báo cáo sắc ký lớp mỏng

Đây là một bài báo cáo chủ đề sắc kí lớp mỏng của bộ môn dược liệu 1. Toàn bộ bài báo cáo đã được hoàn chỉnh và công chiếu trên lớp học. Theo kết quả nhận xét của giảng viên bộ môn bài báo cáo này hoàn toàn đạt yêu cầu và được điểm 910.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC- ĐIỀU DƯỠNG

BÁO CÁO DƯỢC LIỆU 1

GVHD: THS ĐỖ VĂN MÃI

NHÓM 2 – LỚP ĐH DƯỢC 11C

NHÓM 2

WE ARE A FAMILY

Huỳnh Hữu Thước

Huỳnh Nguyễn Thanh Thuý

Dương Cẩm Tiên

Nguyễn Trọng Tính

Trần Quốc Toãn

Lê Đặng Quế Trân

Lê Hoàng Quế Trân Đoàn Thị Ngọc Trân

Lê Thị Thu Trang Nguyễn Huỳnh Linh Trang Nguyễn Thị Trang

Trần Thị Kiều Trang

Hà Ngọc Diễm Trinh

Lê Phú Trọng Bùi Công Trứ Bùi Trần Ngọc Trúc Trần Nhựt Trường

Nguyễn Anh Tuấn Trần Anh Tuấn

Lê Huỳnh Gia Tuệ

Lê Thị Kim Tuyến Nguyễn Lê Oanh Tuyền Nguyễn Phước Thanh Vy Nguyễn Thị Tường Vy Phù Thanh Thuý Vy Trần Nguyễn Thanh Vy Nguyễn Nhân Ý

Nguyễn quang huy Bùi vũ lam phương Ngô tuyết như

Trong chương 9: coumarin và dược liệu chứa coumarin đã học có bao nhiêu phương pháp định tính coumarin trong dược liệu?

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

NỘI DUNG:

KIẾN THỨC TỔNG QUÁT VỀ SKLM

CÁC BƯỚC CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI SKLM

TIẾN HÀNH SKLM

CÁC ỨNG DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA SKLM

CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP TRONG SKLM VÀ CÁCH KHẮC PHỤC

A

B C D E

I Phương pháp Sắc ký

1 Lịch sử phát hiện

Năm 1906, nhà thực vật dược người Nga Mikhail Tswett (1872-1919) đã phát minh ra sắc

ký khi dùng sắc ký cột với chất nhồi calci carbonat để tách các sắc tố thực vật clorophyl

I Phương pháp sắc ký:

2.Khái niệm phương pháp sắc ký:

Sắc ký là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn hợp dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha:

• Một pha không chuyển động (pha tĩnh)

• Một pha chuyển động (pha động) dịch chuyển qua pha tĩnh theo một phương xác định

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

I. Phương pháp sắc ký

2.Các yếu tố quan trọng trong hệ thống sắc ký:

Các cơ chế phân tách: phân bố, hấp thụ, rây phân tử, trao đổi ion, điện di, ái lực,…

Cơ chế phân bố và hấp thụ là 2 cơ chế được sử dụng chủ yếu hiện nay

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

Pha tĩnh Pha động

Cơ chế phân tách là một trong những yếu tố quan trọng nhất

 Pha tĩnh:Thông dụng nhất trong sắc ký hấp phụ hiện nay là Silica gel.

Chất lỏng được sử dụng làm pha tĩnh có thể là chất phân cực (phân bố pha thuận) hay không phân cực (phân bố pha đảo)

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

 Pha động: bản chất của pha động là quá trình phân tách của hệ sắc ký, pha động thường là một hệ dung môi gồm có hai (hay nhiều hơn) dung môi phối hợp với nhau theo những tỉ lệ thích hợp

Một pha động tốt là: có khả

năng phân tách tốt các chất nhưng không quá phức tạp về thành phần hay tỉ lệ, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện với môi trường.

3 Phân loại và gọi tên các phương pháp sắc kí

- Dựa vào phương cách lưu giữ pha tĩnh, người ta chia sắc ký thành 2 nhóm:

 Sắc ký cột: pha tĩnh được giữ trong ống nhỏ, pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực

 Sắc ký phẳng: pha tĩnh được cố dịnh trên mặt phẳng, pha động di chuyển qua mặt đó nhờ mao dãn hoặc tác động của trọng lực

- Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, người ta có: sắc ký phân bố, sắc ký hấ phụ, sắc ký tra đổi ion,…

- Dựa vào phương cách cho pha động chạy qua pha tĩnh, ta có: sắc ký rửa giải và sắc ký khai triển

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

Bình sắc ký Nắp đậy bình sắc ký

II Phương pháp SKLM:

