ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHỬ PROTÊIN TRONG LATEX CAO SU THIÊN THIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

Luận văn cũng tiến hành nghiên cứu tính chất cơ lý của sản phẩm từ latex cao su thiên nhiên đã được loại protêin bằng các phương pháp nêu trên.. 2.4 Protêin gây dị ứng trong LTXCSTN từ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHỬ PROTÊIN TRONG LATEX CAO

SU THIÊN THIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

Họ và tên sinh viên : LÂM TRÍ HIẾU Ngành : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Niên khóa : 2005-2009

Bình Dương, tháng 8/2009

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHỬ PROTÊIN TRONG LATEX CAO SU

THIÊN THIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

Lời cảm ơn

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong thời em học tập tại trường Đặc biệt, xin hân thành cảm

ơn thầy Nguyễn Ngọc Bích và chị Nguyễn Thị Huệ Trang đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cám ơn toàn thể cô chú, anh chị công tác tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thật tốt cho em trong thời gian lưu trú tại Viện

Sinh viên thực hiện Lâm Trí Hiếu

TÓM TẮT

Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ Hóa Học được thực hiện nhằm nghiên cứu và đánh giá khả năng khử protêin trong latex cao su thiên nhiên bằng phương pháp hóa học Từ đó, phân tích hiệu quả đạt được phương pháp khử, nhằm chọn ra được quy trình khử tốt nhất, ứng dụng vào thực tế sản xuất Các thí nghiệm đã thực hiện là (i) khử protêin trong giai đoạn latex bằng polyvinyl alcohol (PVA), (ii) khử protêin trong giai đoạn latex bằng urea, (iii) khử protêin trong giai đoạn sản phẩm trước và sau lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch chlorine, (iv) khử protêin trong giai đoạn đoạn phẩm trước và sau lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch Natri Clorua ( NaCl) Luận văn cũng tiến hành nghiên cứu tính chất cơ lý của sản phẩm từ latex cao

su thiên nhiên đã được loại protêin bằng các phương pháp nêu trên

Kết quả có được từ các thí nghiệm khử protêin trong giai đoạn latex cho thấy, quá trình gia công ly tâm đã loại bỏ 86,38% hàm lượng protêin trong tan được trong nước (EP) có trong mủ ly tâm HA Màng cao su hình thành từ mủ ly tâm HA khử hay không khử protêin có hàm lượng EP trung bình lần lượt là 0,3715 mg/g và 2,3304 mg/g Trong khi đó, hiệu quả khử protêin trong mủ ly tâm HA bằng phương pháp ủ mủ ly tâm HA với PVA và urea không đáng kể Đồng thời, ủ mủ ly tâm HA với PVA và urea không ảnh hưởng đến cường lực của màng cao su

Khử protêin trong giai đoạn sản phẩm bằng ngâm rửa màng cao su trước và sau lưu hóa trong dung dịch NaOCl và NaCl, cho hiệu quả khử protêin đáng kể Ngâm rửa màng cao su sau lưu hóa cho hiệu quả khử protêin cao khi ngâm rửa màng cao su trước lưu hóa Dung dịch NaCl cho hiệu quả khử protêin cao hơn dung dịch NaOCl Phương pháp ngâm rửa màng cao su sau lưu hóa cho không gây ảnh hưởng đến cường lực của màng cao su so với ngâm rửa màng cao su trước lưu hóa

ABSTRACT

Graduation tractate from university chemical engineering speciality is made to study and evaluate the possibility of reducing protein in natural rubber latex using chemical methods Since then, analysis of the effectiveness of the deproteinization methods, in order to select the best deproteinization procedure, applied in actual production The experiments were made (i) reduction of leachable proteins in the latex stage with polyvinyl alcohol (PVA), (ii) reduction of leachable proteins in the latex stage with urea, (iii) reduction of leachable proteins in the product stage by rinsing unvulcanised and Post-vulcanised latex film in chlorine solution, (iv) reduction of leachable proteins in the product stage by rinsing unvulcanised and Post-vulcanised latex film in sodium chloride solution (NaCl) Tractate also researched on physical properties of products from natural rubber latex had been deproteinised using the methods above

Results obtained from experiments reduced protein in the latex stage showed that the centrifugation removed 86.38% of the extractable protein (EP) in HA latex Latex film was formed from HA latex which was reduced or not reduced protein, had EP content in turn is 0.3715 mg / g and 2.3304 mg / g Meanwhile, it was found that PVA and urea didn’t reduce the EP content significantly and did’nt affect the tensile strength of latex film

Rinsing unvulcanised and Post-vulcanised latex film in chlorine solution and sodium chloride solution, has a significant effect on the removal of EP Rinsing Post-vulcanised latex film was far more effective than rinsing unvulcanised latex film for achieving lower EP content Sodium chloride solution is more effective than chlorine solution Rinsing unvulcanised latex film has a significant effect on the tensile strenght

of latex film

2.1 Cấu tạo và thành phần của latex cao su thiên nhiên 3

2.1.7 3 Protêin trong latex cao su thiên nhiên 15

2.1.7.3.b Các protêin cơ bản 16

2.2.1 Nhữnng nhóm thường gặp và rủi ro 182.2.2 Triệu chứng 182.2.3 Những chất gây dị ứng latex cao su thiên nhiên 19

2.3.2.1 Phân tích hấp thu miễn dịch – phóng xạ (RAST) 222.3.2.2 Phân tích hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme trên protêin gây dị

2.3.2.3 Phân tích cản trở ELISA sử dụng những kháng thể đơn dòng 23

2.4 Tình hình nghiên cứu các phương pháp khử protêin 242.4.1 Phương pháp khử protêin trong giai đoạn latex 252.4.2 Phương pháp khử protêin trong giai đoạn sản phẩm 26

3.1 Vật liệu 373.1.1 Hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình 273.1.2 Dung dịch đông tụ 28

3.2 Phương pháp thí nghiệm 283.2.1 Thí nghiệm các phương pháp khử protêin trong giai đoạn latex 283.2.2 Thí nghiệm các phương pháp khử protêin trong giai đoạn sản phẩm 29

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

CSTN Cao su thiên nhiên

DNA Deoxyribonucleic acid

DRC Hàm lượng cao su khô (Dry rubber content)

ELISA Phân tích hấp thu miễn dịch liên kết vối enzyme (Enzyme-linked

immunodsorbent assay)

EP Protêin chiết xuất (Extractable proteins)

