Bao cao sắc ký bảng mỏng tlc

Sắc ký là một phương pháp tách hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh thành các thành phần để phân tích, nhận biết, tinh chế hoặc định lượng hỗn hợp hay

KHOA HÓA HỌC ỨNG DỤNG

- -

BÁO CÁO THỰC HÀNH

HÓA PHÂN TÍCH 2

Người hướng dẫn:

Huỳnh Thị Hồng Hoa Sinh viên thực hiện: Nhóm 9

Nguyễn Minh Lưng Thạch Ngọc Sơn

Lê Tuấn Sang

Trà Vinh, 1 /6/2017

NHẬN XÉT

Trà Vinh, ngày 1 tháng 6 năm 2017

Người hướng dẫn

Huỳnh Thị Hồng Hoa

MỤC LỤC

SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ

SẮC KÝ LỚP MỎNG

SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ

1 Lịch sử hình thành sắc ký.

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll[2]

Chữ sắc trong sắc ký có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga,

và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc

Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố.[3]

Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau

2 Định nghĩa Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp tách hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh thành các thành phần để phân tích, nhận biết, tinh chế hoặc định lượng hỗn hợp hay các thành phần

+ Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu.(lớp chất cố định).Trì hoãn sự di chuyển các thành phần trong CPT tùy thuộc cấu trúc CPT

Giữ mạnh : ra trễ Giữ yếu : ra xớm + Pha động : những dung môi được đưa lên lien tục sau khi cho mẫu vào.pha động sẽ di chuyển trong cột do trọng lực và đem các cấu tử khác nhau theo chúng quá trình này gọi là sự rửa giải.nếu các thành phần này di chuyển với những tốc độ khác nhau thì chúng sẽ tách ra khỏi nhau và có thể thu hồi cùng với pha động

+ Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước + Hợp chất có ái lực nhiều với pha tỉnh thì bị giử lâu hơn trong cột và ra sau

3 Phân loại sắc ký :

Theo cơ chế của quá trình tách :

+ Sắc ký hấp phụ

+ Sắc ký phân bố

+ Sắc ký trao đổi ion

+ Sắc ký rây phân tử

4 Những kĩ thuật sắc ký phổ biến

Sắc lý lỏng (Liquid Chromatography-LC)

Sắc ký khí (Gas Chromatography- GC)

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC

Sắc ký giấy ( Paper Chromatography

Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

SẮC KÝ LỚP MỎNG (Thin layer chromatography)

1 Sơ lược về sắc ký

Phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được 2 nhà bác học Nga Izmailov và Shraiber

mô tả từ năm 1938 nhưng mãi đến 1958 - 1959 sau khi các công trình của E.Stahl được công bố thì nó mới được ứng dụng rộng rãi và ngày càng được cải tiến

2 Định Nghĩa

Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

Hình 1

3 Thành phần hệ thống sắc ký bản mỏng

Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 𝜇l dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha

tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Bảng 1

Hình 2 : Thành phần hệ thống sắc ký bản mỏng

4 Nguyên tắc hoạt động

Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất cần tách

Giọt dung dịch mẫu được nhỏ trên đường xuất , còn rìa bản được nhúng vào dung môi thích hợp

Dưới tác dụng của lực mao quản , dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và chuyển vận các cấu tử chủa hỗn hợp với các vận tốc khác nhau đưa đến việc tách các cấu tử

Sự khếch tán các cấu tử trong lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang vì vậy có thể xem quá trình sắc ký thực hiện theo 2 chiều

Hình 3: Nguyên tắc hoạt động

5 Quá trình chuẩn bị và cách tiến hành

a Quá trình chuẩn bị

* Bản mỏng sắc ký:

- Phải chuẩn bị một bản sắc ký bản mỏng tráng silicagel

Hình 4 :Bảng mỏng tráng silicagel

* Chuẩn bị Dung môi

Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 các dung môi Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ethet, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước

* Bình sắc ký

Có thể là bình chuyên dụng hoặc các lọ rộng miệng, ống hình trụ, có nắp

* Ống vi quản

Hình 5: Ống vi quản

Hai tay cầm ống thủy tinh hơ trên ngọn lửa xanh của đèn cồn vừa xoay tròn để

vi quản nóng đều

Khi vi quản vừa nóng chảy vừa đem vi quản ra khỏi lửa vừa kéo dài 2 đầu ống

ra xa khoảng từ 4 đến 5 cm rồi giữ yên cho thủy tinh đặc cứng trở lại

b.Cách tiến hành

* Chấm dung dịch lên bản mỏng

Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản mỏng 1 cm làm vạch xuất phát Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó Các vết phải cách nhau và cách mép bản mỏng ít nhất 1 cm

Hình 6 : Chấm dung dịch lên bản mỏng

* Khai triển sắc ký

Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi động nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng

ta lấy ra để khô hay sấy khô

Hình 7: Khai triển sắc ký

c Phát hiện các vết trên bản mỏng mắt thường không nhìn thấy :

*phương pháp vật lý:

Sử dụng đèn chiếu tia UV 254 nm : ánh sáng này dung để nhận ra các hợp chất

có thể hấp thụ tia uv.các hợp chất tạo thành vết có màu nâu sẩm

Đèn chiếu tia UV 366nm ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có tính huỳnh quanh các vết của chất mẫu có màu sáng nên nền bản mỏng sẩm màu

Hình 8: Sắc phổ quan sát trong ánh sáng thường và đèn UV

* Phương pháp hóa học

Ninhydrin (2,2-dihydroxyindane-1, 3-dion) là một hóa chất được sử dụng để

phát hiện amoni hoặc các amin bậc nhất và thứ cấp Khi phản ứng với các amin tự do này cho một màu xanh đậm hoặc tím được gọi là tím Ruhemann được sản xuất

Ninhydrin được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện dấu vân tay , vì các amin cuối cùng của dư lượng lysine trong các peptide và các protein bị đứt trong các dấu vân tay phản ứng với ninhydrin

Hình 9 : Phương pháp hóa học

d Đọc kết quả

Vị trí của vết là cơ sở để định tính một chất Trong SKLM, vị trí vết được biểu thụ bằng chỉ số Rf (retention factor-hệ số lưu giữ) Có thể nói, nếu trên sắc đồ có một vết chất chưa biết nằm ngang (có cùng chỉ số Rf) với vết của chất chuẩn thì chất chưa biết đó chính là chất chuẩn

Rf của chất X được tính như sau:Rf = x1/xo với 0 < Rf < 1

X1 X0

Hình 10

Ví dụ 1:

Hình 11:

Ví dụ 2:Tách chất màu thực vật trong lá xanh làm với các hệ dung môi khác nhau bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng?

Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm,

có nắp đậy kín Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi

để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và

để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng

Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60F 254 của hãng Merck được cắt bằng kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm và bản tự chế tạo từ tinh bột sắn dây kích thước 4 cm x 12 cm

Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới

dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2cm và cách

bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 -6mm và cách nhau 15mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng 1cm

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách.Tính Rf

Hình 12

6 Các hiện tượng thường gặp trong TLC

Hiện tượng Nguyên nhân Cách khắc phục

Vết di chuyển không

hoàn toàn

Mẩu còn nhiều tạp chất phân cực

Loại bỏ tạp chất trước khi tiến hành sắc ký

Vết trái dài không

ngăn cách

Chọn hệ dung môi chưa tốt

Thay đổi tỉ lệ dung môi cho phù hợp

Các vết lân cận trùng

nhau

Chấm các vết quá gần Chấm khoảng cách theo

quy định

Vết hình móng ngựa Vết chấm hình tròn quá

lớn

Chấm mẫu nhỏ lại

Vết loang Vết Khuếch tán do bay

hơi vì để lâu hoặc nhúng thử thuốc quá lâu

Vẽ ,chụp hình ngay sau khi hiện màu xong

Bảng 2

7 Ưu điểm và nhược điểm

a.Ưu điểm Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc

ký lớp mỏng Đơn giản Nhanh chóng, Không tốn kém

b.Nhược điểm:

Không chính xác để định lượng

Bảo vệ độ cứng của sắc ký đồ và khả năng lặp lại của hệ số Rf là rất khó

8 Tài liệu tham khảo

http://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFc_k%C3%AD_l%E1%BB%9Bp_ m%E1%BB%8Fng

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/HPTLC.htm

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/sac-ki-lop-mong.442928.html

HẾT