Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng để làm thức ăn chăn nuôi

Sử dụng công nghệ vi sinh làm thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ủ chua: Bã dong được ủ với chế phẩm sinh học trong đó bao gồm các khuẩn lactic có khả năng sinh cellulase, amylase, prote

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** -

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG BÃ DONG RIỀNG ĐỂ LÀM

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG BÃ DONG RIỀNG ĐỂ LÀM

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRẦN LIÊN HÀ

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng, hướng dẫn, truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cùng các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm vi sinh - hóa sinh - sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày 28 tháng 03 năm 2017

Nguyễn Thị Thu

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu nhóm nghiên cứu chúng tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Liên Hà trường Đại học Bách khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2017

Nguyễn Thị Thu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1 Tình hình sản xuất bột dong riềng và miến dong 3

2.Thực trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong 6

3.Khả năng tái sử dụng bã thải dong riềng 10

3.1 Thành phần bã thải 10

3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng 10

4 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 15

4.1 Enzyme cellulase 15

4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 18

5 Vi khuẩn lactic 19

5.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 19

5.2 Đặc điểm của vi khuẩn lactic 19

5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 21

5.3.1 Nguồn dinh dưỡng carbon 22

5.3.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ 22

5.3.3 Nguồn dinh dưỡng vitamin 22

5.3.4 Các hợp chất khoáng 23

5.3.5 Các hợp chất hữu cơ khác 23

5.4 Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 23

5.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 23

5.4.2 Ảnh hưởng của pH 24

5.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường 24

5.4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 24

5.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ oxy 25

6 Vai trò của vi khuẩn lactic trong thức ăn chăn nuôi 25

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 27

1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

1.2 Dụng cụ và hóa chất 27

1.3 Môi trường 27

2 Các phương pháp nghiên cứu 28

2.1 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật 28

2.2 Phương pháp tuyển chọn 28

2.2.1 Phương pháp tuyển chọn chủng sinh axit latic cao 28

2.2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng sinh enzyme cellulase cao 30

2.2.3 Phương pháp chọn chủng sinh bacteriocin cao 30

2.3 Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng được chọn 31

2.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng được chọn 31

2.3.2 Đặc tính sinh lý của chủng được chọn 31

2.4 Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử 31

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 31

2.4.2 Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 32

2.4.3 Phương pháp điện di gel agarose 33

2.4.4 Giải trình tự và so sánh với ngân hàng gen 33

3 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng 34

3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 34

3.2 Ảnh hưởng của pH 34

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường 34

3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 34

4 Động học sinh trưởng 35

5 Ứng dụng vi khuẩn trong ủ thức ăn chăn nuôi 35

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic 36

2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men tạo axit lactic cao nhất 38

2.1 Định tính axit lactic 38

2.2 Tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm 38

2 3 Tuyển chọn bằng phương pháp đục lỗ thạch 39

2.4 Tuyển chọn bằng phương pháp chuẩn độ NaOH 0,05N 40

3 Tuyển chọn chủng sinh enzyme cellulase cao nhất 41

3.1 Tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm 41

3.2 Tuyển chọn bằng phương pháp đục lỗ thạch 42

4 Tuyển chọn chủng dựa vào khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 43

5 Định tên vi khuẩn 46

5.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46

5.2 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử 47

5.2.1 Kết quả PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 47

5.2.2 Kết quả giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng gen 47

6 Khảo sát ảnh hưởng một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng G5 49

6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 49

6.2 Ảnh hưởng của pH 50

6.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường 51

6.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 52

6.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 53

7 Động học sinh trưởng 54

8 Ứng dụng vi khuẩn trong ủ thức ăn chăn nuôi 55

8.1 Kết quả ủ bã dong không thanh trùng 55

8.2 Kết quả ủ bã dong thanh trùng 58

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1 Kết luận 61

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc trưng nước thải tại một số làng nghề sản xuất tinh bột 7

Bảng 1.2 Chất lượng môi trường không khí tại một số làng nghề 8

Bảng 1.3 Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu 9

Bảng 1.4 Thành phần của bã dong 10

Bảng 1.5 Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu 13

Bảng 1.6 Tiêu chuẩn thức ăn chăn nuôi dạng thô 14

Bảng 3.1 Thống kê các chủng đã phân lập được từ các nguồn 37

Bảng 3.2 kết quả tuyển chọn 8 chủng vi khuẩn 41

Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase của các chủng giải theo phương pháp cấy chấm điểm và đục lỗ thạch 43

Bảng 3.4 Kết quả tuyển chọn dựa vào khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 44 Bảng 3.5 Bảng thể hiện đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng G5 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất tinh bột dong 5

Hình 1.2 Hiện trạng môi trường tại làng nghề sản xuất miến dong 6

Hình 1.3 Mô hình enzyme cellulase 16

Hình 1.4 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulose 16

Hình 1.5 Hình ảnh một số chủng vi khuẩn lactic 20

Hình 3.1 Thử Uffemann với các chủng được chọn 38

Hình 3.2 Các chủng được tuyển chọn theo phương pháp cấy chấm điểm 39

Hình 3.3 Các chủng được tuyển chọn theo phương pháp đục lỗ thạch 39

Hình 3.4 Hàm lượng axit tạo thành của 8 chủng 40

Hình 3.5 Hoạt tính cellulase của các chủng theo phương pháp cấy chấm điểm 42

Hình 3.6 Hoạt tính cellulase của các chủng theo phương pháp đục lỗ thạch 42

Hình 3.7 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin 45

Hình 3.8 Hình thái vi bào của chủng G5 46

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm sau PCR 47

Hình 3.10 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng G5 48

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng G5 49

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng G5 50

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng G5 51

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng G5 52

Hình 3.15 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng G5 53

Hình 3.16 Động học sinh trưởng 54

Hình 3.17 Hình ảnh sau khi ủ bã dong với chủng L casei G5 55

Hình 3.18 Hàm lượng đường sinh ra khi ủ BKTT với chủng G5 56

Hình 3.19 Hàm lượng axit sinh ra khi ủ BKTT với chủng G5 56

Hình 3.20 Hàm lượng đường sinh ra khi ủ BTT với chủng G5 58

Hình 3.21 Hàm lượng axit sinh ra khi ủ BTT với chủng G5 59

MỞ ĐẦU

Nước ta là một nước nông nghiệp, sản lượng phế phụ phẩm nông nghiệp tạo ra

từ ngành chế biến nông sản là vô cùng lớn, phong phú và đa dạng như: rơm, rạ, cây ngô, bã mía, bã dong riềng, bã sắn,