HA High ammonia

LEAP Phân tích hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme trên protêin gây dị ứng

trong latex (The latex ELISA for allergenic proteins) LTCSTN Latex cao su thiên nhiên

MST Độ ổn định cơ học (Mechanical Stabitily time)

PVA Polyvinyl alcohol

RAST Phân tích hấp thu miễn dịch - phóng xạ (Radio-immunosorbant assay) SPT Skin prick test

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TS Lực kéo đứt (Tensile strenght)

DANH SÁCH CÁC HÌNH

2.1 Ống nghiệm ly tâm siêu tốc với các thành phần của latex bên

2.4 Cấu trúc bậc nhất của protêin 9

2.5 Mô hình cấu trúc bậc 2 dạng anpha-helix 10

2.6 Mô hình cấu trúc bậc 2 dạng beta-helix 11

2.7 Các cầu nối trong cấu trúc bậc 3 của protêin 12

2.8 Cấu trúc phân tử collagen (a) và Hb-α2,β2 (b) 13

4.1 Hiệu quả khử protêin trong giai đoạn latex bằng Urea và

4.2 Ảnh hưởng tính chất cơ lý bởi do quá trình khử protêin giai đoạn latex 34

4.3 Hiệu quả khử protêin trong giai đoạn latex bằng ngâm rửa trong dung dịch Chlorine và NaCl 35

4.4 Ảnh hưởng tính chất cơ lý bởi do quá trình khử protêin giai đoạn sản phẩm 36

2.4 Protêin gây dị ứng trong LTXCSTN từ loài Hevea brasiliensis 19

4.1 Giá trị EP và lực kéo đứt trung bình của sản phẩm theo phương pháp khử protêin trong giai đoạn latex bằng urea và

4.2 Giá trị EP và lực kéo đứt trung bình của sản phẩm khử protêin bằng phương pháp ngâm rửa với dung dịch NaOCl

trước và sau lưu hóa

34

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vần đề

Nhiều năm qua, trên thế đã có rất nhiều nghiên cứu về vấn đề dị ứng protêin trong LTCSTN Trên lĩnh vực y học, các nhà khoa học đã chứng minh được các triệu chứng dị ứng do sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ CSTN Các nghiên cứu về cơ chế và bệnh học dị ứng protêin trong LTCSTN cho thấy cần phải có biện pháp cải tiến đối với các sản phẩm LTCSTN Đối tượng mắc các chứng dị ứng protêin LTCSTN nhiều nhất là nhân viên y tế, do đối tượng này tiếp trức trực tiếp mỗi ngày với găng tay CSTN Trên lĩnh vực hóa học, các nhà khoa học không ngừng đưa ra các giải pháp khắc phục vấn đề này Nhiều công trình nghiên cứu về protêin trong LTCSTN đã xác định được một số loại protêin và chuỗi polypeptide có trong LTCSTN Thực tế cho đến nay, trong LTCSTN có khoảng 250 protêin và chuỗi polypeptide đã được xác nhận với kích thước phân tử và đối với một số protêin với chức năng rõ ràng, trong đó khoảng 50 protêin hoặc chuỗi polypeptide đã được biết là dị ứng nguyên

Song song với nghiên cứu tìm hiểu về protêin trong LTCSTN, các công trình nghiên cứu tác động lên đối tượng protêin đã được triển khai và mang lại nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên, các nghiên cứu vẫn còn rất nhiều hạn chế Ví dụ, các công trình

sử dụng enzyme cắt các chuỗi protêin thành những đoạn ngắn hơn, nhưng người ta không biết được những đoạn ngắn có khả năng trở thành dị ứng nguyên không Trên lĩnh vực cải tiến sản phẩm, các nhà sản xuất đã sản xuất thành công các sản phẩm có hàm lượng protêin chiết xuất ở mức khá thấp, giảm thiểu rủi ro mắc phải các dị ứng cho người sử dụng

Với định hướng đó, đề tài “Đánh giá khả năng khử protêin trong latex cao su thiên bằng phương pháp hóa học” được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của các phương pháp khử protêin đã được nghiên cứu, áp dụng vào thực tiển sản xuất của ngành cao su Việt Nam

1.2 Mục đích đề tài

- Xây dưng các qui trình khử protêin trong LTCSTN bằng phương pháp hóa học

- Đánh giá hiệu quả khử protêin của các phương pháp được thí nghiệm

- Đánh giá chỉ tiêu cơ lý của sản phẩm sau khi đã được khử protêin

1.3 Nội dung đề tài

Tiến hành các thí nghiệm khử protêin :

• Khử protêin trong giai đoạn latex bằng PVA (polyvinyl alcohol)

• Khử protêin trong giai đoạn latex bằng urea

• Khử protêin trong giai đoạn sản phẩm trước và sau lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch chlorine

• Khử protêin trong giai đoạn sản phẩm trước và sau lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch NaCl

1.4 Yêu cầu

Đánh giá các kết quả đạt được từ các thí nghiệm trên :

Đối với màng cao su, phân tích protein chiết xuất được bằng nước (Aqueous Extractable Protein - EP) được thực hiện bằng phương pháp Lowry cải tiến theo mô tả trong ASTM D5712-05 Xác định lực kéo đứt của mẫu cao su được thực hiện theo TCVN 4509:2006

Kết quả từ các phân tích sẽ đánh giá được phương pháp khử protêin ưu việt

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Cấu tạo và thành phần của latex cao su thiên nhiên

Theo Chen (1995), thành phần cấu tạo hóa học của latex từ cao su Hevea phức

tạp hơn những latex tổng hợp Bởi vì latex cao su Hevea là một tế bào chất Đã từ lâu,

các nghiên cứu cho biết, ngoài việc latex cao su chứa các hydrocacbon cao su, còn

chứa những thành phần phi cao su hiện diện với những lượng tương đối nhỏ Nhiều

trong số này tan trong môi trường serum của latex, một số khác bám trên bề mặt của

các hạt cao su và các phần tử phi cao su thì lơ lững trong latex Một cơ sở lập luận đã

được thiết lập rằng những tính chất vậy lý và hóa học của latex được bảo quản, khi đến

tay các quốc gia tiêu thụ, đã khác đi đáng kể so với latex sống được cạo do những thay

