NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH ĐẠM SINH HỌC TỪ CÁC CHỦNG BRADYZHIZOBIUM SPP SỬ DỤNG CHO ĐẬU XANH

Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn cố định đạm và thực vật họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng xuất cây trồng và bền vững hệ sinh thái.Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG MÔN CÔN

NG NGHỆ

ẬN TỐ

ẤT CHẾ CHỦNG CHO ĐẬ

ÔNG NGH NGUYỄN T

009 - 2013

háng 6/201

ĐÀO TẠO ÀNH PHỐ

DỤC VÀ Đ LÂM THÀ

NG NGHỆ

ẬN TỐ

ẤT CHẾ CHỦNG CHO ĐẬ

háng 6/201

ĐÀO TẠO ÀNH PHỐ

hực hiện

THỊ DƯỢCC

Em xin cảm ơn KS Trần Thị Quỳnh Diệp, Thầy Cô và các Anh Chị đang công tác tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và hổ trợ về vật chất cũng như tinh thần cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn Cô chủ nhiệm Tô Thị Nhã Trầm, các bạn sinh viên lớp DH09SH, lớp DH09BVvà em Ngô Thị Lệ Trinh đã hết lòng giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Cuối cùng em xin tri ân công ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục Cha Mẹ luôn bên cạnh yêu thương, dạy bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể có được ngày hôm nay

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013 Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT

Tình trạng thoái hóa đất nông nghiệp đang diễn ra ngày càng nghiêm trọng do việc lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật Việc cộng sinh giữa vi khuẩn cố định đạm trong đất và thực vật họ đậu hàng năm đã cung cấp lại cho đất 200- 300 kg/ha , ước tính mỗi năm, trên toàn thế giới 70 triệu tấn nitơ được tạo ra từ quá trinh cố định đạm cộng sinh Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn cố định đạm và thực vật họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng xuất cây trồng

và bền vững hệ sinh thái.Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp ứng đủ đối với nhu cầu của cây Việc sản suất tạo chế phẩm đạm sinh học là vô cùng cần thiết cho nền nông nghiệp nước ta

Đề tài bao gồmcác thí nghiệm xác định chỉ số tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng

đến quá trình lên men Bradyrhizobium, thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh học từ các chủng Bradyrhizobium.Sử dụng 4 chủng Bradyrhizobium đã được xác định bằng

sinh hóa và phân tử từ trước, khảo sát các yếu tố: thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, nguồn cacbohydrate thích hợp, tỉ lệ nguồn cacbohydrate Khảo sát tỉ lệ than bùn:xơ dừa thích hợp làm chất mang tạo chế phẩm, khảo sát hoạt tính của chế phẩm lên cây đậu xanh trên mô hìnhbioassay, thử nghiệm hiệu quả chế phẩm trên cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm

Với những phương pháp trên đã xác định được cả 4 chủng vi khuẩn

Bradyrhizobium sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 35 - 37oC.Môi

trường rỉ đường 0,5% là thích hợp nuôi cấy 4 chủng Bradyrhizobium trong quy mô lớn

Thử nghiệm sản xuất thành công chế phẩm trên nền chất mang than bùn và xơ dừa với tỉ

lệ 3:1 Chế phẩm Bradyhizobium tác động tích cực đến sự hình thành nốt sần và cố định

đạm cung cấp cho cây đậu xanh cả trên mô hình bioassayvà ngoài vườn ươm

biofertilizers from biological nitrogen fixation Bradyhizobium strains used for vigna radiata" was carried out

The topic includes experiments to determine the optimal index of many factor

that effect on the fermentation ofBradyrhizobium, the biological production from Bradyrhizobiumstrains Using fourBradyrhizobium strains were identified by

biochemical and molecular earlier, survey indicators: time, temperature, carbon source suitable carbon source ratio Surveying appropriate rate of peatand coir to create the carrier for making biofertilizers, surveying the activity of preparations using bioassay, effective test of preparation on the field

These methods identified four Bradyrhizobium strains which grew and developed

in environmental temperature from 35 - 37oC Molasses 0,5% is appropriated to

culture 4 Bradyrhizobium strains in large-scale Producing and successful test

preparations based carrier peat: coir with a 3:1 ratio Biofertilizers from

Bradyrhizobiumpositive impact on the formation of nitrogen-fixing nodules and provide forvigna radiata both onbioassay model and on the field

Key word: Bradyrhizobium, vigna radiata,bio-fetilizer, nitrogen fixation

MỤC LỤC

Trang 

Lời cảm ơn i

Tóm tắc ii

summary iii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1Đặt vấn đề 1

1.2Yêu cầu của đề tài 2

1.3Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Giới thiệu cây đậu xanh 3

2.1.1Khóa phân loại 3

2.1.2Đặc điểm cây đậu xanh 3

2.1.3Đặc điểm nốt sần trên cây đậu xanh 3

2.2.Quá trình cố định nitơ 4

2.2.1Vai trò của nitơ đối với thực vật 4

2.2.2Chu trình nitơ trong tự nhiên 5

2.2.3Quá trình cố định nitơ 5

2.3.Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ 6

2.3.1Phân loại vi khuẩn cố định nitơ 6

2.3.2Đặc điểm chung của vi khuẩn cố định nitơ 6

2.3.3Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên 7

2.4.Sơ lược về vi khuẩn Bradyrhizobium 8

2.4.1Phân loại khoa học 8

2.4.2Đặc điểm của vi khuẩn Bradyrhizobium 8

2.4.3Cơ chế tạo thành nốt sần 9

2.5.Sơ lược về chất mang than bùn 10

2.5.1Các tính chất cần thiết của chất mang 10

2.5.2Sơ lược về than mùn 10

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2.Vật liệu nghiên cứu 13

3.2.1Đối tượng nghiện cứu 13

3.2.2Thiết bị và dụng cụ 13

3.2.3Hóa chất 13

3.3.Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men các chủng vi khuẩn 14

3.3.1.1Nguyên tắc đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count 14

3.3.1.2Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 15

3.3.1.3Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 15

3.3.1.4Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbohydrate 15

3.3.1.5Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy 16

3.3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng Bradyrhizobium 16

3.3.2.1Khảo sát tỉ lệ chất mang than bùn và xơ dừa 16

3.3.2.2Khảo sát mật số của các chủng Bradyrhizobium trong chất mang 17

3.3.2.3So sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh trên mô hình bioassay 18

3.3.2.4Đánh giá hiệu quả chế phẩm ngòai vườn ươm 18

3.4Xử lí số liệu 19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 20

4.1.1Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 20

4.1.2Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 21

4.1.3Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbonhydrate 22

4.1.4Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường 23

4.2.Tạo chế phẩm vi sinh vật từ các chủng vi khuẩn Bradyrhizobium 24

4.2.1Kết quả khảo sát tỉ lệ than bùn và xơ dừa 24

4.2.2Kết quả khảo sát mật số của các chủng vi khuẩn Bradyrhizobiumtrên chất mang 25

4.2.3.Kết quả so sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh trên mô hình bioassay 26 4.2.3.1 Kết quả theo dõi độ dài rễ cây đậu xanh trên mô hình bioassay 27

4.2.3.2 Kết quả theo dõi chiều cao cây trên mô hình bioassay 28

4.2.3.3 Kết quả theo dõi số lượng nốt sần trên mô hình bioassay 29

4.2.4Kết quả đánh giá hiệu quả của chế phẩm ngoài vườn ươm 31

4.2.4.1Kết quả khảo sát số lượng nốt sần của cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm 31

