LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TÓM TẮT
2.3.1. Phân loại chi Begomovirus
2.3.2. Hình thái của Begomovirus
2.3.3. Cấu trúc genome của Begomovirus
2.3.3.1. Cấu trúc của phân tử DNA-A
2.3.3.2. Cấu trúc của phân tử DNA-B.
Hình 2.3: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus(Ha và cộng sự, 2008)
2.3.3.3. Đặc điểm của vùng IR
2.3.3.4. Cấu trúc của phân tửDNA-β.
Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử DNA-β
(http://wcrc.confex.com)
2.3.4. Tái sinh của Begomovirus
2.3.5. Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus
2.3.6. Triệu chứng bệnh
2.3.7. Lan truyền của Begomovirus
2.3.8. Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
2.3.9. Biện pháp phòng trừ
2.5. Kỹ thuật xác định trình tự
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
3.1.4.1. Chất kháng sinh
3.1.4.2. Cấu trúc xâm nhiễm
Các chủng vi khuẩn sử dụng
Chủng vi khuẩn A. Tumefaciens khả biến
Chủng vi khuẩn E. Coli khả biến
3.1.4.3. Thành phần cho phản ứng PCR, RCA, Điện di
BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*-3’
Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng
Bảng 3.5 : Các mồi đặc hiệu
3.2.1. Chiết DNA tổng số
+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium Bromide ) theo mô tả của Doyle & Doyle (1987), Wang et al., 1993 như sau:
Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol). Sau đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1. DNA tổng số được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn DNA 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn DNA trong không khí ít nhất 30 phút. Hoà cặn DNA trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô trùng, bảo quản DNA ở -200C.
3.2.2. Phản ứng RCA (rolling circle amplification )
Bảng 3.6.Thành phần của mỗi phản ứng PCR
Quy trình thực hiện phản ứng PCR
3.2.3.2. Điện di sản phẩm PCR.
3.2.4. Tinh chiết sản phẩm điện di
3.2.5. Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
Dephosphorylation vector pCAMBIA-2300 sau khi được mở vòng bằng BamHI
3.2.6. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến
3.2.7. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt
3.2.8. Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
3.2.9. Tinh chiết plasmid
3.2.10. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)
3.2.11. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens khả biến
3.2.12.Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
3.2.10. Đánh giá tính gây bệnh
Hình 4.1. Triệu chứng của begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng (mẫu VNP93)
Bảng 4.2: Các mẫu ớt ở miền Trung
Bảng 4.3: Các mẫu ớt ở miền Nam
Hình 4.3. Triệu chứng của begomovirus trên ớt tại Quảng Nam và Cần Thơ
Mục đích và phương pháp:
Bảng 4.4: kết quả chạy với các mồi đặc hiệu
Kích thước sản phẩm: 1,2kb
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra với mồi VNP93A và VNP93/97B
Hình 4.5: Kết quả điện di chạy PCR với mồi VNP93A
Hình 4.6: kết quả điện di chạy PCR với mồi VNP93/97B
Bảng 4.6: Các mẫu cà chua thu được ở miền Trung
Bảng 4.7: Các mẫu cà chua thu ở miền Nam
Phải có ảnh triệu chứng
Mục đích và phương pháp:
Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra các mẫu cà chua với các cặp mồi đặc hiệu
Hình 4.9.Sơ đồ vector pCAMBIA2300
Hình 4.10. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R
Hình 4.11: Điện di sản phẩm khi mở vòngpCAMBIA 2300 bằng BamHI
Bảng 4.10: kích thước sản phẩm thu được sau khi cắt
Hình 4.12: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng EcoRI
Hình 4.13: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng BamHI
Hình 4.14: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng PstI
Bảng4.10 : Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI
M VNP635(1) VNP635(2) VNP635(3) VNP698(1) VNP698(2) VNP698(4)
Hình 4.15: Điện di sản phẩm cắt một số clone thu được bằng BamHI
Bảng 4.11: Bảng các clone và mồi sequencing
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các môi trường
Phụ lục 2:Các dung dịch gốc và đệm
Phụ lục 3:Trình tự toàn bộ bộ gen của VNP93, VNP698, VNP842