đổi xảy ra trong suốt quá trình thu hoạch, bảo quản, cô đặc và quá trình tồn trữ tiếp

theo trong vận chuyển Những thay đổi tự nhiên này bị tác động bởi nhiều yếu tố bao

gồm thành phần cấu tạo của latex trước khi bảo quản Trong phần giới thiệu về thành

phần cấu tạo học của latex cao su thiên nhiên này, những thành phần hạt quan trọng và

thành phần hóa học chính của latex được mộ tả ngắn gọn Những thay đổi gây ra bởi

nồng độ latex, quá trình ly tâm và bảo quản cũng được đề cập

Vì là sản phẩm từ thiên nhiên, thành phần cấu tạo của latex rất khác nhau giữa

những giới hạn rất rộng Sau đây là một thành phần cấu tạo phỏng chừng của latex cao

su thiên nhiên :

Bảng 2.1 : Thành phần hóa học LTCSTN Thành phần %

Tổng hàm lượng chất rắn 41,5

Protêin 1,4 Lipid 1 Phospholipid 0,6

Tro 0,5

Carbohydate 1,6

Khoáng chất 0,3

Nước 58,5 (Nguồn : theo Chen, 1995)

Latex cao su có thể phân riêng thành bốn phần chính khi ly tâm tốc độ cao

Trong đó có 3 thành phần hạt với lượng lớn, lơ lửng trong môi trường serum bao

quanh Gồm những hạt cao su ( thành phần hạt chính), những hạt được gọi là “lutiods”

và những hạt Frey-Wyssling Sự phân bố của các phần chính trong ống ly tâm sau khi

ly tâm tốc độ cao, được thể hiên rõ qua hình 2.1:

Hình 2.1: Ống nghiệm ly tâm siêu tốc với các thành phần của latex bên trong

(Nguồn : theo Chen, 1995)

Lớp trên cùng là chứa các hạt cao su Bên dưới lớp này là các hạt

Frey-Wyssling với phần dịch serum bên dưới và cuối cùng phần đáy chủ yếu chứa các hạt

lutiods Các hạt Frey-Wissling có thể được tìm thấy ngay bên trên phần đáy Khi latex

được thu hoạch và ly tâm ở nhiệt độ dưới 5 0C, có thể thấy chúng được phân bố thành

11 phần

2.1.1 Phần tử hạt cao su

Theo Chen (1995), phần tử hạt cao su trong latex tươi chiếm 25 % - 45 % khối

lượng của latex Hạt cao su trong latex tươi được bao bọc bởi một màng phức tạp chứa

protêin và phospholipid Cao su chứa trong hạt là dạng không tan được trong nước và

với bản chất là khối tập hợp phân tử Ví dụ như, một phần tử cao su với đường kính

0,1 μ m chứa 483 phân tử cao su với khối lượng phân tử 6x105 Hydrocarbon trong

cao su chủ yếu là cis-1,4-polyisoprene ( khoảng 99 % ) Các phần tử cao su thường có

hình cầu với đường kính trong khoảng 0,02 μ m đến 3 μ m, nhưng latex từ một vài dòng vô tính trưởng thành, các phần tử lớn hơn có dạng quả lê

Hình 2.2 : Cấu tạo phần tử cao su

2.1.2 Lutoids

Theo Chen (1995), các phần tử phi cao su chiếm nhiều hơn hết là lutiods Đây

là những thể có màng bao hình quả lê đường kính đặc trưng từ 2-5 μ m và nặng hơn các hạt cao su Chúng hình thành phần chủ yếu của lớp đáy cùng, chiếm 10 %-20 % thể tích của tổng latex và chứa 12 % chất rắn Bên trong lutoid là dung dịch nước (thường gọi là “B-serum”), chứa các hợp chất hòa tan như axít, muối khoáng, protêin, đường và một polyphenol oxidase Do đó pH của lutoid vào khoảng 5,5 so với dịch serum bao quanh là 6,9 Hiện tượng chuyển điện chất hồ đặc quánh cho thấy phát hiện tám loại protêin trong nhựa lutoid Latex từ những cây mới lớn, một vài protêin xuất hiện với hình dạng sợi khâu vắt Polyphenol oxydase là nguyên nhân của hiện tượng sạm màu của cao su đông tụ khi phơi ra ngoài không khí hay oxy Hiên tại, một lượng lớn lutoid với lượng đủ lớn làm ảnh hưởng đến độ nhớt và tính chất keo của latex tươi

Ví dụ, sự hiện diện của lutoids giúp việc đông tụ nhanh hơn so với bất kì thành phần nào khác, và latex đã tách bỏ lutoids khó xảy ra đông tụ so với latex ban đầu Lutoids thoái hóa nhanh trong nhiệt độ môi trường nhiệt đới Thay đổi hiển nhiên đầu tiên trong lutoids là sự chấm dứt chuyển động Brownian bên trong, do dính vào màng bao xung quanh Sau đó màng bị đứt phóng thích những thành phần trên màng vào pha serum Những phần màng còn lại được tách rời như một vật liệu không thể kết dính,

làm cho việc đông tụ dễ dàng hơn Những lutoids không bị thay đổi trong môi trường nước, dễ bị căng nỡ và vỡ ra và chính hiện tượng này đã làm tăng độ nhớt của latex

2.1.3 Phần tử hạt Frey-Wyssling

Theo Chen (1995), những phần tử này có hình quả lê, thường có màu vàng tươi

và thuộc nhóm có tính khúc xạ cao Chúng có kích thước lớn hơn và có tỷ trọng cao hơn không nhiều so với các hạt cao su Chúng thường xuất hiện thành những cụm Màu vàng được xác định do hiện sự hiện diện của các sắc tố carotenoid Màu sắc của latex phụ thuộc không chỉ dựa vào số lượng của các phần tử Frey-Wissling, mà phụ thuộc những sắc tố hiện diện bên trong latex Về bản chất, những phần tử này chủ yếu

là lipid và không hiện diện trong latex cao su cô đặc bảo quản bằng ammonia Dường như, chúng đã bị loại ra khi ly tâm latex hoặc bị hòa tan vào môi trường serum khi latex được ammonia hóa

Những thành phần phi cao su chiếm lượng nhiều ( trừ nước ) trong latex tươi gồm protêin, lipid và các muối vô cơ Một số lớn các hợp chất khác hiện diện với lượng rất nhỏ

2.1.4 Lipid

Theo Nguyễn Hữu Trí (2003), trong latex, lipid và dẫn xuất của chúng chiếm khoảng 2%, ta có thể trích ly được bằng rượu hay aceton Lipid thường bị hiểu lầm là chất nhựa (resines)