Việt Nam có khoảng hơn 2000 làng nghề truyền thống Trong đó, làng nghề chế biến tinh bột dong riềng và miến dong ngày càng phát triển mạnh mẽ giúp cải thiện đáng kể đời sống của nông dân Miến dong là sản phẩm được sản xuất từ tinh bột dong riềng và được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng cũng như mùi vị của nó Quá trình chế biến tinh bột dong từ củ dong riềng tạo ra một lượng bã thải lớn là bã dong Trung bình từ một tấn củ dong riềng, sau khi chế biến thu được 250 – 300 kg tinh bột ướt Tại một số làng nghề sản xuất lượng bã này được tận thu và tái sử dụng rất ít, còn lại xả thẳng ra môi trường mà không qua xử lý gây ô nhiễm môi trường, nguồn nước, ô nhiễm đất cũng như bầu không khí tại làng nghề Với thành phần chủ yếu là cellulose, bã dong có thể tận dụng làm nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế đồng thời giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Sử dụng công nghệ vi sinh làm thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ủ chua:

Bã dong được ủ với chế phẩm sinh học trong đó bao gồm các khuẩn lactic có khả năng sinh cellulase, amylase, protease, bacteriocin, … trong điều kiện lên men yếm khí tạo ra axit lactic làm pH giảm, kéo dài thời gian bảo quản Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn sinh bacteriocin ức chế toàn bộ sự phát triển của nấm mốc và các vi khuẩn gây bệnh, các vi sinh vật gây thối rữa Phương pháp này ngoài ưu điểm là tận dụng được lượng bã dư thừa, giảm chi phí thức ăn chăn nuôi thì nó giúp bảo quản

và chủ động lượng thức ăn trong mùa mưa lạnh, không đủ điều kiện phơi sấy rất nhanh bị mốc thối Thức ăn ủ chua thế này không bị tổn thất dinh dưỡng mà lại được bổ sung các vi sinh vật có lợi cho đường tiêu hóa, giúp gia súc ít bị bệnh hơn

Vì vậy tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng để làm thức ăn chăn nuôi”

Nội dung nghiên cứu gồm:

- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp cellulase

- Định tên chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp cellulase

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng

- Bước đầu ứng dụng ủ bã dong với chủng vi khuẩn

PHẦN I TỔNG QUAN

1 Tình hình sản xuất bột dong riềng và miến dong

Dong riềng còn được gọi là khoai riềng, khoai đao, khương nhu, củ tróc Là

loại cây thân thảo, thuộc chi ngải, loài Canna edulis, có nguồn gốc Nam Mỹ, có tên khoa học là Canna edulis Ker; là loại cây có giá trị kinh tế cao, có nhiều ứng dụng

như: củ luộc ăn, bột dong riềng làm miến, bánh đa Trên thế giới diện tích trồng dong riềng khoảng 300.000 ha trong đó Việt Nam trồng khoảng trên 30.000 ha và

có xu hướng tăng trong những năm tới Sản lượng hằng năm khoảng 300.000 tấn của tươi Dong riềng dễ trồng, dễ canh tác, có thể thích nghi với nhiều địa hình và điều kiện khí hậu khác nhau, đặc biệt là địa hình dốc núi cao, đất nghèo dinh dưỡng khoáng, hạn hán… Dong riềng mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn nhiều so với trồng lúa và các loại nông sản khác do chi phí đầu tư thấp, sản lượng và năng suất cao [13]

Ở nước ta, cây dong riềng được trồng ở hầu hết các tỉnh thuộc đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc Các tỉnh có diện tích và sản lượng dong riềng lớn phải kể đến là: Bắc Kạn, Sơn la, Cao Bằng, Hòa Bình, Thanh Hóa, Quảng Ninh, Tuyên Quang, Yên Bái,…[4]

Ở Việt Nam, nhiều làng nghề nổi tiếng với sản phẩm miến dong ở vùng núi phía bắc như: Đồng Hỷ-Thái Nguyên, Nguyên Bình-Cao Bằng, Na Rì-Bắc Kạn, Yên Sơn-Tuyên Quang, Yên Bái,… Năm 2013, diện tích trồng dong riềng trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn khoảng 2.899ha, tăng 56,87% so với năm 2012 [14] Mỗi năm tỉnh Bắc Kạn sản xuất được khoảng 180.000 tấn củ dong riềng, hầu hết được đưa vào để chế biến miến dong và tinh bột dong tại các làng nghề của tỉnh

Năm 2010, huyện Hoàng Su Phì-Hà Giang đã trồng được 130 ha cây dong riềng cao sản, năng suất bình quân đạt 50 tấn/ha, sản lượng đạt 6.500 tấn 1 ha dong riềng cho thu nhập khoảng 50 triệu đồng Năm 2011, huyện đã mở rộng vùng trồng dong riềng lên 1.000ha Bên cạnh đó, huyện đang xúc tiến xây dựng nhà máy chế biến tinh bột dong riềng nhằm thu mua toàn bộ sản phẩm cho người dân Việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong việc đưa những giống cây trồng mới cho năng

suất, hiệu quả cao như cây dong giềng tại huyện Hoàng Su Phì bước đầu đã thành công, mở ra hướng mới, giúp bà con các dân tộc có thu nhập cao, ổn định và bền vững

Năm 2011, Huyện Đà Bắc-Hòa Bình trồng được 817 ha dong riềng và diện tích ngày càng được mở rộng, trở thành một trong những loài cây mũi nhọn xóa đói, giảm nghèo ở huyện

Ngoài ra còn có một số làng nghề chế biến miến dong khác như: Tứ Hưng Yên; Quảng Ninh; Quảng Bình; Minh Hồng-Minh Quang-Ba Vì; Cát Quế-Dương Liễu-Hoài Đức,… Tại làng nghề Minh Hồng-Minh Quang-Ba Vì-Hà Nội với lợi thế diện tích đất đồi rộng lớn, gần chân núi Ba Vì nên cây dong riềng ở Minh Hồng phát triển rất tốt, tổng diện tích dong riềng ở đây là 250 ha, sản lượng bột thu được hàng năm khoảng 20.000 tấn [37].Với năng suất bình quân 70-80 tấn bột/ha Trong làng có tổng 164 hộ sản xuất tinh bột dong riềng và miến dong, với quy mô phân tán, nhỏ lẻ Mỗi vụ, làng sản xuất khoảng hơn 2300 tấn bột và 17000 tấn miến dong

Dân-Với lợi thế kinh tế mà cây dong riềng mang lại đã giúp nâng cao giá trị nông sản, xóa đói, giảm nghèo nâng cao đời sống của người dân

Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực đó, một vấn đề khó khăn và nan giải đối với các làng nghề này là chất lượng môi trường ngày càng tồi tệ do nước thải và

bã thải sau quá trình sản xuất thường được xả thẳng ra môi trường mà không qua xử

lý, vừa gây lãng phí, vừa gây ô nhiễm trên diện rộng, ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người

