) d  đoán r ng b  ph n di chuy n t  Châu Á sang châu M  có th  đã mang tự ằ ọ ấ ể ừ ỹ ể ổ tiên virus c a c m Tân th  gi i mà chúng ta quan sát th y ngày nay. Các virus này sau đóủ ụ ế ớ ấ  

ti n hóa theo m t hế ộ ướng khác v i các virus   c m C u th  gi i.ớ ở ụ ự ế ớ

Gân đây d a trên phân tích h  th ng phát sinh phat hiên ra r ng CoYVV   Viêt Nam không̀ ự ệ ố ́ ̣ ằ ở ̣  

có ORF AV2 và có chu i PWRsmaGT   đ u N trong protein v  (CP), virus này gi ng v iỗ ở ầ ỏ ố ớ  

c m Tân th  gi i h n là c m C u th  gi i. S  có m t c a CoYVV   Vi t Nam đã đ a raụ ế ớ ơ ụ ự ế ớ ự ặ ủ ở ệ ư  

gi  thuy t r ng virus gi ng v i c m Tân th  gi i có th  đã có m t   C u th  gi i trả ế ằ ố ớ ụ ế ớ ể ặ ở ự ế ớ ước khi 

b  phân chia   k  Gondwana (ị ở ỷ Ha và c ng s , 2008ộ ự )

Hi n nay, vi c phân lo i ệ ệ ạ begomovirus ch  y u d a trên so sánh trình t  c a chu i phân tủ ế ự ự ủ ỗ ử 

DNA­A. Theo Fauquet et al.,2008, vi c phân lo i loài trong chi ệ ạ begomovirus tuân th  m t sủ ộ ố tiêu chu n sau:ẩ

(i) Thành ph n c a genome có hay không có DNA­Bầ ủ

7

(ii) T  ch c b  gen có hay không có gen AV2ổ ứ ộ

(iii) Protein Rep không có kh  năng tái b n ả ả trans trong thành ph n b  gen thì có thầ ộ ể ghi nh n loài m i. Tuy nhiên c n l u ý r ng ch  m t thay đ i nh    v  trí liên k t v i Rep cóậ ớ ầ ư ằ ỉ ộ ổ ỏ ở ị ế ớ  

th  ngăn c n s  tể ả ự ương tác ch c năng và s  tái t  h p c a virus.ứ ự ổ ợ ủ

(iv) Đ c đi m c a protein v  M c đ  tặ ể ủ ỏ ứ ộ ương đ ng c a trình t  aminoacid <90%ồ ủ ự  thì ghi nh n là loài m i, tuy nhiên m c đ  tậ ớ ứ ộ ương đ ng nucleotide c a toàn b  b  gen v n làồ ủ ộ ộ ẫ  

c n thi t cho vi c xác nh n phân lo i virusầ ế ệ ậ ạ

2.3.2. Hình thái c a ủ Begomovirus

Các begomovirus gây b nh xoăn vàng lá càệ  

chua nói riêng và  begomovirrus  nói chung 

thu c   chi  ộ Begomovirus  (h   ọ Geminivirus). 

Các Geminivirus   đ u có c u trúc phân tề ấ ử 

(virion) tương t  nhau bao g m 2 hình c uự ồ ầ  

20   m t   (icosahedron),   m i   m t   là   1   tamặ ỗ ặ  

giác đ u v i s  đ n v  tam giác (T) trênề ớ ố ơ ị  

m ihình c u đa di n kép (gemini). Do n iỗ ầ ệ ố  

2.3.3. C u trúc genome c a ấ ủ Begomovirus

Begomovirus có b  gen đ n có phân t  DNA­A ho c b  gen kép bao g m hai phân t  DNA­Aộ ơ ử ặ ộ ồ ử  

và DNA­B. C u trúc c a DNA­A là t ng t  nhau   hai nhóm virus này.ấ ủ ươ ự ở

2.3.3.1. C u trúc c a phân t  DNA­A ấ ủ ử

C u trúc c a m t DNA­A đi n hình g m có 6 ORF đấ ủ ộ ể ồ ược s p x p theo hai chi u ngắ ế ề ượ  cnhau. Theo chi u kim đ ng h  có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa v  protein cóề ồ ồ ỏ  

ch c năng lan truy n ứ ề Begomovirus qua vector và nh p nhân t  bào. Gen AV2 mã hóa Proteinậ ế  

8

có ch c năng c m  ng tri u ch ng, di chuy n h  th ng và tích lũy DNA c a virus. Ngứ ả ứ ệ ứ ể ệ ố ủ ượ  cchi u kim đ ng h  g m có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1(rep) mã hóaề ồ ồ ồ  protein tái b n (Rep protein) có ch c năng tái sinh và tả ứ ương tác v i Protein c a ký ch  đi uớ ủ ủ ề  khi n chu k  t  bào. Gen AC2 (TrAP) mã hóa Protein ho t hóa phiên mã có ch c năng  cể ỳ ế ạ ứ ứ  

ch  ph n  ng phòng th  cu  cây. Gen AC4 (Ren) mã hóa protein tăng cế ả ứ ủ ả ường tái sinh có ch cứ  năng tương tác v i protein ký ch  đi u khi n chu k  t  bào. Gen AC4 mã hóa protein cóớ ủ ề ể ỳ ế  

ch c năng c m  ng tri u ch ng và di chuy n h  th ng (ứ ả ứ ệ ứ ể ệ ố Ha và c ng s , 2008ộ ự )