Từ năm 1924, Whitby đã chứng minh chất trích ly bằng aceton có chứa các chất đơn giản như acid oleic, acid linoleic, acid stearic và aicd palmitic, đồng thời cũng có chứa các chất phức tạp hơn như các sterol (phytostrerol) và các ester của sterol

Eaton đã lập luận rằng các sắc tố ảnh hưởng lên tiến trình nhuộm màu vàng của carotenoid

Vào năm 1930, Rhodes và Bishop đã chứng minh ngoài các lipid đơn giản, việc

xử lý latex cũng như cao su có thể trích ra được các hợp chất thuộc lipid như là chất phosphatid Sau đó, các glycolipid, amino lipid và sulfolipid cũng được người ta trích

ra

R.H.Smith gần đây đã cho bảng phân tích phospholipid latex như sau :

- Lecithin có chứa chất đường khử oxygen hóa hợp - 51 %

- Phosphatidat kim loại có chứa inositol hóa hợp và chất đường khử oxugen 10,5%

- Phosphatidyl ethanolamine - 3 %

- Triglyceride - 20 %

- Chất không savon hóa được - 15,5 %

Ta chú ý việc trích ly lipid bằng rượu hay aceton đã chứng minh được latex có chứa hàm lượng acid béo có phân tử khối càng lớn bao nhiêu thì latex đó càng cũ hơn bấy nhiêu Về sự phân bố của chúng, lipid và dẫn xuất của chúng chứa ở latex dưới ba hình thức khác nhau :

- Chủ yếu chúng cấu tạo nên các phần tử Frey-Wyssling

của chúng đều tan hoàn toàn trong serum

Các hợp chất lipid và dẫn xuất của chúng cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới tính chất latex

Tổng quát, những chất này là những chất hoạt động bề mặt và chúng có tham gia vào tính ổn định thể giao trạng của latex tươi và latex ly tâm Chẳng hạn như chỉ cần một lượng nhỏ savon thấp nhất cũng đủ để ổn định tính chất cơ lý latex đã ly tâm

Về lĩnh vực ổn định, phosphorus của phospholipid tham gia vào phản ứng với magnsium của latex sẽ sinh ra tác dụng đông đặc latex Tỷ lệ Mg/P trong latex không thích hợp sẽ gây ra đông đặc latex không hợp lúc ở trên cây; mặt khác, ta sẽ thấy lại phosphorus dưới dạng phosphate ammonium-magnnesium ở bộ phận “bol” của máy ly tâm

Những chất tan được trong nước chỉ lẩn trong cao su với một tỉ lệ rất nhỏ (cao

su tờ xông khói hay mủ tờ có thể chứa khoảng từ 0,1 % đến 0,2 %) Tỉ lệ này có thể

tăng lên trong vài trường hợp đặc biệt, nhất là cao su có được từ sự đông đặc serum loại ra từ máy ly tâm Như trường hợp này, cac su sẽ có độ hút ẩm rất cao và sẽ bị vi khuẩn và nấm mốc tấn công rất mạnh

2.1.6 Khoáng

Theo Nguyễn Hữu Trí (2003), vào năm 1939, C.P.Flint đã cho bảng nuyên tố

có trong một latex chưa đậm đặc hóa nhưng đã được tác dụng với ammonia như sau: ( những số này được tính theo tổng số tro):

Bảng 2-2 : Thành phần khoáng trong CSTN

Na K Rb Ca Mn Fe Mg Cu 0,96 96 0,72 0,43 0,02 1,7 0,36 0,07 (Nguồn : Nguyễn Hữu Trí, 2003)

Ta phải chú ý là latex đã cho amoniac vào rồi sẽ có một ảnh hưởng rõ rệt tới hàm lượng của vài nguyên tố nhất là với magnesium

2.1.7 Cấu tạo của protêin

2.1.7.1 Peptide

Peptide bao gồm hai hay nhiều gốc amino acid liên kết với nhau bằng nối peptide (-CO-NH-) Nối peptide thành lập do nhóm -COOH của amino acid này liên kết với nhóm của amino khác loại đi một phân tử nước Quá trình này tiến hành theo kiểu đa ngưng tụ

Sơ đồ một nối peptide được biểi diễn như sau :

Hình 2.3 : Cấu tạo liên kết peptide

( Nguồn : Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Polypeptide là chuỗi peptide có chứa nhiều amino acid

Oligopeptide là chuỗi peptide có số cấu tử amino acid ít hơn 20

Protêin là chuỗi polypeptide có số cấu tử amino acid lớn hơn 50, có tính keo điển hình và chúng bị sa lắng trong môi trường trichloacetic (CCl3COOH) 10% ( Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Hình 2.4 : Cấu trúc bậc nhất của protêin

( Nguồn : Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Đặc tính cấu trúc bậc nhất

Bộ khung cacbon và nitrogen được phân bố trên cùng một mặt phẳng, các gốc

R và nguyên tử hydrogen đối xứng qua mạch giữa của amino acid

Khoảng giữa C và N trong liên kết peptode (-CO-NH-) là 0,132 nm, trị số này năm giữa trị số nối đôi C=N : 0,125 nm và nối đơn C-N : 0,147 nm, nên tại vị trí liên

kết peptide dễ xảy ra hện tượng hỗ biến dẫn tới hình thành dạng enol, tạo cho phân tử protêin khả năng tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa học

Sườn của chuỗi polypeptide là các đơn vị (-NH-CH-NO-), các gốc bên R tạo cho phân tử protêin có các cấu trúc không gian phức tạp và có hoạt tính sinh học cao

Tính đặc trưng sinh học của từng loại protêin do cấu trúc bậc I quyết định, tức

là do trình tự sắp xếp và số lượng các amino acid trong cuỗi polypeptide quyết định Trình tự này được mã hóa bởi các codon trên DNA, sự thay đổi trình sắp xếp các amino acid trên chuỗi peptide sẽ dẫn đến những rối loạn về đặc tính sinh học của phân

tử protêin

Gọi P (n) là số tổ hợp giữa các cấu tử amino acid thì với 20 amino acid sẽ cho 2.108 tổ hợp (19 tỷ protêin khác nhau), số tổ hợp này tạo cho lớp chất protêin có tính muôn hình muôn vẻ trong thiên nhiên ( Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