1 Khái niệm:

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó:

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

- - - - - - -

Tấm lớp mỏng bằng plactic hoặc nhôm

Pha động (dung môi)

Pha tĩnh (chất hấp thu)

Mẫu cần phân tích

2 Pha tĩnh của TLC

Thường là các hạt có kích thước 10 – 30 µm được rải đều và kết thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250

µm trên giá đỡ

Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin

cellulose Phân bố Acid amin, carbohyrat, nucleotid

Alumina hấp thụ Alcaloid, lipid, chat màu thực phẩm

Cát biển Phân bố Đường, acid béo

Cellulose trao đổi ion Trao đổi ion Acid nucleid, ion kim loại, halogenid

Một số chất làm pha tĩnh cho TLC

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

3 Pha động của TLC

 Pha động cho TLC rất thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2

dung môi

 Một số gợi ý chung cho pha động:

 Dung môi cần có độ tinh khiết cao

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf trong khoảng 0,2 ÷ 0,8

 Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt nhất bằng dung môi phân cự như hỗn hợp n – butanol – nước

 Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ của chất phân tích và trị số Rf của chúng

A: TỔNG QUÁT VỀ SKLM:

B CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI SẮC KÝ LỚP MỎNG

1 Chuẩn bị ống vi quản

Vi quản là một ống thủy tinh, có đường kính trong nhỏ khoảng 2mm, 1 đầu được vót nhọn

1-1) Hai tay cầm vi quản hơ trên ngọn lửa đèn cồn, xoay tròn để

vi quản nóng chảy đều

2) Khi thấy ống vi quản vừa nóng chảy, đem ra khỏi ngọn lửa,

kéo 2 đầu ống dang ra, giữ yên cho đến khi ống cứng trở

lại

2.Chuẩn bị bản mỏng

 Chuẩn bị tấm bản mỏng:

 Có thể sử dụng tấm bản mỏng bán sẵn Với các tấm bản

mỏng thương mại khả năng tách chất rất tốt do chất hấp thu được phun bằng áp lực nên nó bám rất chặt trên bề mặt giá đỡ tạo thành lớp mỏng dày đều đặn (khoảng 0,3mm)

 Hiện nay, đa số sử dụng bản mỏng tráng sẵn (ví dụ như

bản silica gel F254 của Marck)

2.Chuẩn bị bản mỏng

Chuẩn bị bình triển khai bản mỏng

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu

Lưu ý: trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất

3.Chuẩn bị bình triên khai bản mỏng

 Mẫu là chất lỏng: chấm trực tiếp lên bản mỏng; mẫu không được quá sệt hay quá loãng.

 Mẫu là chất rắn: phải hòa tan hoàn toàn mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp (thường dùng benzene,

dichloromethan, chloroform, methanol), với nồng độ 2-5%

4 Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm)

 Chuẩn bị dung dịch mẫu

 Trước hết, phải xác định được rõ ràng đối tượng nghiên cứu là nhóm hợp chất gì.

 Với pha tĩnh dự kiến là silica gel, thì theo quy tắc để SKLM nhóm hợp chất kém phân cực sẽ dùng hệ dung môi

kém phân cực, nhóm phân cực sẽ dung hệ dung môi phân cực

5.Chuẩn bị hệ dung môi

VD: định tính tannin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Pha tĩnh: silica gel G

Pha động: toluen – CHCL3 – aceton (40:5:35)

 Khi được chọn, dung môi khai triển được pha với một

lượng đủ dùng, bảo quản kín ở một nhiệt độ cố định

để kết quả dễ lặp lại

 Khi đã rót dung môi vào bình sắc ký, đừng tái sử

dụng quá nhiều lần vì thành phần dễ bay hơi sẽ giảm

đi, làm thay đổi độ phân cực của dung môi

5.Chuẩn bị hệ dung môi

Bước 1 : Chấm mẫu thử lên bản mỏng

Đường kính từ 2-5mm

Các kỹ thuật triển khai bản mỏng

1- Triển khai để dung môi di chuyển lên: đây là kỹ thuật thường sử dụng trong sắc ký lớp mỏng

Bước 2 :Tiến hành khai triển sắc ký

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level

Fifth level

 Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên

bề mặt của lớp dung môi khai triển

 Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi

 Lưu ý: Không để vết mẫu thử và mẫu chuẩn ngập trong dung môi pha

động

 Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng đến vạch thẳng mép trên , lấy bản

mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi

 Làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng

Bình dung môi

Dung môi

2- Triển khai để dung môi di chuyển xuống:

3- Triển khai nhiều lần liên tiếp:

4-Triển khai hai chiều:

Chấm mẫu lên bản mỏng Bản được giải ly lần 1 với hệ

Bước 3 : Quan sát và hiện màu sắc ký đồ

Sau khi khai triển, có thể quan sát sắc đồ bằng mắt thường (nếu mẫu là chất có màu), phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu nên nếu muốn thấy cần sử dụng các phương pháp hóa học và vật lý

1- Phương pháp vật lý:

Có nhiều phương pháp nhưng thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại UV

Đèn chiếu tia UV 254 nm Ánh sáng này để nhận ra các

hợp chất có thể hấp thu tia UV Các hợp chất có màu tối sẵm

Đèn chiếu UV 365 nm Ánh sáng này dùng để phát hiện

những hợp chất có phát huỳnh quang Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bảng mỏng sẫm màu

2- Phương pháp hóa học:

Phương pháp hóa học là phương pháp phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản mỏng Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo

ra các dẫn xuất có màu

Thuốc thử Màu của vết Hợp chất

Hơi iod Vàng hoặc nâu Hợp chất hữu cơ nói chung

Hợp chất bất bão hòa.

2,7- Fluorescein Lục- vàng Đa số các hợp chất hữu cơ Ninhydrin Tím- hồng Aminoacid, amin.

2,4- dinitrophenylhydrazin Đỏ- cam Aldehyd, ceton.

Clorur antimony Màu đặc trưng Steroid, hợp chất chi hoàn.

3 Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng

 Phun xịt bản mỏng bằng bình phun xịt

Ưu điểm: thuốc thử được sử dụng với

lượng vừa đủ

Nhược điểm: thuốc thử không phun đều, chổ nhiều gây loang lỗ, chỗ ít không đủ làm xuất hiện vết

 Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử

Ưu điểm: dung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên

mặt bản

Nhược điểm: các chất mẫu nằm trên bản, khi gặp

một lượng lớn thuốc thử, chúng sẽ hòa tan luôn vào thuốc thử, có thể biến mất khỏi bản

Bước 4: Đánh giá

 Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng

như quy định trong chuyên luận riêng

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level

Fifth level

 a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính

bằng cm

 b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên

cùng đường đi của vết, tính bằng cm

 Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

Rf =

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa

khoảng dịch chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động:

b a

 Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn

hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn Hiện nay người ta

thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký

lớp mỏng hiệu năng cao (Planar chromatography – HPLC)

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level

Fifth level

Phân tích định tính

Phân tích định lượng

Trực tiếp trên bản mỏng

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc kí bằng dung mô thích hợp

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc kí bằng dung mô thích hợp

Phân tích các hợp chất hữu cơ

D ỨNG DỤNG & CÔNG DỤNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

Ứng dụng trong phân tích định tính

 Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc kí trong cùng điều kiện

 Đảm bảo hằng số vùng Rf để dễ nhận biết sắc đồ

Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc kí Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

 Densimeter: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang

 Xử lý ảnh vói camera kỹ thuật số: quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kĩ thuật số có độ

phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc kí bằng dung mô thích hợp: sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân

tích bằng một kỹ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang…) Phương pháp này hiện ít dung vì có nhiều trở ngại, tốn thời gian

Ứng dụng trong phân tích định lượng

Phân tích các hợp chất hữu cơ

• Tách và cô lập hợp chất: phenol, rượu, gluco, axit, amin, aminoaxit, các chất kháng sinh, protein, peptit, vitamin, thuốc

nhuộm…

• Phân tích các dược phẩm, y học

• Các mẫu thuộc linh vực hóa sinh: độc tố nấm, thực vật, tách chiếc mẫu thực vật, thuốc trừ sâu…

• Giám sát các phản ứng hữu cơ

Ngoài ra, còn một số ứng dụng khác:

 Tách các hạt chất từ một hỗn hợp

 Kiểm nghiệm dược liệu

 Theo dõi phản ứng, tối ưu hóa phản ứng

 Theo dõi quá trình sắc ký cột

Vết di chuyển không hoàn toàn

Nguyên nhân: Mẫu còn nhiều tạp phân cực

Cách khắc phục: Loại tạp kỹ hơn trước khi

chấm lên bản

E CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHẮC PHỤC

Vết hình móng ngựa

Nguyên nhân: Vết chấm hình tròn quá lớn

Cách khắc phục: Chấm nhỏ hơn với nồng độ

cao hơn hoặc chấm vạch

E CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHẮC PHỤC

Các vết lân cận trùng nhau

Nguyên nhân: Chấm các vết quá gần

Cách khắc phục: Chấm khoảng cách vết theo

đúng qui định

E CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHẮC PHỤC

Vết hình ngọn lửa nhiều đầu

Nguyên nhân: Chấm vết không trùng

Thanks you for attention