(v)Hình 2.2. C u trúc phân t  DNA­A c a ấ ử ủ Begomovirus

(http://wcrc.confex.com) 2.3.3.2. C u trúc c a phân t  DNA­B ấ ủ ử

DNA­B c a các ủ begomovirus kép mã hóa cho 2 protein BV1 và BC1 c  hai protein này đ u liênả ề  quan trong vi c di chuy n c a virus.ệ ể ủ

BV1 là m t protein con thoi: ộ BV1 có ch c năng nh  là m t protein con thoi, nó có ch c năng v nứ ư ộ ứ ậ  chuy n virus vào và ra kh i t  bào, tuy v y nó không liên quan đ n vi c nh p nhân c a virusể ỏ ế ậ ế ệ ậ ủ  trong lúc xâm nhi m, ch c năng này đ c ki m soát b i CP.ễ ứ ượ ể ở

BV1 t ươ ng tác v i BC1 trong vi c di chuy n gi a các t  bào: ớ ệ ể ữ ế B t đ u t  nhân BV1 t o m tắ ầ ừ ạ ộ  

ph c h p v i ssDNA, ph c h p này đi ra t  bào ch t và k t h p v i BC1 t o thành ph c h pứ ợ ớ ứ ợ ế ấ ế ợ ớ ạ ứ ợ  BV1 : ssDNA : BC1 sau đó di chuy n đ n s i liên bào và chuy n sang t  bào khác(ể ế ợ ể ế Gafni và Epel, 2002).Vùng C cu i c a BV1 ố ủ Squash leaf curl virus (SqLCV) đ c xác đ nh là y u t  c nượ ị ế ố ầ  thi t cho s  t ng tác v i BC1.ế ự ươ ớ

9

BC1 là m t protein v n chuy n ộ ậ ể Ch c năng c a BV1 gi ng nh  là m t protein v n chuy n đãứ ủ ố ư ộ ậ ể  

được làm rõ trong hai trường h p sau: (1) BV1 c a virus ợ ủ Bean dwarf mosaic virus (BDMV) 

đã làm tăng size exclusion limit (SEL) c a s i liên bào (ủ ợ Tice và c ng s , 2000ộ ự ); (2) BV1 c aủ  

Squash leaf curl virus (SqLCV) đã kích thích t o ra các c u trúc d ng  ng b t ngu n t  lu iạ ấ ạ ố ắ ồ ừ ớ  

n i ch t, các  ng này làm cho virus d  dàng di chuy n gi a các t  bào (ộ ấ ố ễ ể ữ ế VARMA và Malathi, 

2003)   Nh   đã   đư ược   đ   c p     trên,   BC1   tề ậ ở ương   tác   v i   BV1   thông   qua   ph c   h pớ ứ ợ  BV1:BC1:ssDNA đ  v n chuy n virus gi a các t  bào (ể ậ ể ữ ế Gafni và Epel, 2002)

BC1 có liên quan trong tính gây b nh ệ S  k t h p c a BC1 trong tính gây b nh đã đự ế ợ ủ ệ ượ  c

ch ng minh thông qua thí nghi m chuy n gen. Thu c lá và cà chua đã đứ ệ ể ố ược chuy n gen BC1ể  

c a ủ Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, l n lầ ượt nh ng đ c đi m đi n hình c a virusữ ặ ể ể ủ  xâm nhi m đã đễ ược nh n th y.ậ ấ

Hình 2.3: C u trúc phân t  DNA­B c a ấ ử ủ Begomovirus(Ha và c ng s , 2008ộ ự )

2.3.3.3. Đ c đi m c a vùng IRặ ể ủ

Các đ n v  sao chép ng c nhau trên phân t  DNA­A và DNA­B cách nhau b i vùng liên genơ ị ượ ử ở  (itergenic region (IR)),   h u h t các tr ng h p chúng chia s  1 vùng l p cao x p x  200ở ầ ế ườ ợ ẻ ặ ấ ỉ  nucleotide, g i là vùng chung (common region (CR))ọ  Vùng CR có ch a m t đi m b t đ u táiứ ộ ể ắ ầ  

b n (ả ori) có t  ch c bao g m m t c u trúc thòng l ng (Stem­loop), c u trúc này ch a m tổ ứ ồ ộ ấ ọ ấ ứ ộ  trình t  nuleotide b t bi n ng n TAATATTAC, t i v  trí Tự ấ ế ắ ạ ị 7­C8 c n cho vi c c t và n i DNAầ ệ ắ ố  

c a virus trong quá trình tái b nủ ả  IR có m t c u trúc nh n bi t đ c hi u c a virus đã đ c xácộ ấ ậ ế ặ ệ ủ ượ  