2.1.7.2.b Cấu trúc bậc hai

Hình 2.5 : Mô hình cấu trúc bậc 2 dạng anpha-helix

(Nguồn : Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Cấu trúc bậc II là dạng kết cấu tring không gian của chuỗi polypeptide Vì tất cả các amino aicd tự nhiên đều bất đối, nên một tính chất quan trọng của các gốc amino acid là khả năng quay tự do của chúng quanh mối liên kết của Cα , kết quả làm cho

chúng có khuynh hướng hình thành cấu trúc xoắn theo kiểu cuộn α (α -helix) hoặc dạng xếp lớp β , với liên kết ổn định cấu trúc xoắn là liên kết hydrogen Dạng cấu trúc

α -helix do Pauling và Corry phát hiện (1955) Liên kết hydrogen thành lập giữa nguyên tử H của gốc amine từ amino acid này với nguyên tử oxygen của gốc carbonyl

từ amino acid khác khi khoảng cách là 2,79±0,12 A0 Kết quả mạch polypeptide xoắn

lại theo chiều xoắn anpha

Đặc tính của cấu trúc bậc INSCRIPTION

Mạch xoắn anpha có 36 gốc amino acid trên mỗi vòng xoắn, amino acid thứ nhất sẽ ở trên cùng một mặt phẳng với amino acid thứ 18

Cấu trúc bậc II do cấu trúc bậc I quyết định, dạng cấu trúc này rất bền và tốn ít năng lượng, chúng chỉ tùy thuộc vào loại amino acid thành lập nên mạch xoắn (Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Hình 2.6 : Mô hình cấu trúc bậc 2 dạng beta-helix

(Nguồn : Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

2.1.7.2.c Cấu trúc bậc 3

Hình 2.7 : Các cầu nối trong cấu trúc bậc 3 của protêin

(Nguồn : Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Đây là cấu trúc không gia ba chiều của chuỗi polypeptide trong đó xoắn α của chuỗi polypeptide lại tự xoắn cuộn gập trong không gian, tạo thành hình cầu hay hình elipsoit cho phân tử protêin Dạng cấu trúc bậc III được ổn định nhờ các cầu nối phi peptide như liên kết ion, liên kết hydro gen, liên kết disulfit, liên kết giữa các nhóm kỵ

nước do sức đẩy của dung môi (Hình 2.7)

(I)- Nối tĩnh điện : do sự kết hợp giữa nhóm base và nhóm carbonyl

(II)- Nối Hydrogen : xảy ra giữa nhóm phenolic với nhóm β hay γ carboxyl

(III)- Nối disulfid liên kết giữa hai phân tử sulfur trong vòng xoắn α -helix

(IV)- Nối kị nước : xảy ra giữa 2 nhân vòng chi hoàn hay gốc bên R không phân cực

Và lực Val der Waals : lực này xảy ra giữa mọi phân tử có khoảng cách 1-2 lần đường kính phân tử

ngoài kết hợp với các phân tử nước định cực của dung môi lập nên lớp vỏ thủy hóa ở

bề mặt phân tử protêin

Phân tử protêin ở dạng cấu trúc bậc ba có dạng cầu ổn định, gọi là các tiểu đơn

vị hay đơm hợp – monomer Cấu trúc bậc ba có dạng đặc thù riêng cho từng loại protêin và phù hợp chức năng của chúng Ở các protêin chức năng như enzyme và các kháng thể, protêin của hệ thống đông máu thông qua cấu trúc bậc ba mà hình thành các trung tâm hoạt động, là nơi thực hiện chức năng của protêin ( Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

Rất nhiều trường hợp protêin phải tổ hợp lại mới có hoạt tính sinh học Trong trường hợp này, cấu trúc bậc bốn là điều kiện để hình thành nên tính năng mới cho protêin , làm cho phân tử protêin có khả năng thực hiện những chức rất phong phú của

sự sống

Một trong những cấu trúc bậc bốn đơn giản được nghiên cứu kỹ là cấu trúc bậc bốn của hemoglobin:

Phân tử hemoglobin bao gồm bốn tiểu đơn vị : hai mạch α và hai mạch β Nếu bốn tiểu phần tách rời nhau thì mỗi tiểu phần không thể vận chuyển được một phân tử O2 Khi kết hợp lại thành trạng thái tetramer tạo ra một không gia đặc thù gần như hình tứ diện thì mới có khả năng kết hợp và vận chuyển khí oxy Một phân tử hemoglobin vận chuyển được bốn phân tử O2 ( Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

2.1.7.2.e Domain cấu trúc (Structural domain)

Ở các chuỗi peptide dài thường hình thành các búi hay các quai nhờ các cầu nối disulfit trong chuỗi và được gọi là các domain Các domain cấu trúc nằm trong phân tử protêin được coi như một phân tử protêin nhỏ, hoàn chỉnh và thường là nơi thực hiện chức năng liên kết, chức năng lắp ráp của phân tử protêin lớn trong hoạt động chức năng của nó Sự hình thành các domain trong phân tử protêin tao ra khả năng tương tác linh hoạt giữa các đại phân tử, khả năng cơ động, dịch chuyển tương ứng giữa các

bộ phận trong quá trình thực hiện chức năng sinh học Ví dụ : trong cấu trúc của globulin miễn dịch (immunoglobulin) mỗi vùng biến đổi hay vùng hằng định đều có một domain, độ dài của domain bao gồm khoảng 60 amino acid Như vậy mỗi chuỗi nhẹ có 2 domain và mỗi chuỗi nặng có từ 4 đến 5 domain tùy thuộc lớp globulin miễn dịch

Khi phân tích sự hoạt động của hầu hết các domain đã biết, có thể chia chúng thành ba nhóm :

(1) Protêin nhóm I có những domain cố định nối với nhau bằng những đoạn khá dài

và dẻo của chuỗi peptide cho phép chúng xê dịch trong những khoảng khá rộng

(2) Protêin nhóm II có những domain cố định nối với nhau theoo kiểu ‘bản lề’, nên phạm vi xê dịch rất hạn chế

(3) Protêin nhóm III có tính năng động, có chức năng rất đa dạng

Một điều đáng chú ý là những protêin nguồn gốc khác nhau nhưng có chức năng tương tự thì các domain có cấu trúc tương đối giống nhau ( Nguyễn Phước Nhuận và cộng sự, 2003)