- Quy trình sản xuất tinh bột dong riềng

Hình 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất tinh bột dong [13]

Củ dong sau khi được rửa sạch bằng máy rửa cánh guồng đưa vào máy nghiền mịn để phá vỡ cấu trúc hạt tinh bột Bột nhào sau khi nghiền mịn được đưa sang máy công đoạn lọc tách bã bằng máy vắt ly tâm Phần tinh bột trong nước được đưa sang bể lắng, phần bã và xơ được tách và đưa ra máng xả riêng Sau 4-5 giờ ở bể lắng, tinh bột đen (tinh bột chưa được đánh trắng) được tách và rửa sạch Tinh bột đen sau đó được rửa sạch lần hai bằng máy khuấy cánh gạt giúp đánh tơi

và hòa tan tinh bột trong nước sau đó để lắng để tách riêng tinh bột Công đoạn cuối cùng là làm khô để thu tinh bột

Chất thải rắn từ quá trình sản xuất tinh bột bao gồm vỏ và bã dong chứa chủ yếu cellulose và lượng nhỏ tinh bột Trung bình cứ một tấn củ dong riềng sau khi chế biến thu được 250 – 300kg tinh bột ướt [13]

2 Thực trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong

Đặc thù của làng nghề chế biến nông sản là lượng bã thải và nước thải lớn nhưng hầu hết các làng nghề chế biến tinh bột dong riềng ở khắp nước ta đều chưa được xây dựng các mô hình và hệ thống xử lý nước thải, bã thải hoặc có nhưng chưa triệt để Hầu như toàn bộ khối lượng nước thải và bã thải đều được nông dân

xả thẳng ra môi trường xung quanh, do đó môi trường ở các làng nghề này và các vùng lân cận đều bị ô nhiễm nghiêm trọng

Hình 1.2 Hiện trạng môi trường tại làng nghề sản xuất miến dong

Hình 1.2 là hai ví dụ cụ thể về ô nhiễm nước thải và bã thải tại làng nghề Dương Liễu-Hoài Đức Do không đầu tư nhiều cho vấn đề môi trường, nước thải

được xả trực tiếp ra các kênh mương mà không qua xử lý nên gây ô nhiễm nghiêm trọng và ảnh hưởng đến sức khỏe của dân cư làng nghề và các vùng lân cận

Bảng 1.1 Đặc trưng nước thải tại một số làng nghề sản xuất tinh bột [2, 31] Chỉ tiêu Đơn vị

40:2011 cột B

Tân Hòa (Hà Nội)

Bình Minh (Đồng Nai)

Cát Quế (Hà Nội)

Thôn Đồng (Dương Liễu)

Đối với không khí tại các làng nghề chế biến nông sản thực phẩm nói chung

và các làng nghề sản xuất tinh bột và miến dong nói riêng, nguồn gây ô nhiễm điển hình nhất là từ các chất hữu cơ dạng rắn và chất hữu cơ tồn đọng trong nước thải bị

phân hủy yếm khí tạo ra các mùi hôi nồng nặc, khó chịu Các chất khí ô nhiễm chủ yếu gồm H2S, NH3 ảnh hưởng tới sức khỏe người dân trong khu vực và vùng lân cận

Bảng 1.2 Chất lượng môi trường không khí tại một số làng nghề [2]

tiêu

Dương Liễu (tháng 10-2002)

Tân Hòa (tháng 10-2002)

Yên Ninh (tháng 10-2002)

ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí ở làng nghề

Tại làng nghề Dương Liễu, mùa sản xuất chính kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 4 năm sau, trung bình mỗi ngày làng nghề thải ra hơn 500 tấn bã thải và

15000 m3 nước thải Trong số này, gần 300 tấn bã thải từ quá trình chế biến tinh bột sắn thô được tận dụng làm thức ăn gia súc Còn lại hơn 200 tấn bã thải từ quá trình chế biến tinh bột dong riềng không được thu gom, xử lý mà xả thẳng vào hệ thống thoát nước Nguyên liệu để sản xuất tinh bột là củ sắn và củ dong Lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất tăng 5 – 10% theo từng năm [31]

Bảng 1.3 Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu [31]

bã dong Do không có nơi tập kết nên các chủ hộ đành đổ xuống ao, kênh mương nên hầu hết các nguồn nước ở các làng nghề đều có các thông số ô nhiễm vượt mức cho phép nhiều lần

Ở Minh Hồng-Minh Quang-Ba Vì-Hà Nội, nơi đây có nghề mài bột và chế biến miến dong truyền thống Hầu hết các công đoạn trong quy trình sản xuất tinh bột dong và miến dong đều thải ra môi trường nước thải và bã thải Cứ 1 tấn củ dong nguyên liệu sau khi chế biến thu đươc 200kg tinh bột ướt Như vậy 80% phần bã được loại bỏ, chỉ thu được 20% tinh bột Chỉ số COD dao động từ 2550 – 6800 mg/l Chỉ số ô nhiễm này cao gấp hàng chục lần so với tiêu chuẩn cho phép Toàn

bộ lượng nước thải và bã thải từ tất cả các hộ gia đình mài bột trong thôn đều được

xả trực tiếp ra ngoài môi trường, mà không có bất cứ một biện pháp xử lý nào, gây

ô nhiễm môi trường trong thôn và các vùng lân cận Vào những tháng cao điểm trung bình mỗi hộ chế biến khoảng 4 tấn nguyên liệu/ngày thì cả làng sẽ thải ra khoảng trên 400 tấn bã và hàng nghìn m3 nước thải ra môi trường qua các mương,

cống chung của làng rồi đổ ra suối và sông Do xả nguồn nước bẩn này ra sông Đà nên con sông này cũng chịu ô nhiễm nặng Vào vụ chế biến chính thì những con mương có màu đen kịt, hôi thối

3 Khả năng tái sử dụng bã thải dong riềng

3.1 Thành phần bã thải

Quy trình sản xuất tinh bột dong riềng đã thải ra một lượng bã thải với khối lượng lớn gấp 7 - 8 lần so với củ tươi Từ một tấn củ dong sau khi qua quá trình mài dong chỉ thu được 190 – 200 kg tinh bột, phần lớn bã thải được loại bỏ Theo thống

kê, riêng tỉnh Bắc Kạn năm 2011 đã thu hoạch được 180.000 tấn củ dong riềng, lượng tinh bột sản xuất được là 25.000 tấn/năm [14] Theo Hoàng Toàn Thắng và cộng sự từ 5486,29 tấn củ ước tính lượng bã thải ra là 4115 tấn [14], có nghĩa là khoảng 80% bã bị loại ra Từ đó ta có thể thấy hằng năm lượng bã thải ra là rất lớn Tuy nhiên theo Đỗ Thị Quý, trung bình 1 tấn củ dong sau khi chế biến thu được 250 -300 kg tinh bột ướt, nghĩa là có khoảng 70-75% bã bị loại [13] Với đặc điểm bã thải chứa độ ẩm lên tới 80 -90%, trong 90% lignicellulose đó thì cellulose chiếm từ