đ nh n m d i c u trúc stem­loop, nó ch a m t motif đ c g i là Interon(ị ằ ướ ấ ứ ộ ượ ọ Argüello­Astorga và Ruiz­Medrano, 2001), c n thi t cho nh n bi t và bám vào s i DNA c a virus đ  b t đ u táiầ ế ậ ế ợ ủ ể ắ ầ  

b n. S  tái t  h p c a virus ph  thu c vào motif này. Các virus có chung motif   vùng IR cóả ự ổ ợ ủ ụ ộ ở  

kh  năng tái t  h p v i nhau. M i m t motif s  t ng  ng v i m t trình t  đ c tr ng trên đ uả ổ ợ ớ ỗ ộ ẽ ươ ứ ớ ộ ự ặ ư ầ  

N (Interon related domain – IRD) c a protein REP.ủ

10

2.3.3.4. C u trúc c a phân t DNA­ ấ ủ ử β

M t phân t  v  tinh DNA d ng vòng đ n (DNA­ ) đã đ c tìm th y k t h p v i cácộ ử ệ ạ ơ β ượ ấ ế ợ ớ  

begomovirus có b  gen đ n xâm nhi m trên các cây tr ng và cây d i bao g m bông (cotton),ộ ơ ễ ồ ạ ồ  

m p tây (okar), dâm b t (hibiscus), cây th c qu  (hollyhock), cây đay c m qu  (malvaceae),ướ ụ ụ ỳ ẩ ỳ  cây  kim  ngân  (Caprifoliaceae),   cây   cà   chua   (tomato),   cây   thu c   lá   (tobacco),   và   cây   tố ớ  (solanaceae), squash (Cucurbitaceae), cây hoa cúc và ageratum (Asteraceae)(Briddon, 2003)

(Zhou et al., 2003). Phân t  DNA­ử β đã thu hút đ c s  chú ý k  t  khi ượ ự ể ừ (Briddon, 2003)ch ngứ  minh r ng tri u ch ng đi n hình trên cây ageratum (b nh vàng gân trên cây ageratum) và câyằ ệ ứ ể ệ  bông (b nh cu n lá bông) ch  có th  hình thành khi ệ ố ỉ ể Ageratum yellow vein virus (AYVV) và  Cotton leaf curl virus (CLCV) cũng được lây nhi m v i m t phân t  DNA –   tễ ớ ộ ử β ương  ng.ứ  Phân t  DNA­  có b  gen s i vòng đ n v i kích thử β ộ ợ ơ ớ ước x p x  1350 nucleotide mang 3 vùngấ ỉ  

s n ph m  C1 có ch c năng trong bi u hi n tri u ch ng. G n đây protein v  tinh  C1ả ẩ β ứ ể ệ ệ ứ ầ ệ β  (Y10 ) c a virus β ủ Tomato yellow leaf curl China virus ch ng  ủ Y10 (TYLCCNV­Y10) đã đượ  c

ch ng minh là có kh  năng ngăn ch n ph n  ng phòng th  c a cây ứ ả ặ ả ứ ủ ủ (Cui et al., 2005).

11

Hình 2.4: C u trúc c a phân t  DNA­β ấ ủ ử

(http://wcrc.confex.com)

2.3.4. Tái sinh c a ủ Begomovirus

Begomovirus tái sinh theo c  ch  vòng lăn (rolling circular mechanism). C  ch  vòng lăn cóơ ế ơ ế  

th  để ược chia làm 2 pha và được th c hi n trong nhân t  bào ký ch  (ự ệ ế ủ Picó và c ng s ,ộ ự  

1996)P

(1) Pha t ng h p s i DNA vòng đ n (b  gen có m t trong phân t  virus) thành s i DNAổ ợ ợ ơ ộ ặ ử ợ  vòng kép khi b  gen virus độ ược chuy n vào nhân t  bào. Nh  v y s i kép s  g m m t s iể ế ư ậ ợ ẽ ồ ộ ợ  virus và m t s i tộ ợ ương đ ng virus. Pha này v n ch a đồ ẫ ư ược hi u rõ.ể

(2) Pha tái sinh theo c  ch  vòng lăn: Protein Rep (sau khi đơ ế ượ ổc t ng h p) s  c t s i virusợ ẽ ắ ợ  

t i chu i b o toàn TATATTAC. Nh  v t li u cũng nh  enzyme DNA polymearase c a tạ ỗ ả ờ ậ ệ ư ủ ế bào, s i virus đợ ượ ổc t ng h p liên t c trên s i tợ ụ ợ ương đ ng virus. Protein Rep l i ti p t c c tồ ạ ế ụ ắ  

s i virus m i đợ ớ ượ ổc t ng h p t i chu i TATATTAC (cũng v a m i đợ ạ ỗ ừ ớ ượ ổc t ng h p) thànhơ  

m t s i virus hoàn ch nh dộ ợ ỉ ướ ại d ng s i đ n m ch th ng. Protein Rep sau đó s  n i 2 đ uợ ơ ạ ẳ ẽ ố ầ  

c a m ch th ng đ  t o ra b  gen virus s i đ n m ch vòng hoàn ch nhủ ạ ẳ ể ạ ộ ợ ơ ạ ỉ