4.2.4.2 Kết quả khảo sát chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm 33

4.2.4.3 Kết quả khảo sát trọng lượng trái tươi và hạt đậu khô trồng ngoài vườn ươm 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1Kết luận 38

5.2Đề nghị 38

Tài liệu tham khảo 39 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

YMA Yeast Manitol Agar YMB Yeast Manitol Broth CFU Colony-forming unit( đơn vị hình thành khuẩn lạc)

ATP Adenosine Triphosphate STT Số thứ tự

NT Nghiệm thức

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu 13

Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sau 24, 36, 48 và 60 giờ lắc tăng sinh 20

Bảng 4.2Mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức tại những nhiệt độ khác nhau 21

Bảng 4.3Mật số vi khuẩn nuôi cấy trong các nguồn cacbohydrate khác nhau 22

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường rỉ đường 23

Bảng 4.5Mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức sau 15 ngày 24

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn trong chất mang 25

Bảng 4.7 Độ dài rễ qua các lần theo dõi trên bioassay 27

Bảng 4.8 Chiều cao cây sau các lần theo dõi trên bioassay 28

Bảng 4.9 Số lượng nốt sần sau các lần theo dõi trên bioassay 29

Bảng 4.10 Chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm theo thời gian 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây đậu xanh 3

Hình 2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên 5

Hình 2.3 Vi khuẩn Bradyrhizobium và nốt sần trên rễ cây họ đậu 8

Hình 2.4Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ Đậu 9

Hình 3.1Phương pháp Drop plate Count (đếm sóng nhỏ giọt) 14

Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Bradyrhizobium sau 24 giờ, 37oC trên môi trường YMA 21

Hình 4.2 Đậu xanh trồng trên mô hình bioassay 28

Hình 4.3 Nốt sần trên rễ cây đậu xanh trồng trên bioassay 30

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện số lượng nốt sần trên cây đậu xanh trồng ngoài vườn 31

Hình 4.5Nốt sần trên rễ cây đậu xanhtrồng ngoài vườn ươm sau 10 ngày gieo 32

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kích thước nốt sần trên rễ đậu xanh tại vườn ươm 32

Hình 4.7Chiều cao cây đậu xanh trồng ngoài vườn 34

Hình 4.8Biểu đồ biểu diễn trọng lượng trái tươi và hạt khô của đậu xanh 34

Hình 4.9 Hiệu suất thu hồi hạt khô của cây đậu xanh trồng ngoài vườn ươm 35

Hình 4.10Biểu đồ thể hiện trọng lượng trung bình 100 hạt của các nghiệm thức 35

Hình 4.11Biểu đồ thể hiệnkích thước đậu xanh trong từng nghiệm thức 36

Hình 4.12Sử dụng thước kẹp đo kích thước hạt đậu xanh 37

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay tình hình thoái hóa đất nông nghiệp và nguồn nước ngày càng nghiêm trọng do lạm dụng phân hóa học và thuốc bảo vệ thực vật Đặc biệt là sự lạm dụng quá mức phân đạm hóa học

Cây họ đậu có một khả năng đặc biệt là sản xuất ra nitơ cho chính bản thân nó thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi sinh vật đất hay vi khuẩn nốt sần Chủ

yếu là vi khuẩn thuộc các chi Rhizobium và Bradyrhizobium(M Becana, 1995) Chúng

có thể cố định được trung bình từ 200 - 300kg/ha (Peoplesvà ctv, 1995) Ước tính mỗi năm, trên toàn thế giới 70 triệu tấn nitơ được tạo ra từ quá trình cố định đạm cộng sinh (Brockwell và ctv, 1995) Quan hệ cộng sinh này có vai trò vô cùng quan trọng trong

ổn định chu trình dinh dưỡng nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cho cây trồng, ổn định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái (Balasundaran, 1996) Tuy nhiên, với số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp ứng đủ đối với nhu cầu của cây.Vì thế, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học phù hợp dùng để thay phân đạm hóa học, nâng cao hiệu quả sản xuất Ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất, việc sử dụng phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững

Mặc khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm khác nhau

và chuyên biệt đối với từng giống đậu khác nhau Vì vậy tuỳ từng loài đậu mà ta sử dụng các chủng vi khuẩn chuyên biệt được phân lập trên chính loài đậu đó

Trong các loại cây họ đậu thì cây đậu xanh có vai trò kinh tế cao, giúp cải tạo đất canh tác, thường được sử dụng thăm canh với các cây trồng khác ngoài ra đóng một vai trò quan trọng trong đời sống vừa là thức ăn trực tiếp của con người và động vật, cũng như một số chức năng chữa bệnh hữu hiệu mà nó mang lại

Trên cơ sở đó,đề tài: “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm cố định đạm sinh học từ

các chủng Bradyhizobiumspp sử dụng cho cây đậu xanh” được tiến hành

1.2 Yêu cầu của đề tài

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men của vi khuẩn

Bradyrhizobium

Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh từ các chủng Bradyrhizobiumtrên nền

chất mang than bùn và xơ dừa

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men của các chủng vi khuẩn

Bradyrhizobium như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, nguồn cacbohydrate và tỉ lệ

nguồn cacbohydrate thích hợp cho sự tăng sinh của các chủng vi khuẩn

Bradyrhizobium

Khảo sát tỉ lệ phối trộn than bùn và xơ dừa tạo chất mang thích hợp cho các

chủng vi khuẩn Bradyrhizobium Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh vật từ các chủng Bradyrhizobium Tiến hành khảo sát mật số vi khuẩn Bradyrhizobium có trong

chế phẩm trong thời gian 3 tháng.Sử dụng mô hình bioassay thử nghiệm, so sánh hiệu

lực của chế phẩm và dịch tăng sinh của các chủng vi khuẩn Bradyrhizobiumtương ứng

Thử nghiệm chế phẩm trên cây đậu xanh APN 208 ngoài vườn ươm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu cây đậu xanh

2.1.1 Khóa phân loại

Tên khoa học : Vigna radiate 

Tên đồng nghĩa: Phaeolus aureus Roxb. 

2.1.2 Đặc điểm cây đậu xanh

Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Thái Lan, Philippines, Indonesia, Myanmar, Bangladesh, Campuchia, Lào và Ấn Độ, mà còn ở các vùng nóng và khô của miền Nam châu Âu và Nam Mỹ Đậu xanh được sử dụng như một loại thực phẩm trong các món ăn mặn và ngọt

Đậu xanh thuộc loại cây thảo mọc đứng Lá mọc kép 3 chia, có lông hai mặt Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số lượng nhiều, có lông, trong chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng, có mầm

ở giữa hạt

Một đặc trưng nổi bật của cây đậu xanhlà các loại cây ký chủ cho nhiều loài vi khuẩn sống cộng sinh trên rễ của chúng Các loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ, có khả năng hấp thụ khí nitơ (N2 ) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng đạm hữu cơ mà cây có thể hấp thụ được như (NO 3 - hay NH3) Hoạt động này được gọi là cố định đạm Cây đậu với vai trò là cây chủ cung cấp đường, còn

vi khuẩn nốt rễ với vai trò là nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra một quan hệ cộng sinh 2.1.3 Đặc điểm nốt sần trên cây đậu xanh

Giai đoạn hình thành: ở đậu xanh nốt sần được hình thành và phát triển trong thời

kỳ cây con (từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 40 sau khi gieo hạt)

Hình 2.1: Cây đậu

xanh(Http://cropsdiversity.blogspot.com)

Ở những nốt sần trưởng thành, người ta có thể thấy rõ ba vùng sau đây:

Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm Những tế bào này thường có kích thước nhỏ hơn tế bào vỏ rễ Sau khi hình thành vỏ nốt sần phần vỏ rễ

sẽ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần

Vùng phân cắt mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâm nhiễm, nằm bên dưới lớp vỏ nốt sần Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hóa và tạo thành các tế bào vỏ nốt sần, các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn

Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn với các tế bào không chứa vi khuẩn Thể tích của mỗi tế bào chứa vi khuẩn có thể lớn đến gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn

Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần bắt đầu phát triển, một số tế bào nằm giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hóa và phân cắt thành các tế bào mạch dẫn của nốt sần Về sau các mạch dẫn này sẽ liên kết với hệ thống mạch dẫn của

rễ cây Số bó mạch trong mỗi nốt sần tùy loại cây mà thay đổi trong khoảng 1-12

2.2 Quá trình cố định nitơ

2.2.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất cây trồng Nitơ có trong thành phần của hầu hết các chất trong cây như protein, enzyme, acid nucleotic, diệp lục, các chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất điều hòa sinh trưởng Nitơ thường chiếm 1 - 5% khối lượng khô của thực vật Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nó ảnh hưởng đến cả sinh lý và năng suất của cây Cây thiếu nitơ các hoạt động sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, khả năng đẻ nhánh và phân cành kém, giảm khả năng quang hợp và tích lũy nên năng suất giảm Ngược lại nếu thừa nitơ và các điều kiện thuận lợi, protein được tổng hợp nhiều làm giảm sự tích lũy ở tế bào sinh dưỡng, tạo nhiều chất nguyên sinh, kết quả là cây mọng nước, thân lá vươn dài dễ gãy đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có thu hoạch

 

2.2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên

Hình 2.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên

(http://i408.photobucket.com/albums/pp166/mfwmlynk/chu-trinh-nito.jpg)

Chu trình nitơ trong tự nhiên có 2 giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ Giai

đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Bradyrhizobium và Rhizobiumsống cộng sinh trong rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Ở giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các

chủng vi khuẩn nitrat hóa nhưNitrosomomas và Nitrobacter để chuyển NH3 thành nitrat (NO3-) dạng thích hợp nhất để cây trồng hấp thu (B Carroll và D Salt, 2004)

Nitrogenase được sinh ra bởi vi khuẩn Azotobacter, một loài vi khuẩn cố định nitơ

sống tự do trong đất Nitrogenase bao gồm hai thành phần khác nhau, một thành phần gồm protein và Fe, một thành phần gồm protein, Fe, Mo Electron của các chất khử sẽ đi vào thành phần thứ nhất của nitrogenase, sau đó được chuyển sang thành phần thứ hai, qua đó electron được hoạt hóa Hydro được hoạt hóa nhờ các enzyme của hệ thống

hydrogenase Năng lượng dùng cho quá trình này là ATP của tế bào Cuối cùng NH3 được hình thành NH3 được hình thành đến mức độ nào đó sẽ kiềm hãm sự hoạt động của nitrogenase, nó chính là yếu tố điều hòa hoạt tính của enzyme (Bulen và LeComte, 1996)

Ở vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với cây họ đậu, cơ chế cố định nitơ có phần phức tạp hơn ở vi khuẩn cố định nitơ tự do vì nó liên quan đến thực vật Vai trò của thực vật ở đây chính là sự hình thành Leghemoglobin, chất này đóng vai trò chuỗi chuyền điện tử từ quá trình quang hợp của cây vào nitrogenase của vi khuẩn Enzyme nitrogenase của vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với cây đậu cũng có cấu trúc giống như nitrogenase của vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất (Lê Xuân Phương, 2005)

2.3 Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

2.3.1 Phân loại vi khuẩn cố định nitơ

Vi khuẩn cố định nitơ được chia làm 3 nhóm: vi khuẩn cố định nitơ sống tự do,

vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh và vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật

ký chủ Tuy nhiên, giữa nhóm vi khuẩn sống tự do và vi khuẩn cộng sinh vẫn chưa được mô tả rõ ràng nên một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm

Lớp : Alphaproteobacteria

Bộ : Rhizobiales

2.3.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn cố định nitơ

Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do là những vi khuẩn tương tác với thực vật để cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây nhất định mà theo hướng cộng sinh

chuyên biệt Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter, Psedomonas và Lostridium

Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh là những vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật kí chủ theo kiểu đôi bên cùng có lợi Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định

cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ cây họ đậu Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật được xem là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ đậu Ban đầu những vi khuẩn

thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ (Rhizobia) Ngày nay, những vi sinh

vật sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu được phân loại thành nhiều chi, trong đó hầu hết các

loài thuộc chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium và Sinorhizobium

Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao

đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật

Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả thực vật và vi khuẩn cố định nitơ

đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác

bắt buộc Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa quá trình

cố định nitơ cộng sinh và tự do.Vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi

khuẩn sống tự do trong vùng lân cận rễ cây đến những vi khuẩn sống nội sinh bên

trong mô tế bào thực vật Một số vi khuẩn tham gia cố định nitơ tương tác điển hình

như: Azosprium, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbaspirillum và

Klebsiella (Gnamanickam, 2006)

2.3.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên

Trong môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, từ phân tử dạng

khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động vật, thực vật và con

người Trong cơ thể sinh vật, nitơ tồn tại chủ yếu dưới dạng các hợp chất đạm hữu cơ

như protein, axit amin Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại ở

trong đất Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải

thành NH3 hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amon hóa Và quá trình này được gọi là sự

khoáng hóa chất hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng

Dạng NH4+ sẽ được chuyển thành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa Khí nitơ

sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hóa thành dạng

nitơ hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ Như vậy vòng tuần hoàn nitơ được khép kín

Trong hầu hết các khâu chuyển hóa của vòng tuần hoàn đều có sự hiện diện của của các

nhóm vi sinh vật khác nhau Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó bị ngừng lại, toàn bộ

sự chuyển hóa của vòng tuần hoàn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng

2.4 Sơ lược về vi khuẩn Bradyrhizobium

2.4.1 Phân loại khoa học

Một số loài đã được định danh:

B betae (2004, Rivas) ; B canariense (2005, Vinuesa ) ; B elkanii (1992, Kuykendall ) ; B iriomotense (2010, Islam) ; B japonicum (1896, Kirchner) ; B jicamae (2009, Ramírez-Bahena) ; B liaoningense(1995, Xu) ; B pachyrhizi (2009, Ramírez-Bahena) ; B yuanmingense (2002, Yao); B denitrificans (2006, van Berkum)

2.4.2 Đặc điểmcủa vi khuẩn Bradyrhizobium

Đặc điểm của chi Bradyrhizobium spp Là loài vi khuẩn đất Gram âm, có vai trò

quan trọng trong chu trình cố định Nitơ Là những loài mọc chậm, sản sinh chất kiềm Nuôi cấy trên môi trường YMA ở điều kiện nhiệt độ phòng, khuẩn lạc sẽ hình thành sau 3 - 5 ngày, có kích thước tế bào 0,3 - 1,2 x 2,2 - 3,2 μm, có từ 1 - 2 tiên mao, có

2.4.3 Cơ chế tạo thành nốt sần

Vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua lông hút đôi khi thông qua vết thương Một số cây họ đậu tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích thích những vi khuẩn tương ứng với mình phát triển mạnh hơn (để có thể nhiễm vào thực vật, vi khuẩn phải đạt mật số tế bào 104tế bào/g đất)

Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với lông hút của thực vật, tạo thành dãy xâm nhập đi dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu mô kích thích tế bào thực vật bị phân chia nhanh chóng thành tế bào mới Vi khuẩn đi vào tế bào chất và phân chia chuyển thành thể giả khuẩn Giả khuẩn không phân chia được nhưng phát triển mạnh tăng nhiều ribosome, nốt sần xuất hiện

Hình 2.4 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu

(Deakin và Broughton, 2009) Những cây đậu có đời sống 1 năm và lâu năm cũng có sự khác biệt về tính chất nốt sần Ở đậu phộng, đậu xanh nốt sần có khả năng cố định nitơ thường có màu hồng, kích thước lớn, thường nằm trên rễ chính trong khi nốt sần vô hiệu có màu lục, kích thước nhỏ thường nằm trên rễ phụ Tuy nhiên ở một số cây đậu lâu năm thì không theo quy luật đó Ví dụ như cây keo tai tượng dùng để trồng rừng, nốt sần hữu hiệu có cả ở

rễ phụ và không có màu hồng (Lê Xuân Phương,2005)

Nốt sần thích hợp ở các điều kiện: Độ ẩm của đất: 60 - 70%, độ thoáng khí: càng nhiều càng tốt, điều này cho thấy rễ càng sâu lượng nốt sần càng kém, pH thích hợp từ 4,6 - 8,0 Phân đạm thường ức chế tạo thành nốt sần, phân lân, kali có tác dụng tích cực, phân canxi, magiê và các muối khác cũng có tác dụng tốt đến quá trình tạothành nốt sần Chất dinh dưỡng cacbohydratenhư nước đường, rơm, rạ làm tăng khả năng xâm nhập và

khuẩn Bradyrhizobium Thường nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần rễ sâu rất ít

nốt sần Nguyên nhân là do tính hiếu khí của vi khuẩn, thiếu oxi sẽ làm giảm cường độ trao đổi năng lượng và khả năng xâm nhập vào rễ cây Nhiệt độ thích hợp nhất với hoạt động của vi khuẩn là 24oC, dưới 10oC nốt sần vẫn có thể hình thành nhưng hiệu quả cố định nitơ giảm Ở nhiệt độ 36oC cây đậu phát triển tốt nhưng cường độ cố định nitơ lại kém Giá trị pH cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần, có loại vi khuẩn chỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4; có loại vi khuẩn có khả năng hình thành nốt sần ở pH rộng hơn từ 4,6 đến 7,5 (Nguyễn Lân Dũng, 2003)

Tính đặc hiệu là một đặc điểm quan trọng trong quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây họ đậu Một loài vi khuẩn chỉ có khả năng cộng sinh với một hoặc vài loài đậu Cũng có một số loài vi khuẩn có khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu không đặc biệt với nó nhưng số lượng nốt sần ít và khả năng cố định nitơ kém Tuy nhiên đặc tính này giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại ở những nơi không có cậy đậu đặc biệt với nó Tính đặc hiệu giữa cây đậu và vi khuẩn được quyết định bởi hệ gene củachúng Bởi vậy người ta có thể cải biến tính đặc hiệu này bằng các tác nhân đột biến hoặc có thể dùng kỹ thuật di truyền để cải biến hệ gene quy định đặc hiệu cộng sinh (Lê Xuân Phương, 2001)

2.5 Sơ lược về chất mang than bùn

2.5.1 Các tính chất cần thiết của chất mang

Chất mang đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất chế phẩm trên nền cứng

Các tính chất của một chất mang tốt là:Bảo đảm cho Bradyrhizobium sinh trưởng và

tồn tại, có khả năng hấp thu ẩm tốt, dễ dàng sản xuất, khử trùng bởi autoclave hoặc là chiếu xạ gramma 19 Sẵn có với số lượng đủ giá thành thấp, khả năng bám dính tốt vào hạt và khả năng đệm pH tốt

Than mùn được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất như là chất mang cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần Hầu hết chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sản xuất trên nền chất mang than bùn sau khi đã được xây nhuyễn và trung hoà pH

2.5.2 Sơ lược về than mùn

Than mùn là một loại mùn mà ở đó các vật thể hữu cơ đã bị phân giải nhưng chưa hết, môi trường thường chứa nước, đồng thời môi trường đất thường rất chua, rất nghèo Ca2+ và Mg2+ làm cho các vật thể hữu cơ biến đổi không hoàn toàn, có màu đen,

D

Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ lượng than bùn có khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1,5% diện tích bề mặt quả đất Than bùn được hình thành do

sự tích tụ và phân huỷ không hoàn toàn tàn dư thực vật trong điều kiện yếm khí xảy ra liên tục.Quá trình này diễn ra tại các vùng trũng ngập nước Các vùngđất ngập nướclà những vùng có năng suất sinh học cao, điều kiện phát triển của thực vật rất thuận lợi Tuy nhiên, lớpthổ nhưỡngtại các vùng này luôn trong điều kiện yếm khí.Do đó, mặc

dù sinh khối các loài cỏ sống trên mặt nước tăng nhanh, nhưng quá trình phân giải xác thực vật lại xảy ra chậm và không đạt tới giai đoạn vô cơ hoá dẫn đến tích luỹ hữu cơ Tiếp theo cỏ là lau, lách, cây bụi, cây thân gỗ thay thế, kết hợp với quá trình kiến tạo địa chất, quá trình bồi tụ, lắng đọng phù sa đã chôn vùi kể cả cây thân gỗ, làm cho hữu

cơ tích tụ thành các lớp và tạo thành than bùn.Hàm lượng các chất dinh dưỡng trong than bùn thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần các loài thực vật và quá trình phân huỷ các chất hữu cơ

Than bùn đã qua sàng và nghiền phân loại, đáp ứng cho tiêu chuẩn sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh với các tiêu chuẩn như sau:

Than bùn loại 1: hàm lượng hữu cơ từ 30%đến35%, có màu đen than, độ mịn qua sàng là 3,5mm, độ ẩm từ 20% đến30%.Than bùn loại 2: hàm lượng hữu cơ từ 17% đến25%, có màu đen nhạt lẫn nâu, độ mịn qua sàng là 3,5mm, độ ẩm từ 20% đến 30%.Than bùn loại 3: hàm lượng hữu cơ nhỏ hơn 16%, có màu nâu đen, độ mịn qua sàng là 5mm, độ ẩm từ 20% đến 35%

Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Bradyrhizobium thì được bảo vệ và tồn tại tốt

trên than bùn Tuy nhiên, tính chất lý hoá học của than bùn không phải là chỉ tiêu duy nhất để xác định chúng có phù hợp cho sản xuất hay không Ngoài các tính chất của than bùn như là độ mặn, sét, lượng hữu cơ và sự tạp nhiễm bới các kim loại thì còn có các yếu tố không xác định được ảnh hưởng đến sự phù hợp của than bùn như là một chất mang Than bùn từ các nguồn khác nhau cần thiết phải kiểm tra sau khi đưa về cùng kích thước hạt và ẩm độ (nếu có thể)