35 – 50% Với thành phần chủ yếu là cellulose, bã dong có thể tận dụng làm nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế đồng thời giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường [14, 31]

3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng

Tuy lượng bã rắn từ sản xuất tinh bột dong riềng thải ra hàng năm rất lớn, xong mới chỉ một phần rất nhỏ, không đáng kể được tận dụng làm thức ăn gia súc,

trồng nấm hoặc làm phân bón phân bón Đa số lượng bã này được thải bỏ ra môi trường xung quanh: cống, mương, ao, sông hoặc đổ xuống ven đường làng, thậm chí đổ đống ngay trong vườn của các hộ làm nghề gây ô nhiễm và mất mỹ quan

Ở một số nơi như Hà Nội, Hưng Yên cũng đã triển khai một số mô hình tái sử dụng bã dong riềng làm thức ăn gia súc, làm phân bón hoặc làm than hữu cơ,… nhưng mới chỉ giải quyết được một phần rất nhỏ trong tổng số bã thải dong riềng Hiện nay, các nhà khoa học trong nước đang nỗ lực nghiên cứu tìm ra phương pháp hiệu quả để chế biến bã thải dong riềng thành các sản phẩm có giá trị khác

Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về tình trạng ô nhiễm ở các làng nghề và đưa ra những chiến lược để quản lý và giảm thiểu ô nhiễm Tuy nhiên, chưa

có một công bố nào về việc sản xuất ra các chế phẩm sinh học để xử lý triệt để sự ô nhiễm đã và đang xảy ra ở các làng nghề, đặc biệt là việc sản xuất các sản phẩm sinh học để xử lý và tận thu nguồn chất thải rắn ở các làng nghề sản xuất tinh bột dong còn rất hạn chế

Giải pháp tận thu chất thải từ bã dong:

a Tận thu bã thải làm chất đốt

Do lượng bã thải lớn, hàm lượng cellulose cao nên có thể áp dụng giải pháp đơn giản, không cần kỹ thuật cao mọi người dân đều có thể làm được, đó là mang phơi khô sau đó dùng làm chất đốt Tuy nhiên do đặc điểm của bã thải sau quá trình tách bột là chứa hàm lượng nước cao (90%) nên việc phơi khô mất khá nhiều thời gian và công sức Mặt khác nếu gặp phải trời mưa thì khó thực hiện và có nguy cơ gây ô nhiễm nhanh hơn Với giải pháp này đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thu hồi thấp

và giá trị gia tăng thu lại từ nguồn bã thải là không đáng kể

b Tận thu bã thải để trồng nấm

Với đặc điểm bã thải giàu cellulose và chứa một số chất dinh dưỡng thích hợp với nấm, như: tinh bột, protein, khoáng… có đặc điểm giống với nguồn cơ chất truyền thống đã được nuôi trồng nấm như rơm, mùn cưa, trấu… Nếu có thể dùng bã dong để nuôi trồng nấm thì giảm thiểu ô nhiễm môi trường do nấm phát triển làm cho bã dong không bị phân hủy hôi thối đồng thời mang lại hiệu quả kinh tế đáng

kể cho người dân làm nghề từ nấm Ngoài ra, bã dong sau khi trồng nấm hoàn toàn

có thể sử dụng để trồng cây nên có thể giải quyết được triệt để, không gây ô nhiễm môi trường, thu hiệu quả kép [31]

Nấm được trồng ở hơn 100 quốc gia và việc sản xuất nấm hàng năm trên thế giới đạt 5 triệu tấn và dự kiến đến năm 2016 đạt 7 triệu tấn [39] Tại Việt Nam nấm được xem là ngành hàng mang lại hiệu quả kinh tế cao thu hút sự tham gia của nhiều bà con nông dân Các loại nấm chính trồng ở Việt Nam là nấm sò, nấm rơm, nấm hương, nấm tai mèo và nấm linh chi

c Tận thu bã thải làm phân bón

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc tận dụng phế thải nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất phân bón phục vụ lại cho ngành sản xuất nông nghiệp

Bã dong được bổ sung thêm dinh dưỡng để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, đồng thời bổ sung chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật phân giải cellulose

để đẩy nhanh quá trình mùn hóa tạo thành phân Sau khi nguyên liệu mùn hóa hết tạo thành phân thì có thể phối trộn thêm NPK và các chủng vi sinh vật đặc hiệu để tạo thành phân hữu cơ vi sinh với chất lượng cao

Với dự án “Xây dựng mô hình xử lý chất thải từ quá trình chế biến tinh bột dong riềng làm thức ăn gia súc và phân bón hữu cơ tại tỉnh Bắc Kạn” của Viện Môi trường Nông Nghiệp đã xây dựng thành công mô hình sản xuất bã dong làm phân bón hữu cơ sinh học với quy mô 15 tấn bã thải/ngày Dự án đã hoàn thành quy trình sản xuất phân bón hữu cơ từ bã thải dong riềng tại xã Côn Minh với chất lượng phân bón đạt tiêu chuẩn cho phép Qua kết quả sản xuất thực tế cho thấy: Cây lúa được bón phân hữu cơ sinh học sản xuất từ bã dong riềng có thân cao hơn, số hạt chắc trên bông cao hơn so với lúa không bón phân hữu cơ Khi bón phân hữu cơ từ

bã thải dong riềng kết hợp với bón phân khoáng đã cho năng suất lúa xuân tăng từ 7,6 - 10,9% và năng suất lúa mùa tăng từ 15,6 - 21,8% so với canh tác truyền thống của nhân dân [38]

Năm 2016, chi cục PTNT Lào Cai phối hợp với UBND xã Bản Xèo – HTX Thành Sơn – Bát Xát tổ chức tập huấn kỹ thuật ủ phân hữu cơ vi sinh từ bã dong riềng bằng chế phẩm Emic cho bà con nông dân, dùng để bón vào đất làm tăng độ phì nhiêu, giảm ô nhiễm môi trường [40] Ở Điện Biên, người dân đã sử dụng bã dong riềng làm phân hữu cơ bón cho cây cà phê [41]

d Tận thu làm thức ăn chăn nuôi

Bảng 1.5 Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu [31]

Bã thải rắn

Bã thải rắn sử dụng (%)

Bã thải rắn không sử dụng (%)