2.3.5. Tương tác và tái t  h p c a ổ ơ ủ Begomovirus

Cây tr ng   vùng nhi t đ i và c n nhi t đ i thồ ở ệ ớ ậ ệ ớ ường b  nhi m hai ho c nhi u ị ễ ặ ề geminivirus

(Harrison và c ng s , 2002ộ ự ; Ribeiro và c ng s , 2006ộ ự ; Briddon và c ng s , 2008ộ ự )(Harrison và 

c ng s , 2002ộ ự ; Briddon, 2003; Ribeiro và c ng s , 2006ộ ự ). Trong cây virus tương tác v i nhauớ  

t o ra ph c h p b nh (complex disease) (ạ ứ ợ ệ Moriones và Navas­Castillo, 2000; Chakraborty và 

12

c ng s , 2003ộ ự ). Ki u tể ương tác đ ng nhi m b nh c a các virus (co­infection virus) t o raồ ễ ệ ủ ạ  tri u ch ng rõ r t h n khi quan sát   cây b  t ng lo i virus riêng. Tệ ứ ệ ơ ở ị ừ ạ ương tác có th  là s  bể ự ổ 

tr  (complementation) ho c tái t  h p.ợ ặ ổ ợ

Tác d ng ph i h p gi a hai ụ ố ợ ữ Geminivirus tái t  h p m i có th  x y ra, và t o ra nhi u tri uổ ợ ớ ể ả ạ ề ệ  

ch ng h n. Ví d  nh    Cameroon, tái t  h p kép (double recombinant) đứ ơ ụ ư ở ổ ợ ượ ạc t o thành khi 

đ ng xâm nhi m các isolate c a ồ ễ ủ African cassava mosaic virus, đã t o ra nhi u tri u ch ngạ ề ệ ứ  

h n so v i cây b  nhi m t ng isolate riêng. M t ví d  khác là s  tái t  h p t  nhiên gi a haiơ ớ ị ễ ừ ộ ụ ự ổ ợ ự ữ  

begomovirus là TYLCSV và TYLCV (Tây Ban Nha), đã t o ra virus kh e h n hai virus banạ ỏ ơ  

đ u (ầ Moriones và Navas­Castillo, 2000)

Tái t  h p đổ ợ ược cho là đóng vai trò quy t đ nh t i s  ti n hóa c a virus, đ c bi t là   qu nế ị ớ ự ế ủ ặ ệ ở ầ  

th  ể Geminivirus, góp ph n t o nên s  đa d ng di truy n(ầ ạ ự ạ ề Sarkar và Kulshreshtha, 1978). Tái 

t  h p c a ổ ợ ủ begomovirus có th  x y ra   m c đ  ch ng loài ể ả ở ứ ộ ủ ( Markham và c ng s , 1996 ộ ự ;  Briddon, 2003 ) chi, và ngay trong cùng m t h  (ộ ọ Jones, 2003)

2.3.6. Tri u ch ng b nhệ ứ ệ

B nh xoăn vàng lá xu t hi n tri u ch ng trong vòng 2­4 tu n sau khi nhi m b nh và phátệ ấ ệ ệ ứ ầ ễ ệ  tri n đ y đ  tri u ch ng trong vòng 2 tháng. Tri u ch ng có th  thay đ i theo đi u ki n môiể ầ ủ ệ ứ ệ ứ ể ổ ề ệ  

trường, giai đo n sinh trạ ưởng và đi u ki n sinh lý c a cây t i th i đi m nhi m b nh(ề ệ ủ ạ ờ ể ễ ệ Picó 

và c ng s , 1996ộ ự ). Do ph i d a hoàn toả ự

àn vào v t ch t c a t  bào th c v t đ  sinh s n, các virus đã phát tri n m nh trên cây non vàậ ấ ủ ế ự ậ ể ả ể ạ  

t  bào non trong m t cây.   các cây già c i, quá trình này s  ch m l i hay h u nh  ng ngế ộ Ở ỗ ẽ ậ ạ ầ ư ừ  

h n. Chính vì v y, tu i cây non và ph n non c a cây là n i virus sinh s n r t m nh. Cácẳ ậ ổ ầ ủ ơ ả ấ ạ  

đi u ki n ngo i c nh nh : nhi t đ  quá cao, th p, đ  pH c a môi trề ệ ạ ả ư ệ ộ ấ ộ ủ ường, ánh sáng, ch  đế ộ dinh dưỡng, chăm sóc. M t ch t độ ấ ược nhi u nhà khoa h c xác nh n có b n ch t protein tanề ọ ậ ả ấ  

là interferon có th  s n sinh ra   t  bào ký ch  khi virus xâm nh p. V i n ng đ  th pể ả ở ế ủ ậ ớ ồ ộ ấ  kho ng m t ph n tri u gram đã có kh  năng  c ch  sinh s n c a virus. Chính vì nh ng lýả ộ ầ ệ ả ứ ế ả ủ ữ  

do trên b nh virus không gây đệ ược tác h i hu  di t ngay mà thạ ỷ ệ ường gây thoái hoá. S  huự ỷ 