2.1.7.3 Protêin trong latex cao su thiên nhiên

Theo Chen (1995), tổng lượng protêin trong latex tươi xấp xỉ 1-1,5 %, và 20 % trong lượng protêin đó bám trên bề mặt các hạt cao su và một phần tương đương kết hợp vào phần đáy Phần protêin còn lại tan vào môi trường serum Các protêin và lipid cùng bám trên hạt cao su tồn tại trong latex ở dạng thể keo, phần còn lại kết hợp với pha cao su khi latex đông đặc bởi acid trong quá trình sản xuất cao su khô ( cao su tờ, crepe) Khoảng một nủa dịch serum và protêin trong phần đáy và phần còn lại kết hợp với pha cao su trong quá trình đông đặc

Năm 1942, những nghiên cứu cho thấy dịch serum từ latex không được bảo quản có chứa bảy thành phần protêin Bảo quản latex cao su trong vài tháng với amoniac, làm giảm số lượng thành phần xác định được từ bảy xuống còn hai Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó vào năm 1960, đã chứng minh có sự hiện diện của 22 thành phần protêin trong pha serum và có ít nhất tám loại protêin trong phần đáy của latex tươi; một vài thành phần trong số này có thể giống hệt nhau và cùng tan trong pha serum Các điểm đẳng điện của các loại protêin này dao động trong khoảng từ pH

= 3 đến pH = 9

Những protêin bám trên các hạt cao su chưa vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết,

do việc tách rời các protêin này ra khỏi bề mặt hạt cao su gặp rất nhiều khó khăn Tuy nhiên, các phần tử chuyển điện cho thấy rằng các phần tử latex tươi có các điểm đẳng điện trong khoảng pH=4,0 đến pH=4,6, phụ thuộc vào dòng vô tính Sự khác biệt giữa các điểm đẳng điện có lẽ cho biết rằng có hơn một loại protêin bám trên bề mặt hạt phần tử cao su và mối liên hệ giữa các protêin đó là đặc điểm vô tính

2.1.7.3.a α -Globulin và Hevein

Hai protêin (α-Globulin và Hevein) hiện diện trong latex với mật độ cao, được tách rời nhau, làm sạch và những nghiên cứu về tính chất hai loại protêin này thu được một số thông tin α-Globulin là protêin hiện diện với nồng độ cao nhất trong serum latex tươi Nó tan trong những dung dịch muối ở những giá trị pH cách xa điểm đẳng điện của nó (pH=4,55), bị động tụ bởi nhiệt, và bám rất nhanh vào bề mặt các hydrocacbon trong nước Lượng lưu huỳnh bên trong protêin này rất thấp và có hiện hiện diện của một ít phốt-pho Nó bị kết tủa trong dung dịch có giá trị pH gần bằng pH

đẳng điện, chẳng hạn như khi latex bị đông đặc, chỉ yêu cầu nó là trong những protêin bám trên bề mặt phân tử cao su và do đó phần nào là nguyên nhân cho trạng thái keo của latex ( Chen, 1995)

Xấp xỉ 20% vật chất khô trong phần đáy của latex từ cây trưởng thành là protêin tan trong nước, 70 % phần trong số đó là Hevein Điểm đẳng điện của nó là 4,7

và chứa một lượng lưu huỳnh cao khác thường ( khoảng 5 %), về bản chất đó là những góc disulphide trong góc cystine Hevein tan nhanh trong nước với khoảng pH rộng, bao gồm cả điểm đẳng điện của nó, không đông tụ bởi nhiệt, và có khối lượng phân tử khoảng 5000 kDa Những tính chất này cho biết cao su tờ và cao su crepe chứa rất ít Hevein Một loại protêin có tính chất tương tự Hevein, gọi là pseudo-hevein (giả hevein), cũng được phân lập Protêin này có tương đối ít góc anion hơn Hevein và hiện diện với lượng rất nhỏ ( Chen, 1995)

Các amino acid tự do chiếm khoảng 0,1 % trong tổng latex Thật khó biết được đấy có phải là những sản phẩm tiền thân hoặc thoái hóa của protêin hay không Phần lớn các amino aicd là acid glutamic và các góc amid, alanine, aicd aspartic cùng chiếm khoảng 66 % tổng lượng amino acid (trên cơ bản phân tử gam) Trong latex amoniac hóa, sự thủy phân của protêin xảy ra chậm (chậm hơn sự thủy phân của lipid) sinh ra các polypeptide và amino acid ( Chen, 1995)

2.2 Dị ứng latex cao su thiên nhiên

Khi có vật lạ lọt vào cơ thể, hệ miễn nhiễm sẽ được kích hoạt và phản ứng bằng cách sản xuất các kháng thể Các kháng thể này bám vào vật lạ để vô hiệu hóa hoặc

bao vây và tiêu diệt Khi hệ miễn nhiễm hoạt động một cách quá đáng khi gặp những vật lạ vốn vô hại cho cơ thể, phản ứng có thể làm hại thay vì làm lợi cho cơ thể Đó là chứng dị ứng Dị ứng thường chỉ xảy ra cho một số ít người, và các nguyên nhân của

nó được y khoa cho là di truyền hoặc mắc phải bởi một số tác nhân như hóa chất hay virus

Dị ứng với các protein trong LTCSTN là dị ứng loại I, được coi như nghiêm trọng nhất trong 4 (hoặc 5) loại dị ứng Dị ứng loại I gằn liền với một loại kháng thể có tên là Immunoglobulin E Kháng thể này kích hoạt sự phóng thích một số chất làm giãn mạch, tăng thẩm thấu mạch và gây viêm Các triệu chứng thường gặp bao gồm ngứa, nổi "mề đay", sổ mũi, khó thở Các trường hợp cấp tính có thể xảy ra hạ hyết áp, suy hô hấp và do đó, tử vong

Dị ứng LTCSTN là vấn đề dược tranh luận hơn 20 năm Bệnh nhân mắc dị ứng LTCSTN được mô tả vào đầu những năm thập niên 80 Sau đó, các nhà nghiên cứu nhận định rằng sự nhạy cảm với LTCSTN đặc biệt phổ biến trong nhân viên y tế (Health care workers-HCW) và những bệnh nhân mắc tật nứt đốt sống Phép chẩn đoán dị ứng latex cao su thiên nhiên dựa trên kiểm tra vết châm trên da và phép đo kháng thể IgE1 (immunoglobulin E) trong máu Kiến thức về chất gây dị ứng LTCSTN và số lượng của chúng trong sản phẩm cao su thiên nhiên đã đạt được nhiều tiến bộ đáng kể trong vài năm gần đây Tuy nhiên, vẫn còn vài tranh luận về chất gây

dị ứng trong LTCSTN là gì và nhiều điều vẫn chưa sáng tỏ, hầu như không thể biết được cơ cấu của tế bào và phân tử bên trong chất gây dị ứng LTCSTN (Maili Lehto, 2007)