Thức ăn chăn nuôi

Nhiên liệu

Phân bón

Tại làng nghề Dương Liễu bã thải từ sắn hầu như được sử dụng lại, trong khi

bã thải từ dong riềng không được tái sử dụng Để quản lý và xử lý lượng bã thải này sao cho tạo ra lợi ích kinh tế và giảm tác động của nó với môi trường xung quanh là một thách thức lớn đối với địa phương Vì vậy, sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả xử lý và hiệu quả kinh tế cao, giảm ô nhiễm môi trường Sau khi nghiền, lọc và tách tinh bột có thể thu được trên 800 kg bã/1 tấn nguyên liệu củ Bã dong có hàm lượng cellulose cao hợp với đặc điểm của thức ăn cho gia súc như: trâu, bò Tận dụng các thành phần dinh dưỡng trong bã dong làm thức ăn chăn nuôi đem lại hiệu quả kinh tế cao, giảm ô nhiễm môi trường, tránh lãng phí nguồn nguyên liệu dồi dào này

Đã có một số nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm thành công sử dụng bã dong làm thức ăn chăn nuôi Đề tài nghiên cứu cấp bộ: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn nuôi trâu, bò tại các làng nghề vùng núi Đông Bắc Việt Nam”, đã đưa ra được công thức ủ bã dong để bảo quản dự trữ bã dong làm thức ăn chăn nuôi trâu, bò và đưa ra khuyến cáo thử nghiệm ở địa bàn thí nghiệm chuồng trại và áp dụng trong chăn nuôi trâu bò Tuy nhiên các công thức ủ chủ yếu với

muối và ure hoặc có bổ sung thêm cám ngô và cám gạo, chưa sử dụng vi sinh vật vào các công thức ủ [14]

Bảng 1.6 Tiêu chuẩn thức ăn chăn nuôi dạng thô

Các chỉ tiêu PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Khoảng hàm lượng

thối Thức ăn ủ chua thế này không bị tổn thất dinh dưỡng lại được bổ sung các vi sinh vật có lợi cho đường tiêu hóa, giúp gia súc ít bị bệnh hơn

4 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

4.1 Enzyme cellulase

Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều enzyme khác nhau Cellulase là enzyme thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β - D – glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides

Có 3 loại enzyme cellulase chính:

 Endoglucanases (1,4-β– D – glucan – 4-glucanohydrolases) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside giữa mạch trong cellulose, lichenin và β– D - glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose

 Exoglucanases, gồm 2 loại là 1,4 –β-D-glucan glucanohydrolases (cellodextrinases) và 1,4 – β – D – glucan-cellobiohydrolases (cellobiohydrolases) Exoglucanases có hoạt tính thủy phân trên cả 2 đầu khử và không khử của mỗi đoạn cellodextrin Trong đó cellodextrinases tạo ra sản phẩm là glucose và cellobiohydrolases tạo ra sản phẩm chính là cellobiose

 β-glucosidases (β -glucoside glucohydrolases) có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và

có thể hoạt động ở nhiệt độ cao β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose

Enzyme thủy phân cellulose ở các sinh vật khác thì khác nhau, có thể có các loại enzyme khác nhau, bao gồm một hoặc nhiều enzyme cellobiohydrolase, enzyme Endo-β-1,4-cellulase và có thể có β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm cellobiohydrolase celulase, Endo-β-1,4-cellulase và β-glucosidase phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose Các enzyme exo-cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các đoạn ngắn oligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase [22]

Hình 1.3 Mô hình enzyme cellulase Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axitamin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm EG và cellobiohydrolase giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể

Hình 1.4 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulose

1

2

3

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng

Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như sau: đầu tiên Endo-β-1,4-cellulase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó cellobiohydrolase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của Endo-β-1,4-cellulase và cellobiohydrolase tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Các loài vi sinhvật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme,… một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase

Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm

enzyme Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase chủ yếu là phân giải carbohydrate thường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng [29] Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau [22,23] Trong số các vi sinh vật

sinh tổng hợp cellulase đáng chú ý nhất là vi khuẩn, Cellulomonas cytophaga (xạ

khuẩn) Hầu hết các loại nấm có thể sử dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [32], trong khi ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc điểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở

quy mô lớn Nấm Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất

cellulase ngoại bào Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung

vào các loài nấm (Trichoderma, Humicola, Penicilium, Aspergillus, Actinomucor),

vi khuẩn Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes và Streptomyces)

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [26] Mặc dù những loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng vi khuẩn lại

-có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên -có tiềm năng lớn để được dùng trong việc sản xuất cellulase Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm

Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài giống vi khuẩn như Cellulomonas,

Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được

nghiên cứu và báo cáo trên thế giới [26] Đặc biệt, với các chủng Bacillus được chú

ý hơn cả về khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như cellulase, amylase, protease và PGA có ứng dụng rất nhiều trong đời sống của con người

Howard và cộng sự đã chỉ ra rằng có nhiều chủng vi sinh vật thuộc chi

Baccillus đã được phân lập và định tên đến loài, bao gồm B subtilis, B macerans,

B licheniformis, B sphaericus [25] Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm

nghiên cứu và ứng dụng do vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn so với nấm mốc hay nấm sợi do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ rẻ hơn [20,28]

Đào Thị Lượng và công sự đã phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh

enzyme cellulase và định tên loài là Lactobacillus plantarum, Enterococus lactis

[10] Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose phân giải cellulose thành các phần tử nhỏ

hơn giúp động vật hấp thu tốt hơn

5 Vi khuẩn lactic

5.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Karl W Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua

Năm 1856, Louis Pasteur chứng minh được rằng sự hình thành axit lactic trong quá trình lên men sữa chua có liên quan đến một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi

là vi khuẩn lactic

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt

tên là Bacterium lactis (hiện nay là Streptococcus lactis) Từ đó đến nay các nhà

hóa học liên tiếp phân lập được các loại vi khuẩn khác nhau [3]

5.2 Đặc điểm của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là tên gọi chung của những vi khuẩn có khả năng sinh ra axit

lactic, thuộc họ Lactobacterium Đây là cầu khuẩn (lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu…),

trực khuẩn ngắn hoặc dài đứng đơn độc thành chuỗi nhưng đều là vi khuẩn gram dương, không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong

họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không chuyển động, hô hấp tùy tiện [13] Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng

không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ có loài L

delbrueckii có thể đồng hoá được tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự mặt của

pepton, axit amin, hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, axit amin và khoáng chất

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột Có thể phân biệt chúng dựa vào khả năng lên men đồng hình hay dị hình [9] Các loài vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành axit lactic trong môi trường và sức chịu axit cũng khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic tạo thành axit cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 – 4; cầu khuẩn không thể phát triển ở môi trường này, lên men tốt nhất ở vùng pH 5,5 – 6,0 [9]

Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: phân huỷ protein của sữa thành các peptid và axit amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit

Ngoài khả năng tạo thành axit lactic, các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin) như

Lactobacillus plantarum, Enterococcus lactis [10] Những chất kháng sinh này

được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành axit còn có 1 số loài tạo được chất thơm (diacetyl, acetoin, axit bay hơi )

Vi khuẩn Lactobacillus có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành axit lactic, axit acetic, các vitamin, axit amin, các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh khí như CO2

Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình que và hình cầu, kích thước của chúng phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy

Hình 1.5 Hình ảnh một số chủng vi khuẩn lactic

+ Dạng hình que có thể là ngắn gần như hình cầu, chiều dài khoảng 0,5 – 0,7μm và mọc thành sợi dài, đôi khi tới 8μm Chúng đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi

+ Dạng hình cầu còn có dạng ovan, đường kính 0,5 ÷ 0,6 tới 1μm, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi hay kết chuỗi Chuỗi có chiều dài khác nhau

Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến hình dạng tế bào Trong môi trường

có hàm lượng rượu cao sẽ làm cho tế bào dài ra Rượu etylic còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sinh trưởng của vi khuẩn Các tế bào vi khuẩn lactic không chuyển động, không tạo thành bào tử, gram (+), không tạo thành sắc tố, không khử nitrate thành nitrite, không có hoạt tính catalase

Vi khuẩn lactic sinh sản bằng cách phân chia tế bào cùng với cơ chất Tùy vào loại cơ chất, con đường chuyển hóa khác nên có sự sai lệch về thời gian sinh trưởng

và phát triển của chúng

Tế bào vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme catalase nhưng vì có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh và chính enzyme này đã phân giải H2O2 tạo thành H2O và O2 nên trong điều kiện kị khí chúng sinh trưởng và hoạt động mạnh, nhưng ở điều kiện hiếu khí chúng vẫn sống nhưng hoạt động kém Vì vậy vi khuẩn lactic được gọi là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện [3]

Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ chuyển hoá đường thành axit lactic, ngoài sản phẩm chính là axit lactic, quá trình lên men đường còn cho nhiều sản phẩm đường khác như: etanol, axit axetic, CO2,… Chính vì vậy, nhóm vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, sản xuất axit lactic và cả lactate Do các vi khuẩn khác nhau khi tham gia cơ chế khác nhau tạo ra các sản phẩm chính, phụ khác nhau nên chúng được chia làm 2 loại: đồng hình và dị hình [9]

5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Đa số các vi khuẩn lactic rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và đòi hỏi nguồn dinh dưỡng tổng hợp chứa hydratcarbon, axit amin, peptid, vitamin, khoáng,…Vì vậy, môi trường nuôi vi khuẩn lactic khá phức tạp Việc lựa

chọn chất dinh dưỡng phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng, từng loài và điều kiện nuôi cấy chúng [1]

5.3.1 Nguồn dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều nguồn carbon như: glucose, fructose, maltose, galactose, saccharose, lactose,… cho đến các polysacharit như tinh bột, dextrin Các nguồn carbon này dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào Chính vì vậy, nguồn carbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của

vi sinh vật

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau đòi hỏi nguồn carbon khác nhau Có loài

sử dụng nguồn carbon là các loại đường, có loài sử dụng nguồn carbon là tinh bột Trong quá trình lên men, khi không có mặt của các cơ chất carbon, vi khuẩn lactic sẽ sử dụng nguồn năng lượng từ các axit amin như glutamic, arginin, tyrozyl Khi đó sẽ xảy ra quá trình decarboxyl và tạo ra CO2 [1]

5.3.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Đa số các vi khuẩn lactic không thể tự tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số loài có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn vô cơ Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ sẵn có trong môi trường Nguồn nitơ thường là các axit amin Axit amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptid nhờ vào tác dụng của enzyme protease, peptidase ngoại hay nội bào Vi khuẩn cũng có thể đồng hoá các axit amin cần thiết cho sự phát triển của chúng từ nguồn nitơ phức tạp như dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt, pepton, trypton, casein,… [1] Đây cũng chính là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy

5.3.3 Nguồn dinh dưỡng vitamin

Vitamin đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, một vai trò không thể thay thế được Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamin Các vi khuẩn lactic khác nhau thì nhu cầu dinh dưỡng vitamin cũng khác nhau Tuy nhiên chúng đều cần vitamin nhóm B để phát triển Theo nghiên cứu cho thấy nhu cầu

vitamin của vi khuẩn lactic ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu, thế oxy hóa khử của môi trường, thành phần môi trường Điều này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các chất hữu cơ, dezoxyriboxit Vi khuẩn lactic sẽ không cần vitamin B12 nếu trong môi trường đã có dezoxyriboxit hoặc hoặc cần bổ sung axit aspactic khi vi khuẩn lactic sinh trưởng trong môi trường thiếu biotin [1]

5.3.4 Các hợp chất khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, kali, lưu huỳnh, mangan, magie, sắt, natri, đồng,…đặc biệt là mangan Mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào, nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn Vì vậy, trong môi trường nuôi cấu vi khuẩn lactic người ta thương bổ sung MnSO4 Đối với Lactobacillus thì

Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sản sinh ra axit lactic [1]

5.3.5 Các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các nguồn dinh dưỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng Axit hữu cơ như axit acetic và axit citric có tác động thuận lợi đến sự tốc độ phát triển của vi khuẩn lactic Đó là lý do trong môi trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn lactic thường có mặt của muối acetat và citrat [1]

5.4 Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

5.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các vi sinh vật khác, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt độ của vi khuẩn lactic khá rộng, một số loài

có thể phát triển được ở 55oC nhưng cũng có loài phát triển được ở 5oC Nhìn chung

đa số vi khuẩn lactic có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 15 – 40oC Tại điều kiện nhiệt độ thấp, màng sinh chất bị kết đông lại, enzyme ngừng hoạt động Nếu nhiệt độ tăng quá cao, vi sinh vật sẽ chết

5.4.2 Ảnh hưởng của pH

pH có ảnh hưởng rất lớn sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Thang

pH thay đổi từ 0 – 14 Mỗi vi sinh vật có một phạm vi pH nhất định và pH sinh trưởng, phát triển tốt nhất Vi sinh vật ưa axit phát triển tốt nhất ở pH 0 – 5,5; vi sinh vật trung tính phát triển tốt ở pH từ 5,5 – 8; vi sinh vật ưa kiềm phát triển ở pH 8,5 – 11,5 Mặc dù mỗi nhóm vi sinh vật phát triển ở khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của chúng có giới hạn nhất định Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương pháp thích nghi trong một giới hạn cho phép