13

di t ch  x y ra khi đi u ki n môi trệ ỉ ả ề ệ ường và cây b nh thu n l i cho virus sinh s n và lâyệ ậ ợ ả  nhi m, nh  trong các tr n d ch c a b nh lúa vàng l i   nễ ư ậ ị ủ ệ ụ ở ước ta nh ng năm 1960.ữ

Tri u ch ng s m nh t là lá cong xu ng dệ ứ ớ ấ ố ưới vào phía bên trong. V  sau, lá không có hìnhề  

d ng, nh  h p, bi n vàng t  mép và chót lá lan vào gi a gân; ạ ỏ ẹ ế ừ ữ lá cu n cong lên phía trên ố   thành hình thuy n ề ; lá non bi n vàng m nh, giòn và nh  h p ế ạ ỏ ẹ  Cu ng lá có th  xo n v n.ố ể ắ ặ  Cây lùn còi c c, m c nhi u cành nhánh nh , đ t thân ng n. Cây nhi m s m thọ ọ ề ỏ ố ắ ễ ớ ường không 

ra qu  do hoa b  r ng (ả ị ụ Picó và c ng s , 1996ộ ự ). B nh thệ ường xu t hi n vào các v  có th iấ ệ ụ ờ  

ti t nóng nh  hè thu và xuân hè.ế ư

Hình 2.6. Tri u ch ng do ệ ứ Begomovirus gây ra trên  t và cà chuaớ

(httpwww.avrdc.org)

2.3.7. Lan truy n c a ề ủ Begomovirus

Virus lây lan b ng d ch cây, b ng ti p xúc cằ ị ằ ế ơ 

gi i và ch  y u là do b  ph n  ớ ủ ế ọ ấ Bemisia tabaci 

chích hút t  cây b nh r i truy n sang cây kh eừ ệ ồ ề ỏ  

theo ki u b n v ng tu n hoàn. M t đ  b  ph nể ề ữ ầ ậ ộ ọ ấ  

càng cao thì t  l  cây b  b nh xoăn lá càng nhi u.ỷ ệ ị ệ ề  

B  ph n dùng vòi ch c vào mô m ch d n đ  hútọ ấ ọ ạ ẫ ể  

d ch cây t  m ch phloem. Virus đị ừ ạ ược hút qua 

vòi, t i di u, th m qua màng ru t vào xoang cớ ề ấ ộ ơ 

th , đ t t i tuy n nể ạ ớ ế ước b t và cu i cùng vàoọ ố  

ng n c b t

Hình 2.7. B  ph n ọ ấ Bemisia tabaci

14

2.3.8. Thi t h i kinh t  do ệ ạ ế Begomovirus gây ra

Nhi u b nh nghiêm tr ng trên cây tr ng đã đề ệ ọ ồ ược xác đ nh là do  ị begomovirus  gây ra như 

b nh b nh xoăn vàng lá (ng n) cà chua, m t b nh đệ ệ ọ ộ ệ ược xem là b nh virus nguy hi m nh tệ ể ấ  trên cà chua kh p th  gi i (ắ ế ớ Moriones và Navas­Castillo, 2000)Các b nh nguy hi m tệ ể ương tự 

là b nh kh m lá s n (Legg và Fauquet, 2004), b nh cu n lá bông (ệ ả ắ ệ ố Briddon, 2003). Trong đó gây thi t h i l n nh t là b nh xoăn vàng lá ng n cà chua.ệ ạ ớ ấ ệ ọ

B nh xoăn vàng lá cà chua gây thi t h i l n c  v  năng su t và ch t lệ ệ ạ ớ ả ề ấ ấ ượng. B nh đã trệ ở thành b nh virus quan tr ng nh t trên cây cà chua kh p Th  Gi i, đ c bi t vùng nhi t đ i vàệ ọ ấ ắ ế ớ ặ ệ ệ ớ  

c n nhi t đ i (ậ ệ ớ Picó và c ng s , 1996ộ ự )

2.3.9. Bi n pháp phòng trệ ừ

Cho t i nay, ngớ ười ta ch a phát hi n th y gen kháng R ch ng l i ư ệ ấ ố ạ begomovirus trên cây cà chua 

tr ng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên m t s  gen kháng ch ng l i ồ ộ ố ố ạ begomovirus đã đượ  cphát hi n th y trên m t s  gi ng cà chua d i. Nh  gen Ty1 đệ ấ ộ ố ố ạ ư ược phân l p t  cây cà chua d iậ ừ ạ  (Lycopersicon chilense) và là m t gen kháng tr i không hoàn toàn (ộ ộ Ha và c ng s , 2008ộ ự )