Than bùn có hợp chất bitumic rất khó phân giải Nếu bón trực tiếp cho cây không những không có tác dụng tốt mà còn làm giảm năng suất cây trồng Vì vậy, than bùn muốn dùng làm phân bón phải khử hết bitumic.Có thể dùng tác động của nhiệt để khử bitumic trong than bùn hoặc phơi nắng một thời gian để oxy hoá bitumic hoặc đun

có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây Hàm lượng đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 - 7 lần, nhưng chủ yếu ở dưới dạng hữu cơ Các chất đạm này cần được phân huỷ thành đạm vô cơ cây mới sử dụng được

pH chất mang rất quan trọng và tính acid của than bùncần được trung hoà với calcium hay magnesium carbonate pH thích hợp là 6,8-7,0 Vôi mịn dùng trong nông nghiệp thì thích hợp cho việc trung hoà than bùn.Điều chỉnh pH của than bùn cần phải thực hiện thật cẩn thận, chờ thời gian cân bằng Phảnứng giữa vôi và H+ trong than bùn phụ thuộc kích thước của cả vôi và than bùn Hạtcàng nhỏ thì phản ứng càng nhanh Số lượngvôi để trung hoà cũng phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ, sét và khả năng đệm của thanbùn Sau khi trộn lẫn than bùn và vôi thì cần thiết cho phép phản ứng xảy ra trong vàituần trước khi đo pH Cũng cần thiết đo pH theo thời gian Vôi mịn dùng trong nôngnghiệp (Aglime, calcium carbonate qua rây 150 μm mesh) là vôi tốt nhất sử dụng đểtrung hoà than bùn Vôi xây dựng thì quá mạnh còn các vôi khác thì lại nhẹ

Ẩm độ của than bùn cũng quan trọng Ẩm độ 40 đến 50% thì thuận lợi nhất cho sự

tăng trưởng và tồn tại của nhiều chủngBradyrhizobium Cải thiện ẩm độ than bùn hoặc là

hỗn hợp của than bùn và các chất mangkhác thì cần chú ý Trước khi trộn than bùn với dịch sinh khối, than bùn cần được khửtrùng ở ẩm độ 20% (Trần Thị Yến Thảo, 2010)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013 Tại viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống đậu xanh APN 208 của Công ty TNHH An Phú Nông

4 chủng vi khuẩn cố định đạm chi Bradyrhizobium đã được xác định bằng sinh

hóa và phân tử từ trước và được kí hiệu trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa chỉ thu thập mẫu

Hóa chất dùng để nuôi cấy vi khuẩn: môi trường YMA,môi trường YMB,

Ethanol 96o, Ethanol 70o, rỉ đường, glucose, saccharose

Hóa chất dùng để nhuộm rễ đậu xanh: dung dịch axit Fuchsin, dung dịch

Glycerol làm chua bằng axit HCl, axit acetic 1% Nước tẩy Javen. 

Hóa chất dùng làm chất mang: than bùn, xơ dừa, rỉ đường,calcium carbonate

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men các chủng vi khuẩn

Công thức tính số lượng vi khuẩn trong 1 ml dịch mẫu ở một độ pha loãng:

A(cfu/ml) = a x B x h Trong đó :

a = ∑ : số khuẩn lạc trung bình có trên một hàng ngang ở một độ pha loãng

ai: tổng số khuẩn lạc trên một hàng ngang ở một độ pha loãng

n: số lần lặp lại cho mỗi độ pha loãng

h: hệ số pha loãng

B= : hệ số thể tích quy ra 1 ml

Tính số lượng vi khuẩn trong 1 ml dịch mẫu nguyên: lấy trung bình của số lượng

vi sinh vật có trong 1 ml dịch mẫu ở n độ pha loãng khác nhau (A1, A2, A3)

Atb =

Ưu điểm: Dễ thực hiện, chính xác và nhanh chóng

Hình 3.1 Phương pháp Drop plate Count

Cùng độ pha loãng

10-(n-1)

10-(n-2)

10-n

3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng nhân sinh khối của

các chủng Bradyrhizobium

Thí nghiệm 3.3.1.2 thực nhằm xác định thời gian nuôi cấy cho mật số vi khuẩn cao

nhất của các chủng Bradyrhizobium Tạo cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo

Các chủng vi khuẩn ban đầu được cấy phục hồi trên môi trường YMA ủ ở 37oC Sau 24 gờ dùng tăm bông vô trùng lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường YMB, lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ 37oC Sử dụng phương pháp Drop plate Count xác định mật số vi khuẩn sau các khoảng thời gian 24 giờ, 36 giờ, 48

giờ và 60 giờ sau cấy

3.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân sinh khối của

các chủng Bradyrhizobium

Thí nghiệm tiến hành nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cho mật số vi khuẩn cao nhất tại thời gian thích hợp đã xác định tại thí nghiệm 3.3.1.2

Các chủng vi khuẩn ban đầu được cấy phục hồi trên môi trường YMA ủ ở

37oC.Sau 24 giờ dùng tăm bông vô trùng lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường YMB lắc 120 vòng/phút, trong các điều kiện nhiệt độ

33oC; 35oC; 37oC;39oC Sử dụng phương phápDrop plate Count xác định mật số vi khuẩn tại thời gian cho mật số vi khuẩn cao nhất đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.2

3.3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbohydrate lên khả năng nhân sinh

khối của các chủng Bradyrhizobium

Thí nghiệm tiến hành nhằm xác định nguồn cacbohydrate mới vừa đảm bảo cho

các chủng Bradyrhizobium sinh trưởng vừa rẻ tiền, thay thế manitol trong môi trường

YMB dùng trong lên men công nghiệp

Các chủng vi khuẩn ban đầu được nuôi cấy phục hồitrên môi trường YMA ủ ở

37oC.Sau 24 giờ dùng tăm bông vô trùng lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường YMB và môi trường YMB đã thay thế manitol bởi các nguồn cacbohydrate như glucose, saccharose, rỉ đường lắc 120 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp đã được xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.2 và mục 3.3.1.3 Sử dụng phương pháp Drop plate Count xác định mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức

3.3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy

lên khả năng nhân sinh khối của các chủng Bradyrhizobium

Thí nghiệm tiến hành nhằm xác định tỉ lệ cacbohydrate thấp nhất cho mật số vi khuẩn cao nhất, sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn ở quy mô công nghiệp

Các chủng vi khuẩn ban đầu được cấy phục hồitrên môi trường YMA ủ ở 37oC sau 24 giờ dùng tăm bông vô trùng lấy 1 khuẩn lạc đơn cấy vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường với nguồn cacbohydrate thích hợp đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.4với tỉ lệ cacbohydrate thay đổi là 0,5%; 1%; 1,5%; 2% lắc 120 vòng/phút, trong các điều kiện thời gian và nhiệt độ đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.2 và mục 3.3.1.3 Xác định mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức bằng phương phápDrop plate Count

3.3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng Bradyrhizobium sử

dụng chất mang than bùn - xơ dừa

3.3.2.1 Khảo sát tỉ lệ chất mang than bùn và xơ dừa thích hợp cho các chủng vi

khuẩnBradyrhizobium

Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức (NT) với NT1: vi khuẩn với chất mang than bùn, NT2: vi khuẩn với chất mang than bùn:xơ dừa với tỉ lệ 3:1, NT3:

vi khuẩn với chất mang than bùn: xơ dừa với tỉ lệ 1:1

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Quy trình kỹ thuật:

Chuẩn bị chất mang: Nghiền mịn than và bụi xơ dừa phơi khô, rây qua rây 1mm2 Trộn than bùn và xơ dừa theo tỉ lệ của từng nghiệm thức Xác định pH, ẩm độ của chất mang.Dùng calcium cacbonatetrung hòa pH chất mang từ 6,8-7, đều chỉnh ẩm độ chất mang về 20% Khử trùng chất mang ở 121oC/30 phút

Chuẩn bị dịch khuẩn: Nuôi cấy tăng sinh dịch khuẩn trong bình tam giác 250ml

có chứa 50ml môi trường YMB tại nhiệt độ và thời gian đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.2 và mục 3.3.1.3