Chẳng hạn như Lactobacillus có thể chịu được pH là 3,2 ÷ 3,5; Pediococcus có thể chịu được là 3,5 ÷ 4,0; Leuconostoc có thể chịu được pH 5 Nói chung quá trình lên

men sẽ dừng lại khi giá trị pH đạt 3,5 [3] Trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật sinh ra các chất có tính axit hoặc kiềm giúp trung hòa pH môi trường

Vi khuẩn lactic có thể phát triển được trong môi trường axit, khoảng pH của chúng có thể từ 4,5 – 8,5

5.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Trong điều kiện thí nghiệm, nguồn carbon được cho vào dưới dạng đường đơn Hàm lượng đường này nếu được đưa vào môi trường nuôi cấy với một lượng thích hợp thì sẽ giúp chủng nghiên cứu sinh trưởng và sinh tổng hợp tốt Ngược lại, lượng đường thấp thì không đủ nguồn carbon cung cấp cho vi sinh vật phát triển hoặc lượng đường quá cao sẽ tạo một áp lực thẩm thấu ra môi trường và làm ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của tế bào dẫn đến hiệu suất của quá trình không cao

5.4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống

Tỷ lệ cấp giống ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật Nếu tỷ lệ cấp giống ban đầu thích hợp sẽ giúp cho quá trình lên men và sinh tổng hợp axit lactic tốt hơn Nếu lượng giống ban đầu quá thấp so với lượng cơ chất có trong môi trường lên men thì quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic sẽ kéo dài thời gian lên men hoặc làm giảm hiệu quả tích lũy sản phẩm ngoại bào của

vi khuẩn Nếu tỷ lệ giống quá lớn sẽ gây lãng phí canh trường giống, hiệu suất sử dụng cơ chất không cao [36]

5.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ oxy

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có phản ứng khác nhau với nồng độ oxy của môi trường Đối với loài vi khuẩn lactic yếm khí tuỳ tiện chúng có thể sinh trưởng

được trong môi trường chứa oxy Ví dụ như Lactobacillus plantarum có thể đồng hoá được glycerin trong điều kiện hiếu khí Một số loài Lactobacillus như L brevis,

L buchneri cần oxy để oxy hoá hexose, gluconate Một số chủng khác lại cần oxy

cho sự tăng sinh khối Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzyme peroxydase có trong vi khuẩn lactic có thể thực hiện chức năng thay thế cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được sử dụng như chất nhận hydro

6 Vai trò của vi khuẩn lactic trong thức ăn chăn nuôi

Thức ăn thô xanh luôn có tầm quan trọng đặc biệt và không thể thay thế đối với gia súc ăn cỏ như trâu, bò, dê, cừu, thỏ, hươu, nai… Khả năng trồng cỏ còn nhiều hạn chế và phụ thuộc vào thời vụ nên vào mùa đông, khô hanh, cỏ kém phát triển, gia súc thiếu thức ăn, ảnh hưởng đến sức khỏe và năng suất của vật nuôi Do đó, việc bảo quản và dự trữ thức ăn thô xanh, tận dụng phế phụ phẩm trong trồng trọt làm thức ăn chăn nuôi là rất cần thiết Điều này vừa tránh lãng phí, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường Phương pháp đơn giản để giải quyết vấn đề này đó là phương pháp ủ chua

Về nguyên lý, theo Mc Donal (1981) [30], ủ chua là phương pháp sinh học, là quá trình phân giải đường dễ tan có sẵn trong nguyên liệu thức ăn (nhờ hệ vi sinh

vật sẵn có trong tự nhiên hoặc bổ sung) chủ yếu là vi khuẩn lactic như Lactobacillus

plantarum, Enterococcus lactis [10], Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus termofil, Streptococcus pyogenes, Streptococcus lactis, thành axit

lactic và các axit hữu cơ trong điều kiện yếm khí [6] Hàm lượng axit hữu cơ tăng, chủ yếu là axit lactic do quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật làm cho môi trường pH giảm kéo dài thời gian bảo quản Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn sinh bacteriocin ức chế toàn bộ sự phát triển của nấm mốc và các vi khuẩn gây bệnh, vi

sinh vật gây thối rữa [10]

Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic lên men biomass làm thức ăn

chăn nuôi như: vi khuẩn Lactobacillus plantarum lên men bã sắn làm thức ăn cho

gia súc [16], sử dụng thân cây đậu phộng (lạc) ủ chua với chế phẩm vi sinh làm thức

ăn cho bò [19], sử dụng vi sinh vật bản địa với muối và rỉ mật ủ chua với cỏ voi làm thức ăn cho gia súc [5], sử dụng thân cây chuối làm thức ăn cho dê [17], sử dụng rơm rạ, lá sắn, thân lá cây lạc ủ chua để làm thức ăn chăn nuôi [6]

Ưu điểm là thành phần nguyên liệu được bảo quản gần nguyên trạng, cải thiện chất lượng dinh dưỡng do hoạt động của vi sinh vật sản sinh ra, không có độc tố, mùi vị thơm ngon, hấp dẫn gia súc, giá thành chế biến thấp, dễ áp dụng với mọi quy mô chăn nuôi và thời gian bảo quản dài Đặc biệt, gia súc ăn thức ăn ủ chua rút ngắn quá trình lên men ở dạ cỏ

Như vậy, vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi:

 Axit lactic được tạo ra bởi vi khuẩn lactic, làm giảm pH của môi trường kéo dài thời gian bảo quản

 Vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme cellulase, amylase, protease, biến đổi chất xơ, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành axit lactic, các vitamin, axit amin, giúp động vật tiêu hóa tốt hơn

 Ngoài ra vi khuẩn lactic còn sinh bacteriocin ức chế toàn bộ sự phát triển của nấm mốc, các vi khuẩn gây bệnh, các vi khuẩn gây thối rữa Qua đó thời gian bảo quản của sản phẩm được lâu hơn

Chế biến thức ăn cho gia súc bằng phương pháp vi sinh khá đơn giản và dễ thực hiện Phương pháp ủ chua thức ăn giúp tận dụng được lượng phế phụ phẩm dư thừa, giảm chi phí thức ăn chăn nuôi, giúp bảo quan được lâu hơn Thức ăn ủ chua không bị tổn thất dinh dưỡng mà còn bổ sung các vi khuẩn có lợi cho đường tiêu hóa, giúp gia súc ít bị bệnh hơn Giảm tỷ lệ kháng sinh phải dùng, do đó tạo ra các sản phẩm sạch, không chứa dư lượng kháng sinh Ủ chua thức ăn không đòi hỏi đầu

tư thiết bị tốn kém, giúp nông dân tận dụng tối đa các phế phụ phẩm nông nghiệp, giảm chi phí thức ăn nên giá thành sản phẩm thấp, dễ áp dụng trong điều kiện chăn nuôi hộ gia đình cũng như trang trại chăn nuôi lớn