Nh ng năm g n đây công ngh  gen bữ ầ ệ ước đ u đầ ượ ức  ng d ng trong vi c s n xu t gi ngụ ệ ả ấ ố  kháng b nh b ng bi n pháp b n gen, chuy n gen. Chệ ằ ệ ắ ể ương trình s n xu t gi ng cà chuaả ấ ố  kháng b nh đã đệ ược b t đ u t  cu i năm 1960 và đắ ầ ừ ố ược phát tri n m nh sau đóể ạ  C  s  c aơ ở ủ  

ch ng trình này là vi c lai đ  chuy n gen kháng b nh t  các loài cà chua d i sang loài cà chuaươ ệ ể ể ệ ừ ạ  

tr ng. Có t  1­5 gen kháng bao g m c  gen tr i và gen l n đã đ c công b  b i (ồ ừ ồ ả ộ ặ ượ ố ở Picó và c ngộ  

s , 1996ự ). Năm 1998, Vidavski & Czosnek cho bi t tính ch u đế ị ược quy t đ nh ch  y u b iế ị ủ ế ở  15

gen tr i còn tính kháng độ ược quy t đ nh b i t  2­3 gen l n.ế ị ở ừ ặ

C  ch  ơ ế RNA slencing cũng đã đượ ức  ng d ng đ  t o ra gi ng kháng đụ ể ạ ố ượ begomovirus. Ở c 

Vi t Nam hi n nay Vi n Di truy n Nông nghi p đang ti n hành đ  tài nghiên c u v  v nệ ệ ệ ề ệ ế ề ứ ề ấ  

đ  này. Tuy nhiên, có m t v n đ  g p ph i là ề ộ ấ ề ặ ả RNA silencing là m t c  ch  c a cây ch ngộ ơ ế ủ ố  

l i virus thì virus cũng có c  ch  đ  ch ng l i s  silencing c a cây. Ngạ ơ ế ể ố ạ ự ủ ười ta đã ch ng minhứ  

b ng th c nghi m r ng AC4 c a ằ ự ệ ằ ủ begomovirrus có th   c ch  để ứ ế ường hướng RNA silencing 

c a cây ký ch  trong t  bào ch t.ủ ủ ế ấ

Bi n pháp đang đ c áp d ng hi n t i đ  phòng b nh do ệ ươ ụ ệ ạ ể ệ begomovirus gây ra là di t tr  b  ph n,ệ ừ ọ ấ  

bi n pháp canh tác và s n xu t gi ng kháng b nhệ ả ấ ố ệ S  d ng thu c hoá h c đ  tr  b  ph n làử ụ ố ọ ể ừ ọ ấ  

m t bi n pháp đã đ c ti n hành và cho hi u qu  cao. Tuy nhiên vi c s  d ng thu c không chộ ệ ượ ế ệ ả ệ ử ụ ố ỉ gây ô nhi m môi tr ng s ng mà còn làm tăng tính kháng thu c c a b  ph n.ễ ườ ố ố ủ ọ ấ Chúng ta cũng có 

th  s  d ng ể ử ụ bi n pháp dùng b y dính màu vàng đ  thu hút b  ph n tr ng.ệ ẫ ể ọ ấ ắ

2.4. Phương pháp RCA (rolling circle amplification )

Là phương pháp dùng đ  nhân m t lể ộ ượng l n DNA dớ ướ ại d ng các polymer theo c  chơ ế vòng lăn (tương t  nh  quá trình tái sinh c a virus) nh  m t đo n m i ng u nhiên (Randomự ư ủ ờ ộ ạ ồ ẫ  hexamer), và enzyme phi 29 DNA polymerase ho t đ ng   nhi t đ  30ạ ộ ở ệ ộ 0C trong vòng 18 giờ 

đ  t ng h p và kéo dài s i m i có kích thể ổ ợ ợ ớ ước lên t i 10kb. Các s i m i đớ ợ ớ ược hình thành l iạ  

tr  thành đo n khuôn đ  t ng h p các s i ti p theo.ở ạ ể ổ ợ ợ ế

2.5. K  thu t xác đ nh trình tỹ ậ ị ự

Nh ng ph ng pháp xác đ nh trình t  axit nucleic đang đ c s  d ng ngày nay đ u d aữ ươ ị ự ượ ử ụ ề ự  trên ph ng pháp c a Frederick Sanger (1977), có c i ti n. Ph ng pháp này còn đ c g i làươ ủ ả ế ươ ượ ọ  

ph ng pháp enzyme h c hay ph ng pháp dideoxy.ươ ọ ươ

Trong phương pháp này, người ta s  d ng các nhân t  k t thúc đ c hi u quá trình kéo dàiử ụ ố ế ặ ệ  AND khi t ng h p. Nhân t  k t thúc là các 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Cácổ ợ ố ế  ddNTP có th  k t h p vào chu i DNA đang t ng h p qua nhóm 5 triphosphat nh ng l iể ế ợ ỗ ổ ợ ư ạ  không th  ti p t c k t h p để ế ụ ế ợ ược v i phân t  desoxynucleosid triphosphat ti p theo. Do đóớ ử ế  khi tr n l n lộ ẫ ượng nh  dideoxynucleosid triphosphat v i 4 lo i desoxynucleosid triphosphatỏ ớ ạ  

r i ti n hành t ng h p DNA nh  DNA polymerase thì s  thu đồ ế ổ ợ ờ ẽ ược m t lo t các đo n DNAộ ạ ạ  