2.2.1 Những nhóm thường gặp và rủi ro

Sự đánh giá dị ứng LTCSTN trong dân cư nói chung thay đổi rất rộng, từ thấp hơn 1 % cho đến 12 % Trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe, những nhóm rủi ro mắc dị ứng LTCSTN là nhân viên y tế và bệnh nhân điều trị lâu dài Hơn 22 % là nhân viên y

tế và 60% là trẻ em mắc tật nứt đốt sống lưng được cho là nhạy cảm với LTCSTN Một phân tích gần đây so sánh sự thường gặp của dị ứng LTCSTN trong nhân viên y

1 IgE ( Immunoglobulin E) là 1 trong những loại kháng thể có trong máu, thuộc hệ miễn nhiễm Kháng thể là những cấu tạo giúp chống lại những xâm nhập gây phản ứng cho cơ thể con nguờì thí dụ nhiễm trùng, dị ứng Có nhiều loại kháng thể khác nhau như: IgA, IgD, IgM, IgG, IgE

Riêng IgE thường tăng cao khi có tình trạng liên quan đến dị ứng như : hen phế quản ( suyển ), viêm da dị ứng (

tế và trong cộng đồng dân cư cho thấy dị ứng LTCSTN trong nhân viên y tế là 4,3 %

và trong dân cư là 1,4 % Sự nhạy cảm với LTCSTN ngày càng trở nên phổ biến, khi

kết quả dương tính phép kiểm tra SPT (skin prick testing) thay đổi từ 6,9 % lên 7,8 %

trong nhân viên y tế và từ 2,1 % lên 3,7 % trong dân cư Nhân viên y tế nhạy cảm với

LTCSTN hay dị ứng dễ mắc phải chứng viêm da tay, bệnh hen hay thở khò khè và

viêm màng kết mũi Các nghiên cứu gần đây từ Đức và Ý cho thấy rằng kiến thức về

dị ứng LTCSTN kêt hợp với sử dụng găng tay cao su thiên nhiên đã loại protêin đã

giảm đi số lượng nhân viên y tế dễ nhạy cảm với dị ứng (Maili Lehto, 2007)

Ngày nay, những sản phẩm LTCSTN được xem là nguồn gốc của chất gây dị

ứng Găng tay LTCSTN, các loại bóng, bao cao su, núm vú cho trẻ em và bình chứa

nước nóng có thể gây ra phản ứng dị ứng

2.2.2 Triệu chứng

Triệu chứng của dị ứng LTCSTN thay đổi từ những dấu hiệu đặt trưng đến

những phản ứng mãnh liệt trên cơ thể Phản ứng phổ biến nhất là mề đay do tiếp xúc

(Bảng 2.3) Triệu chứng thể hiện ngay sau vài phút tiếp xúc với một găng tay hay sản

phẩm LTCSTN nào đó và biến mất sau thời gian khoảng 30 phút Sưng tấy và ngứa là

những triệu chứng hay gặp do tiếp xúc với LTCSTN ở miệng, âm đạo, trực tràng

Những phản ứng trên cơ thể như mề đay toàn thân và nổi mẫn có thể xuất hiện sau khi

phơi da ra (Maili Lehto, 2007)

2.2.3 Những chất gây dị ứng latex cao su thiên nhiên

Ngày 20/2/2006, Ủy ban hóa học dị ứng WHO/IUS đã công bố 13 loại hợp chất

protêin gây dị ứng trong LTCSTN, với tính chất ở cấp độ phân tử

Bảng 2.4 : Protêin gây dị ứng trong LTXCSTN từ giống Hevea brasiliensis

Dị ứng

nguyên Tên thông thường Khối lượng phân tử (kDa)

Hev b 1 Chất gây đàn giãn trong cao su 58

(Nguồn : Maili Lehto, 2007)

2.3 Phương pháp phân tích protêin trong latex

Các phương pháp định lương protêin có thể phân loại thành phương pháp hóa

học và phương pháp miễn dịch học các phương pháp này được thảo luận sau đây

2.3.1 Phương pháp hóa học (Chemical Methods)

Hiện tại có rất nhiều phương pháp về định lượng và nghiên cứu protêin trong

dung dịch Các phân tích được sử dụng phổ biến gồm có Kjeldalh, Lowry, Bradfor,

Biuret Các phương pháp hóa học sử dụng trong phân tích protêin LTCSTN được tóm

lược như sau

2.3.1.1 Phương pháp Kjeldalh

Phương pháp Kjeldalh được sử dụng phổ biến trong xác định hàm lượng nitơ

tổng Phương pháp này có độ chính xác cao và có thể tái lập lại, nhưng tốn rất nhiều

thời gian và quan trọng hơn hết là phương pháp này không nhạy đối với nồng độ

protêin thấp Mẫu bị phân hủy bởi acid sulphuric đậm đặc đun sôi có sự hiện diện của

sodium sulphate và xúc tác selenium Sự phân hủy làm biến đổi tất cả nitơ hữu cơ

thành ammonia, và bị bẫy lại dưới dạng ammonium sulphate Ammonia sẽ giải phóng khi thêm vào dư dung dịch sodium hydroxide, bị thu hồi trong dung dịch acid boric và được chuẩn độ bằng dung dịch aicd hydrocloric chuẩn Mặc dù phương pháp này chính xác và có thể tái lập lại, nhưng với nitơ trong các chất ô nhiễm chẳng hạn như DNA, làm cho việc định lượng phức tạp hơn Trọng thực tế, hàm lượng nitơ của protêin thông thường chiếm khoảng 16% khối lượng nitơ tổng Hiện tại, phương pháp

này không được sử dụng rộng rãi ( Aprem A S và Pal S N., 2002)

2.3.1.2 Phương pháp Bradford

Năm 1976, Bradford đưa ra một phương pháp định lượng protein, sử dụng nguyên tắc kết dính thuốc nhuộm (thuốc thử Bradford) với protêin cho ra phản ứng màu Hợp chất Coomassie Brilliant Blue G (C41H44N3NaO6S2) được sử dụng trong phương pháp này và tỉ lệ mẫu : thuốc nhuộm là 1:9 Để định lượng protêin phải trộn mẫu với thuốc nhuộm theo tỉ lệ trên Sau khi trộn 10 phút, tiến hành đo hấp thu ở bước sóng 595 nm ( Aprem A S và Pal S N., 2002)