Tiến hành: Dịch sinh khối sau khi nuôi cấy tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count

Cho dịch sinh khối vào chất mang để đạt ẩm độ từ 40% đến 50%

Cách xác định lượng sinh khôi thêm vào được xác định theo công thức :

100Trong đó:

x là lượng sinh khối cần thêm vào để đạt độ ẩm y

y là độ ẩm cần đạt được

A là khối lượng than bùn khô

Sau đó mang ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng

Phương pháp theo dõi: sau 7 ngày kiểm tra mật số trong từng nghiệm thức bằng phương pháp Drop plate Count

Chỉ số theo dõi: Mật số vi khuẩn trong từng nghiệm thức

3.3.2.2 Khảo sát mật số của các chủng Bradyrhizobium trong chất mang trong 3

tháng bằng phương pháp Drop plate Count

Mô tả thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức với NT1 chế phẩm chứa chủng vi khuẩn X4, NT2 chế phẩm chứa chủng vi khuẩn A3.2.I, NT3 chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H1, NT4 chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H3

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Quy trình thí nghiệm:

Chuẩn bị chất mang: Nghiền mịn than và bụi xơ dừa phơi khô, rây qua rây 1mm2 Trộn than bùn và xơ dừa theo tỉ lệ đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.2.1.Dùng calcium cacbonate trung hòa pH chất mang từ 6,8 -7, đều chỉnh ẩm độ chất mang về 20% Khử trùng chất mang ở 121oC/30 phút

Chuẩn bị dịch khuẩn: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh trong bình tam giác 250 ml chứa 50ml môi trường YMBtại nhiệt độ và thời gian đã xác định tại thí nghiệm mục 3.3.1.2 và mục 3.3.1.3

Tiến hành: Các chủng vi khuẩn sau nuôi cấy xác định mật sốthức bằng phương pháp Drop plate Count, dùng 17 ml dịch sinh khối cho vào 200 g chất mang để đạt ẩm

3.3.2.3 So sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh các chủng vi khuẩn

Bradyrhizobium tương ứng trên cây đậu xanh trên mô hình bioassay

Mô tả thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức (NT) NT I-X4sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn X4, NT I-A3.2.Isử dụng chế phẩm chứachủng vi khuẩn A3.2.I, NT I-H1 sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H1, NT I-H3 sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H3, NT X4sử dụngdịch tăng sinh chứa chủng vi khuẩn X4,

NT A3.2.I sử dụng dịch tăng sinh chứa chủngvi khuẩn A3.2.I, NT H1 sử dụngdịch tăng sinh chứa chủng vi khuẩn H1, NT H3 sử dụng dịch tăng sinh chứachủng vi khuẩn H3, NT ĐC lànghiệm thức đối chứng không sử dụng vi khuẩn

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Cho 100ml nước vào giấy để giấy ẩm hoàn toàn

Tiến hành gieo hạt vào với khoảng cách 4cm và sâu 2 cm

Phương pháp theo dõi: Sau khi gieo hạt ba ngày tiến hành thu số liệu chiều cao cây, độ dài rễ, 2 ngày đo 1 lần, rễ chạm đáy bịch thì dừng.Đến ngày thứ 7 tiến hành nhổ đếm nốt sần, 7 ngày đếm 1 lần

Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây,chiều dài rễ,số lượng nốt sần

3.3.2.4 Đánh giá hiệu quả chế phẩm ngòai vườn ươm

Mô tả nghiệm thức: Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức (NT) với NT M: sử dụng chế phẩm vi sinh NT ĐCnghiệm thức đối chứng không sử dụng phân vi sinh

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Tiến hành gieo hạt theo khoảng cách 40 cm x30 cm Mỗi hốc 3 hạt Tưới nước, chăm sóc cẩn thận

Phương pháp theo dõi: sau 10 ngày gieo, tiến hành đo chiều cao, nhổ rễ đếm số lượng nốt sần, cách 5 ngày thực hiện 1 lần, đến khi cây ra hoa thì dừng.Khi trái chín thu trái cân trọng lượng, đo kích thước hạt của 10 cây trên mỗi nghiệm thức Sử dụng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cây, trọng lượng trái tươi và hạt khô, trọng lượng 100 hạt, kích thước hạt

3.4 Xử lí số liệu

Số liệu được xử lí ANOVA và trắc nghiệm phân hạng

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men các chủng

Bradyrhizobium

4.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng nhân sinh

khối của các chủng Bradyrhizobium

Bốn chủng Bradyrhizobium nuôi cấy trong môi trường YMB lắc tăng sinh 120

vòng/phút trong các điều kiện nhiệt độ 37oC, sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ xác

định mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count

Bảng 4.1Mật số Bradyrhizobium sau 24, 36, 48 và 60 giờ lắc tăng sinh

giờ.Sau khoảng 48 giờ tăng sinh, mật số vi khuẩn bắt đầu giảm do nguồn dinh dưỡng

cạn kiệt và bị ảnh hưởng bởi các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn

Như vậy, kết quả cho thấy cả 4 chủng đều có thời gian tăng sinh cho mật số vi khuẩn

cao nhất ở 36 giờ nuôi cấy

4.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân sinh khối

của các chủng Bradyrhizobium

Các chủng Bradyrhizobiumnuôi cấy trong môi trường YMB lắc tăng sinh 120

vòng/phút ở các điều kiện nhiệt độ 33oC,35oC, 37oC, 39oC.Sau 36 giờnuôi cấy xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp Drop plate Count

Bảng 4.2Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân sinh khốicủa các chủng

Bradyrhizobium

8 CFU/ml) A3.2.I X4 H1 H3

Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Bradyrhizobium sau 24 giờ, 37oC trên môi

trường YMA (a) Nồng độ từ 10 -4 đến 10 -2 ; (b) Nồng độ từ 10 -7 đến 10 -5 ;

không có ý nghĩa thống kê Mật số của chủng vi khuẩn H1 thấp nhất tại nghiệm thức

33oC, cao nhất tại nghiệm thức 35oC mật số vi khuẩn giảm tại hai nghiệm thức 37oC và

39oC Mật số chủng vi khuẩn H3 trong nghiệm thức 39oC, mật số vi khuẩn trong 3 nghiệm thức 33oC, 35oC, 37oCkhông có sự khác biệt về mặt thống kê tuy nhiên mật số

vi khuẩn trong nghiệm thức 35oClà cao nhất

Từ kết quả trên có thể kết luận nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát

triển của hầu hết các chủngBradyrhizobium là từ 35 - 37oC.Nhiệt độ môi trường nuôi cấy ngoài khoảng nhiệt độ này đều cho mật số vi khuẩn thấp hơn

4.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbonhydrat lên khả năng

nhân sinh khối của các chủng Bradyrhizobium

Cấy 4 chủngBradyrhizobiumA3.2.I, X4, H1, H7 trong môi trường YMB và môi

trường YMB thay thế manitol bởicác nguồn cacbohydrate glucose, sacharose, rỉ đường lắc tăng sinh 120 vòng/phút ở 35oC trong thời gian 36 giờ.Nhằm xác định nguồn cacbohydrate thích hợp, rẻ tiền thay thế manitol sử dụng trong sản xuất công nghiệpnhằm giảm giá thành sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế

Bảng 4.3Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbohydrate lên khả năng nhân

sinh khối củacác chủngBradyrhizobium

8CFU/ml) A3.2.I X4 H1 H3 Manitol 13,947a± 0,91 16,337a± 0,60 14,887a± 0,99 89,220a± 1,91Glucose 01,583c± 0,10 09,900b± 0,42 11,757ab± 0,71 03,833b± 0,10Saccharose 08,327b± 0,31 08,473b± 0,37 06,723bc± 0,19 06,103b± 0,30

khuẩn không có sự khác biệt thống kê với các nghiệm thức sử dụng nguồn cacbohydrate là manitol và cao hơn so với hai nghiệm thức còn lại

Trong các nguồn cacbohydrate sử dụng thay thế manitol nuôi cấy các chủng

Bradyrhizobium, rỉ đường là nguồn cacbohydratecó giá thành rẻ nhất, sẵn có, nguồn cung dồi dào Đồng thời mật số vi khuẩn của các chủng Bradyrhizobium hầu hết

không có sự khác biệt thống kê so với hai nghiệm thức còn lại Vì vậy nên sử dụng rỉ

đường thay thế manitol trong môi trường nuôi cấy Bradyrhizobium trong sản xuất

công nghiệp nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao

4.1.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường trong môi trường nuôi cấy

lên khả năng nhân sinh khối của các chủng Bradyrhizobium

Với kết quả khảo sát ở mục 4.1.3 chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ rỉ đường thích hợp nhất cho quá trình nhân sinh khối của 4 chủng vi khuẩn đã được chọn lọc Nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn A3.2.I, X4, H1, H3 trong môi trường lỏng sử dụng rỉ đường làm nguồn cacbohydrate với nồng độ rỉ đườnglần lượt0,5%; 1%; 1,5%; 2% lắc tăng sinh 36 giờ trong điều kiện 120 vòng/phút ở 35oC

Bảng 4.4Mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường rỉ đường

Tỉ lệ rỉ đường (%) Mật số vi khuẩn (10

8 CFU/ml) A3.2.I X4 H1 H3 0,5 14,707a± 0,58 11,407a±0,37 5,920a± 0,10 7,723a± 0,43 1,0 14,693a± 0,47 09,390ab±0,33 0,917b± 0,04 3,167b± 0,17 1,5 12,293a± 0,64 07,610b± 0,34 1,107b± 0,13 1,673b± 0,03 2,0 05,560b± 0,32 07,023b± 0,28 0,183c± 0,01 1,237b± 0,06

Trong cùng một cột các giá trịtrung bình có kí tự theo sau giống nhau thì khôngcó sự khác biệtvề mặt thống kê (P< 0,01)

Từ kết quả bảng 4.4cho thấy mật số của 4 chủng Bradyrhizobium đều giảm theo

tỉ lệ nghịch với nồng độ rỉ đường Cao nhất ở nồng độ rỉ đường 0,5% và giảm dần đến 2%.Chủng A3.2.I có mật số thấp nhất tại nghiệm thức 2 %,mật số trong cả ba nghiệm thức 0,5%, 1%, 1,5%nhưng không có sự khác biệt về mặt thống kê Chủng X4 mật số

ở nghiệm thức 0,5% và nghiệm thức 1% cao nhất tuy nhiên mật số trong nghiệm thức 0,5% cao hơn nghiệm thức 1% nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.Chủng

H1, H3 mật số vi khuẩn ở nghiệm thức 1%, 1,5%, 2% thấp hơn rõ rệt so với nghiệm thức 0,5%

Từ kết quả trên cho thấy tỉ lệ rỉ đường 0,5% là thích hợpcho sự tăng sinh khối

của các chủng Bradyrhizobiumvà mang lại hiệu quả kinh tế nhất

4.2 Tạo chế phẩm vi sinh vật từ các chủngBradyrhizobium sử dụng chất mang

than bùn - xơ dừa

4.2.1 Kết quả khảo sát tỉ lệ than bùn và xơ dừa thích hợp làm chất mang cho các

chủng Bradyrhizobium

Chọn ngẫu nhiên 1 chủng Bradyrhizobium trong 4 chủng A3.2.I, X4, H1,H3

Trong thí nghiệm chủng chọn được là chủng X4, chủng X4 nuôi cấy tăng sinh trong môi trường YMB với tốc độ lắc 120 vòng/phútở 35oC.Sau 36 giờ cấy vào chất mang tương ứng với ba nghiệm thức I: sử dụng chất mang là than bùn, nghiệm thức II: sử dụng chất mang là than bùn và xơ dừa với tỉ lệ than bùn : xơ dừa là 3:1, nghiệm thức III: sử dụng chất mang làthan bùn và xơ dừa với tỉ lệ than bùn : xơ dừa là 1:1bảo quản

ở điều kiện nhiệt độ phòng sau 15 ngày kiểm tra mật số vi khuẩn trong từng nghiệm thức, xác định chất mang thích hợp sử dụng làm chế phẩm

Bảng 4.5 Mật số vi khuẩn trong các nghiệm thức sau 15 ngày

Bradyrhizobum là các chủng vi khuẩn háo khí vì vậy độ thoáng khí cao thuận lợi cho sự

sinh trưởng và tồn tại của các chúng trong chất mang Tuy nhiên trong nghiệm thức sử dụng xơ dừa với tỉ lệ 1:1, khả năng giữ nước của xơ dừa thấp hơn than bùn nên độ ẩm của chất mang sẽ giảm nếu bảo quản trong thời gian dài Trọng lượng riêng của xơ dừa

thấp hơn so với than bùn vì vậy khi bổ sung nhiều xơ dừa làm cho chất mang cồng kềnh gây khó khăn trong đóng gói và vận chuyển vì vậy chỉ nên bổ sung xơ dừa với tỉ lệ 3:1

là thích hợp làm chất mang cho vi khuẩn Bradyrhizobium

4.2.2 Kết quả khảo sát mật số của các chủng vi khuẩn Bradyrhizobiumtrên chất

mang sau 3 tháng bằng phương pháp Drop plate Count

Chất mang sử dụng là than bùn-xơ dừa với tỉ lệ 3:1 bổ sung 1% rỉ đường, đều chỉnh độ ẩm về 20%, dùng calcium cacbonate hiệu chỉnh pH đến mứcpH 6,8-7 hấp khử trùng ở điều kiện 121oC/30 phút

Sử dụng 4 chủng Bradyrhizobiumgồm A3.2.I, X4, H1, H3 lắc tăng sinh 120

vòng/phút ở 35oC trong 36 giờ Sau 36 giờ xác định mật số vi khuẩn có trong dịch tăng sinh của từng chủng vi khuẩn Bổ sung 17 ml dịch khuẩn vào 200g chất mang vô trùng tạo chế phẩm với ẩm độ chế phẩm trong khoảng 40 - 45%.Dùng tay bóp nhẹ bên ngoài mỗi túi trộn đều dịch khuẩn vào chất mang.Sau khi hỗn hợp đã đồng nhất, chia đều ra các túi nhỏ mỗi túi 15 g bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát Kiểm tra mật số vi khuẩn trong mỗi nghiệm thức sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng

Bảng 4.6Mật số vi khuẩn trong chất mang

7CFU/g)

Ban đầu 20,223c± 0,48 4,123c± 0,27 25,850bc± 2,02 30,943a± 2,46

1 tháng 49,757a± 1,47 8,927a± 0,41 52,363a± 1,53 32,757a± 0,87 2tháng 31,673b± 1,08 6,667b± 0,18 33,890b± 2,18 24,273ab±1,7

3 tháng 15,173c± 1,33 3,763c± 0,68 17,757c± 0,68 16,720b± 1,65

Trong cùng một cột các giá trịtrung bình có kí tự theo sau giống nhau thì khôngcó sự khác biệtvề mặt thống kê (P< 0,01)