16

được k t thúc đ c hi u b i g c dideoxy nucleotit. Ti n hành 4 thí nghi m tách r i, m iế ặ ệ ở ố ế ệ ờ ỗ  

ph n  ng b  sung 1 lo i dideoxy nucleotit khác nhau s  thu đả ứ ổ ạ ẽ ược các đo n DNA có k t thúcạ ế  

b ng các dideoxy nucleotit khác nhau và h n kém nhau 1 nucleotit. Ch y đi n di các đo nằ ơ ạ ệ ạ  này r i hi n hình chúng, ta có th  xác đ nh trình t  c a chu i DNA quan tâm.ồ ệ ể ị ự ủ ỗ

17

2.6. K  thu t agroinoculationỹ ậ

K  thu t chuy n c u trúc xâm nhi m vào t  bào cây nh  vi khu n ỹ ậ ể ấ ễ ế ờ ẩ A.tumerfaciens được g iọ  

là agroinoculation. K  thu t agroinoculation đòi h i ph i thi t k  1 c u trúc xâm nhi m baoỹ ậ ỏ ả ế ế ấ ễ  

g m b  gen virus (ho c v  tinh) đồ ộ ặ ệ ược thi t k  ch a 2 ngu n g c tái sinh (ế ế ứ ồ ố ori)   2 đ u vàở ầ  

được n i vào 1 v  trí n m gi a b  trái và b  ph i c a 1 vector nh  nguyên. C u trúc xâmố ị ằ ữ ờ ờ ả ủ ị ấ  nhi m s  đễ ẽ ược bi n n p vào t  bào vi khu n  ế ạ ế ẩ A. tumerfaciens.  Khi lây nhi m, t  bào viễ ế  khu n s  ti p xúc v i t  bào cây ký ch  và các protein ch c năng (n m trên Ti plasmid) sẩ ẽ ế ớ ế ủ ứ ằ ẽ chuy n toàn b  ph n DNA n m gi a b  trái và b  ph i c a c u trúc xâm nhi m vào nhânể ộ ầ ằ ữ ờ ờ ả ủ ấ ễ  

t  bào cây ký ch  và t ng h p ph n DNA này vào b  gen t  bào cây ký ch  Trong t  bàoế ủ ổ ợ ầ ộ ế ủ ế  chuy n gen, gen Rep c a virus s  để ủ ẽ ược bi u hi n thành protein Rep. Protein Rep s  c t bể ệ ẽ ắ ộ gen virus kh i b  gen t  bào cây t i v  trí đ c hi u trên chu i ori và n i l i thành b  genỏ ộ ế ạ ị ặ ệ ỗ ố ạ ộ  virus nguyên v n. B  gen virus nguyên v n này s  th c hi n ch c năng sinh h c và gâyẹ ộ ẹ ẽ ự ệ ứ ọ  

b nh.ệ

A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti Plasmid  : a: T­DNA , b: Vir 

genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus

Có 3 k  thu t agroinoculation chính là: (i) ỹ ậ th m chân khôngấ  (lá cây được nhúng trong dung 

d ch vi khu n, đị ẩ ược x  lý chân không đ  hút khí trong gian bào; vi khu n s  d  dàng xâmử ể ẩ ẽ ễ  

nh p vào trong mô qua khí kh ng khi áp su t tr  l i bình thậ ổ ấ ở ạ ường); (ii)  tiêm tr c ti p  ự ế vi khu n vào mô; và (iii) ẩ tướ ựi tr c ti p d ch vi khu n vào đ tế ị ẩ ấ

2.7. K  thu t RCA (Rolling Circle Amplification)ỹ ậ

18

G n   đây,   m t   phầ ộ ương   pháp   nhân   b n   DNA   m i   dùng   k   thu t   RCA   (Rolling   Circleả ớ ỹ ậ  Amplification) đã đượ ử ục s  d ng đ  nhân các b  gen DNA d ng m ch vòng. K  thu t RCAể ộ ạ ạ ỹ ậ  dùng enzyme DNA polymerase c a th c khu n th   29, m t enzyme có ho t tính chuy nủ ự ẩ ể Φ ộ ạ ể  

m ch (strand­displacement) r t cao, và m i hexamer đ  nhân các phân t  DNA m ch vòngạ ấ ồ ể ử ạ  thành các multimer m ch th ng (g m nhi u b  gen virus liên ti p) (Hình 2.10) S n ph mạ ẳ ồ ề ộ ế ả ẩ  RCA s  đẽ ược c t b ng enzyme c t gi i h n thích h p và đắ ằ ắ ớ ạ ợ ược dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường. Đây là k  thu t hi n đang r t thông d ng trong nghiên c u các virusỹ ậ ệ ấ ụ ứ  

có b  gen DNA m ch vòng k  c  các begomovirus và v  tinh (ộ ạ ể ả ệ Inoue­Nagata và c ng s ,ộ ự  