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thu thập các mẫu lên men như: dưa muối, cà muối, bã dong thôn Minh Hồng,…

1.2 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ, thiết bị

Các dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử, viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội Thiết bị bao gồm: Tủ cấy vô trùng (JSR, Hàn Quốc), tủ ấm (JSR, Hàn Quốc), tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật (Memmert, Đức), tủ lạnh thường (LG, Việt Nam), tủ lạnh sâu (Operon, Hàn Quốc), máy đo pH (METTLERTOLEDO, Thụy Sỹ), máy vortex (VELP, Đức), máy đo quang phổ (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech), máy ly tâm lạnh 13.000 vòng/phút (Hettich, Đức), cân kỹ thuật chính xác 0,01g (Ohaus, Thụy Sỹ), lò vi sóng ( SANYO, Việt Nam), tủ sấy dụng cụ (JSR, Hàn Quốc)

Hóa chất: Phenol 5%, phenolphtalein (Nga), FeCl3 (Nga)

Các hóa chất thông dụng: cao nấm men (Ấn Độ), đường glucose, agar (Việt Nam), NaCl, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3, NaOH, axit lactic, pepton (Trung Quốc), cao thịt (Trung Quốc), MnSO4.7H2O, CaCO3,…

1.3 Môi trường

Môi trường MRS (Man Rogosa Sharpe): Pepton (10g/l), cao nấm men (5g/l), cao thịt (5g/l), glucose (20g/l), amonicitrat (2g/l), CH3COONa (5g/l), K2HPO4 (2g/l), MgSO4.7H2O (0,1g/l), MnSO4.4H2O (0,05g/l), Agar (15g/l), pH 6,5

Môi trường CMC: (NH4 )2SO4 (1 g/l), K2HPO4(1 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l) NaCl (0,003 g/l), CMC (1 g/l), Agar (2 g/l) Điều chỉnh pH 7

Môi trường thử hoạt tính cellulase: CMC (1g/l), agar (2 g/l)

Môi trường NA: Pepton (5 g/l), cao thịt ( g/l), NaCl (5 g/l), Agar (20 g/l) Các môi trường được thanh trùng ở 110°C trong 30 phút

2 Các phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật

Phân lập theo phương pháp pha loãng mẫu trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 Dựa vào phản ứng giữa CaCO3 và axit lactic ta sẽ xác định được hoạt tính của chủng phân lập [10,11]

2.2 Phương pháp tuyển chọn

Chọn ra chủng có khả năng sinh axit lactic cao

Chọn ra chủng có khả năng sinh enzyme cellulase cao

Chọn ra chủng có khả năng sinh bacteriocin cao

2.2.1 Phương pháp tuyển chọn chủng sinh axit latic cao

a Phương pháp cấy chấm điểm

 Các chủng sau khi được phân lập và được chọn đem cấy chấm điểm trên môi trường MRS - CaCO3 agar, nuôi ở 37°C quan sát sự phát triển của các chủng sau 48 giờ

 Lựa chọn chủng có vòng phân giải CaCO3 cao nhất bằng xác định đường kính vòng phân giải D/d lần

c Phương pháp định tính axit lactic

Sử dụng phương pháp dung thuốc thử Uffelmann [9]

+ Nguyên tắc:

Uffelmann có công thức: [Fe(C6H5O)6]3- + 6H+ + 3Cl-

Phương trình hóa học thể hiện sự tương tác giữa axit lactic và Uffelmann:

6CH3-CH(OH)-COOH + [Fe(C6H5O)6]3+ + 6H+ + 3Cl-

(Màu tím đen)

6CH3-CH(OH)-COOC6H5+FeCl3 + 6H2O (Màu vàng)

+ Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường MRS dịch thể, cấp giống 10%, nuôi ở 37°C trong 48 giờ Sau

đó đem ly tâm loại sinh khối, thu dịch trong Hút dịch vào ống nghiệm, sau đó bổ

sung thêm Uffelmann rồi xem kết quả

Mẫu kiểm chứng: Sử dụng axit lactic tinh khiết và dịch Uffelmann làm kiểm chứng

d Phương pháp định lượng axit lactic

Phương pháp định lượng axit tổng sinh ra trong quá trình lên men bằng phương

pháp chuẩn độ NaOH [9,24]

+ Nguyên tắc: Dùng NaOH 0,05N chuẩn độ dịch lên men đã loại sinh khối với chất

chỉ thị màu phenolphthalein

+ Tiến hành:

Chủng được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể; pH 6,5; cấp giống 10% ở

37°C trong 48 giờ Dịch nuôi được ly tâm loại sinh khối, thu dịch trong

Lấy 500 µl dịch thể vào ống nghiệm, bổ sung 1 -2 giọt phenolphthalein

Chuẩn độ với NaOH 0,05N đến khi màu hồng nhạt xuất hiện thì dừng lại

Mẫu đối chứng là dịch môi trường giữ cùng điều kiện với dịch lên men

+ Tính kết quả:

Hàm lượng axit tổng ∑a (g/l) qui về axit lactic (xem như axit lactic là axit chủ yếu

tích lũy trong dịch lên men) là:

Trong đó :

V– số µl dung dịch NaOH dung trung hòa V1µl dịch lên men

V0– số µl dung dịch NaOH dung trung hòa V1µl dung dịch đối chứng

V1 – Vmẫu (µl)

0,05 – Đương lượng mol của NaOH

90 – khối lượng mol của axit lactic

2.2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng sinh enzyme cellulase cao [12]

a Phương pháp cấy chấm điểm

 Các chủng sau khi được chọn có khả năng sinh axit lactic cao sẽ được chọn đem cấy chấm điểm trên môi trường CMC - agar, nuôi ở 37°C quan sát sự phát triển của các chủng sau 48 giờ Sau đó nhỏ lugol so sánh kích thước vòng thủy phân

 Lựa chọn chủng có vòng thủy phân CMC cao nhất nhất bằng xác định đường kính vòng thủy phân D3/d3 lần

2.2.3 Phương pháp chọn chủng sinh bacteriocin cao

Vi khuẩn lactic được nuôi trong môi trường MRS lỏng trong 24h Chang chủng kiểm định trên môi trường NA rồi đục lỗ thạch đường kính 0,8cm Dịch nuôi lỏng chủng vi khuẩn lactic được đem ly tâm trong 15 phút ở 10000 vòng/phút, hút 100µl cho vào các giếng thạch rồi nuôi ở 37ºC trong 24h Dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định sẽ tạo vòng vô khuẩn (VVK) xung quanh khuẩn lạc So sánh đường kính vòng vô khuẩn (ĐKVVK) để chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn cao [7]