Thí nghiệm khảo sát mật số vi khuẩn Bradyrhizobiumtrong chế phẩm theo thời

gian nhằm xác định khả năng sinh trưởng và tồn tại của vi khuẩn trong chế phẩm.Kết quả bảng 4.6 cho thấy mật số vi khuẩn sau một tháng bảo quản của chủng A3.2.I tăng

từ 20,223x107 CFU/g lên 49,457x107 CFU/g, chủng X4 tăng từ 4,123x107 CFU/g lên 8,927x107 CFU/g, chủng H1 25,850x107 CFU/g lên 52,363x107 CFU/g.Sự khác biệt mật số sau một tháng bảo quản của 3 chủng này so với ban đầu rất có ý nghĩa thống

kê Riêng nghiệm thức H3 có mật số vi khuẩn không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa mật số sau một tháng bảo quản và ban đầu tuy nhiên mật số vi khuẩnvẫn tăng từ 30,393x107 CFU/g lên 32,757x107 CFU/g.Như vậy mật số của 4chủng vi khuẩn có tăng lên trong chế phẩm sau một tháng Sang tháng thứ hai và tháng thứ ba mật số vi khuẩn trong chế phẩm giảm dần nguyên nhân do nguồn cacbohydrate, oxy trong chế phẩm giảm và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Tuy nhiên, hầu hết không có sự khác biệt về mặt thống kê so với mật số vi khuẩn ban đầu Như vậy kết quả đã chứng tỏ chất mang than bùn - xơ dừa với tỉ lệ 3:1 khá thích

hợp để làm chất mang cho vi khuẩn Bradyrhizobium

4.2.3 Kết quả so sánh hiệu quả của chế phẩm với dịch tăng sinh các chủng

Bradyrhizobium tương ứng trên mô hình bioassay

Chế phẩm sau 1 tháng tiến hành kiểm tra, so sánh khả năng hình thành nốt sần và

cố định đạm của chế phẩm so với dịch tăng sinh các chủng Bradyrhizobium tương ứng

trên mô hình bioassay Thí nghiệm bao gồm nghiệm thức đối chứng (ĐC)không sử dụng vi khuẩn, nghiệm thức I-A3.2.I: sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn A3.2.I, nghiệm thức I-X4: sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn X4, nghiệm thức I-H1: sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H1, nghiệm thức I-H7: sử dụng chế phẩm chứa chủng vi khuẩn H7, nghiệm thức A3.2.I: sử dụng chủng vi khuẩn A3.2.I, nghiệm thức X4: sử dụng chủng vi khuẩn X4, nghiệm thức H1: sử dụng chủng vi khuẩn H1, nghiệm thức H3: chứa chủng vi khuẩn H3 Với các chủng vi khuẩn A3.2.I, X4, H1, H3 được nuôi cấy trong môi trường YMB lắc tăng sinh 36 giờ ở điều kiện 120 vòng/phút, với nhiệt độ là35oC.Tiến hành theo dõi cácchỉ tiêu là độ dài rễ, chiều cao cây và số lượng nốt sần trong từng nghiệm thức

4.2.3.1 Kết quả theo dõi độ dài rễ cây đậu xanh trên mô hình bioassay

Sau khi gieo hạt 3 ngày tiến hành đo chiều dài rễ của các nghiệm thức, khi rễ chạm đáy bịch thì ngừng

Bảng 4.7Độ dài rễ của cây đậu xanh trông trên bioassay qua các lần theo dõi

ĐC 12,800cd± 0,23 19,720c± 1,04 23,317d± 0,08 A3.2.I 12,843cd± 0,55 20,583bc± 0,25 26,520ab± 0,42 X4 12,723cd± 0,45 15,237d± 0,16 25,080bcd± 0,38 H1 12,103d± 0,33 17,307d± 0,51 24,113d± 0,65 H3 13,277cd± 0,34 20,860bc± 0,32 24,303cd± 0,26 I-A3.2.I 14,337bc± 0,32 22,363ab± 0,33 26,507ab± 0,13 I-X4 15,417ab± 0,46 22,403ab± 0,24 25,917abc± 0,59 I-H1 16,330a± 0,14 24,327a± 0,17 27,630a± 0,17 I-H3 15,977ab± 0,25 23,193a± 0,53 27,443a± 0,44

rễ trong các nghiệm thức sử dụng chế phẩm I-H1và I-H3 có chiều dài rễ dài hơn nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức sử dụng dịch khuẩn tương ứng Nghiệm thức I-A3.2.I và nghiệm thức I-X4 dài hơn nghiệm thức đối chứng nhưng không có sự khác biệt thống kê

so với nghiệm thức sử dụng dịch khuẩn tương ứng Từ kết quả trên cho thấy chiều dài rễ trong nghiệm thức sử dụng chế phẩm dài hơn trong nghiệm thức sử dụng dịch khuẩn Vậy có thể kết luận khả năng tác động đến sự phát triển chiều dài rễ của cây đậu xanh

của chế phẩm cao hơn so với dịch khuẩn

4.2.3.2 Chiều cao cây đậu xanh trồng trên mô hình bioassay

Sau 3 ngày gieo hạt đậu xanh tiến hành đo chiều cao cây của các nghiệm thức tiến hành theo dõi đến khi dừng theo dõi độ dài rễ.Kết quả được thê hiện trong bảng 4.8

Bảng 4.8 Chiều cao cây đậu xanh trồng trên bioassay sau các lần theo dõi

Hình 4.2 Đậu xanh trên mô hình bioassay (a) Mô hình bioassay; (b) Rễ đậu

xanh sau 3 ngày gieo trên bioassay

so với nghiệm thức đối chứng.Nghiệm thức sử dụng chế phẩm I-H3 không có sự khác

biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức sử dụng dịch khuẩn H3 và nghiệm thức đối

chứng.Sau 7 ngày gieo, chiều cao cây của các nghiệm thức sử dụng chế phẩm và

nghiệm thức sử dụng dịch khuẩn tương ứng không có sự khác biệt về mặt thống kê và

không có sự khác biệt thống kê so với nghiệm thức đối chứng Như vậy, kết quả cho

thấy không có sự khác biệt chiều cao cây trong các nghiệm thức

4.2.3.3 Số lượng nốt sần của rễ đậu xanh trồng trên mô hình bioassay

Sau khi gieo hạt 7 ngày tiến hành nhuộm rễ xác định số lượng nốt sần trong các

nghiệm thức Tiến hành theo dõi đến 21 ngày sau gieo thì dừng Kết quả được thể hiện

Trong cùng một cột các giá trịtrung bình có kí tự theo sau giống nhau thì khôngcó sự khác

biệtvề mặt thống kê ( P< 0,01); NSG: ngày sao gieo

Kết quả số lượng nốt sần trên bioassaybảng 4.9 cho thấy sau 7 ngày gieo các

nghiệm thức đều đã xuất hiện nốt sần.Số lượng nốt sần trong từng nghiệm thức tăng

theo thời gian từ 7 đến 21 ngày sau gieo.Số lượng nốt sần trong nghiệm thức I-A3.2.I

sau 7 ngày gieo thấp hơn nghiệm thức A3.2.I nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa.Sau

14 ngày số lượng nốt sần trong hai nghiệm thức cùng tăng nhưng số lượng nốt sần

trong nghiệm thức A3.2.I cao hơn nghiệm thức I-A3.2.I.Sau 21 ngày gieo số lượng nốt