2004; Haible và c ng s , 2006ộ ự ; Knierim và Maiss, 2007)

Hình 2.10. C  ch  tái b n các phân t  DNA m ch vòng b ng k  thu t RCA (Rolling Circleơ ế ả ử ạ ằ ỹ ậ  Amplification) dùng hexamer và  29 polymerase DNA (Φ Fujii và c ng s , 2006ộ ự )

K  thu t RCA đã đỹ ậ ượ ức  ng d ng đ  thi t k  các c u trúc xâm nhi m c a begomovirus.ụ ể ế ế ấ ễ ủ  

S n ph m RCA d ng multimers đả ẩ ạ ược c t đ n b ng enzyme c t gi i h n thích h p trongắ ơ ằ ắ ớ ạ ợ  

đi u ki n không tri t đ  đ  t o ra nhi u s n ph m monomer (1 b  gen), dimer (2 b  gen) vàề ệ ệ ể ể ạ ề ả ẩ ộ ộ  

19

multimer (nhi u b  gen). Ch  các s n ph m dimer đề ộ ỉ ả ẩ ược tinh chi t kh i gel agarose và n iế ỏ ố  vào vector nh  nguyên B ng cách đ n gi n này, các c u trúc xâm nhi m c a begomovirus cóị ằ ơ ả ấ ễ ủ  

th  để ượ ạc t o ra khá nhanh chóng (Inoue­Nagata và c ng s , 2004ộ ự ; Knierim và Maiss, 2007; 

Ferreira và c ng s , 2008ộ ự ; Wu và c ng s , 2008ộ ự ; Wyant và c ng s , 2011ộ ự )

20

III. V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

3.1.Đ a đi m, th i gian, đ i tị ể ờ ố ượng và v t li u nghiên c uậ ệ ứ

3.1.1.  Đ i tố ượng nghiên c uứ

B ng 3.1: Các ả begomovirus gây b nh xoăn vàng lá  t đệ ớ ược thu   mi n Trung Vi t Nam.ở ề ệ

Ký hi uệ Đ a đi m, khu v c thu m uị ể ự ẫ Đ iố  

tượng Tri u ch ngệ ứ

VNP624 Túy Loan – Đà N ngẵ ớt Begomovirus đi n hìnhể

21

VNP626 Túy Loan – Đà N ngẵ ớt Kh m vàngả

VNP628 Túy Loan – Đà N ngẵ ớt Begomovirus đi n hìnhể

VNP635 Đi n Bàn – Qu ng Namệ ả ớt Begomovirus nhẹ

22

VNP722 Vinh – Ngh  Anệ ớt Cu n lá ng nố ọ

VNP867 Túy Loan – Đà N ngẵ ớt Begomovirus nhẹ

23

VNP869 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Kh mả

24

VNP872 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Kh mả

25

VNP875 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Lá nhăn nh , giàỏ

26

VNP878 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Lá nhăn

27

VNP883 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Kh mả

28

VNP886 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Kh mả

29

VNP889 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Lá kh m, h i nhănả ơ

30

VNP892 Hòa Vang – Đà N ngẵ ớt Kh m , nhăn láả

VNP907 Túy Loan – Đà N ngẵ ớt Kh m vàng t  trong raả ừ

31

Ký hi uệ Đ a đi m, khu v c thu m uị ể ự ẫ Đ iố  

tượng Tri u ch ngệ ứ

VNP313 Châu Thành – An Giang ớt Kh mả

VNP319 Châu Thành – An Giang ớt Xoăn lá

33

VNP650 Phù Cát – Bình Đ nhị ớt begomovirus

VNP673 Châu Thành – An Giang ớt begomovirus

VNP675 Cao Lãnh – Đ ng Thápồ ớt begomovirus

35

VNP683 Thanh Bình – Đ ng Thápồ ớt begomovirus

VNP687 Thanh Bình – Đ ng Thápồ ớt Kh m vàngả

VNP701 Châu Thành – An Giang ớt Kh m vàngả

36

VNP826 Đan Dương – Lâm Đ ngồ ớt Kh m n ngả ặ

VNP827 Đan Dương – Lâm Đ ngồ ớt Kh m vàng, lá nhănả

VNP828 Đan Dương – Lâm Đ ngồ ớt Kh m vàng, lá nhả ỏ

38

VNP829 Đan Dương – Lâm Đ ngồ ớt Lá đ m,vàng rõố

VNP831 Đan Dương – Lâm Đ ngồ ớt Lá nhăn, vàng rõ

39

VNP855 Playku – Gia Lai ớt begomovirus

B ng 3.3: Các ả begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà chua đệ ược thu   mi n Trung Vi t Namở ề ệ

Ký hi uệ Đ a đi m, khu v c thu m uị ể ự ẫ Đ iố  

tượng

Tri u ch ngệ ứ

40