Thuốc thử Bradford được chuẩn bị bằng cách hòa tan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50 ml etanol 95 % Thêm 100ml dung dịch acid photphoric

85 % và pha loãng đến một lít

2.3.1.3 Phương pháp Biuret

Phương pháp này gồm một thuốc thử đồng trong môi trường kiềm, gây ra phản ứng tạo màu tím với protêin Lí do nguyên tắc này không được sử dụng rộng rãi vì độ nhạy thấp, không thể cho kết quả chính xác với mẫu có hàm lượng vài miligram protêin Phương pháp này cho kết quả đo lường chính xác khi có sự khác biệt trong sự phát sinh màu từ protêin đến protêin Bởi vì thuốc thử đồng cho phản ứng mạnh với chuỗi peptide hơn các nhóm bên cạnh Amomonia gây nhiễu khi tạo phức hợp với đồng, nên những lượng nhỏ ammonium sulphate cũng không cho kết quả chính xác

Độ nhạy chủa phản ứng Biuret đạt được khi quan sát phức hợp đồng - protêin không phải ở bước sóng 540 nm, mà phải quan sát ở bước sóng 310 nm gần vùng tử ngoại Đáng tiếc, phương pháp này cần vài khoảng trắng để loại trừ sự hấp thu không xác thực ở bước sóng 310 nm Nên phương pháp này không được sử dụng rộng rãi ( Aprem A S và Pal S N., 2002)

2.3.1.4 Phương pháp Lowry

2.3.1.4.1 Phân tích Lowry cổ điển (The loyal Lowry tests)

Phương pháp lowry định lượng nồng độ protêin về bản chất là một phản ứng màu, sử dụng thuốc thử Folin để làm tăng cường độ màu Quy trình Lowry được sử dụng khá phổ biến trong phân tích nghiên cứu vì nó có độ gấp mười lần phản ứng màu Trong quy trình Lowry, đầu tiên protêin được xử lý bởi môi trường kiềm Đồng Sulfate với sự hiện diện của Tartrate Đây là giai đoạn ủ, sau đó thuốc thử Folin phenol được cho vào Kết quả cho thấy, trong quy trình Lowry, phản ứng màu xuất hiện có xu hướng tăng khi phức hợp đồng tetradentate chuyển electron cho hỗn hợp acid Phospho-molybdic/Phosphotungstic (Mn+6/W+6, thuốc thử Folin phenol) Nồng độ thuốc thử Folin phenol cho màu xanh ở bước sóng 750 nm

Mặc dù, phương pháp Lowry mang tính chất đặc biệt của thí nghiệm hóa sinh điển hình và là tiêu chuẩn định lượng protêin, phương pháp này còn được quan tâm do những mặt khuyết của nó Ví dụ, thuốc thử đồng trong môi trường kiềm sẽ không bền

và yêu cầu phải chuẩn bị mỗi ngày với nhiều bước tiến hành tốn thời gian và chuyên sâu Hơn thế nữa, thí nghiệm khá nhạy cảm với ánh sáng Trên thực tế, cần phải ngăn chặn những nguồn sáng ảnh hưởng đến quy trình

Đã có những báo cáo về một vài sự cải tiến từ quy trình Lowry cổ điển Ví dụ, những cái tiến giúp cho quy trình đơn giản hơn hay những cải tiến về : độ nhạy, độ ổn định và tính chất hóa học của sự phát sinh màu, độ ổn định của phản ứng màu và tốc

độ phản ứng Những cải tiến khác cũng được đề cập về những hợp chất gây nhiễu cho phân tích mẫu protêin khi có mặt các vật liệu sinh học chẳng hạn như lipid

Những hợp chất được cho là gây nhiễu cho thí nghiệm Lowry bao gồm : chất tẩy, carbonhydrate, glycerol, Tricine, EDTA, hợp chất chứa Kali và lưu huỳnh, magie

và canxi Những thí nghiệm dùng các hợp chất oxalate trong phương pháp Lowry, đã giảm được những sai lệch do chất gây nhiễu Ca2+ gây ra Thí nghiệm với natri oxalate ((COO)2Na2) đã giảm được 70 - 95 % sai lệch

2.3.1.4.2 Phân tích Lowry cải tiến (The Modified Lowry tests)

Trong phân tích Lowry cải tiến, protêin trích được kết tủa bởi acid để có thể tách rời chúng ra khỏi các hợp chất gây nhiễu tan trong nước Protêin kết tủa được hòa tan lại trong môi trường kiềm và định lượng bằng thiết bị đo màu (quang phổ kế) sau

khi các phản ứng đồng/Folin cho màu xanh đặc trưng Trong suốt quá trình định lượng, một vài hợp chất có thể gây nhiễu cho sự phát triển màu, nhưng những năm gần đây, những cải tiến trong dây chuyền sản xuất găng tay và cho ra các sản phẩm găng tay không sử dụng chất bôi trơn bằng bột đã làm giảm mức protêin và hiện tượng gây nhiễu bởi các hợp chất hóa học Năm 2001, 83.8 % trong số 130 nơi sản xuất găng tay khác nhau (có và không sử sũng chất bôi trơn bằng bột) đều có nồng độ protêin dưới

30 μ g/g

Phân tích Lowry cải tiến, giới hạn định lượng là 1,0 μ g/g phần chiết Do tính chất đơn giản, đáng tin cậy và hữu dụng, phương pháp Lowry là một phương pháp phổ biến cho việc kiểm tra protêin hằng ngày

2.3.2 Phương pháp miễn dịch học (Immunological Methods)

2.3.2.1 Phân tích hấp thu miễn dịch – phóng xạ (Phân tích RAST)

Phân tích RAST là những kỹ thuật rất nhạy, sử dụng đồng vị phóng xạ gọi là anti-IgE, định lượng kháng thể IgE đặt trưng có trong huyết thanh bệnh nhân Phân tích RAST trong latex sử dụng để định lượng nếu có sự hiện diện của các kháng thể IgE đặc trưng trên protêin latex và định lượng sơ bộ tổng số IgE hiện diện Phân tích này được sử dụng chủ yếu như một kiểm tra chẩn đoán dị ứng LTCSTN

Phân tích RAST có thể được thực hiện như một phân tích cạnh tranh (phân tích cản trở RAST), định lượng tổng số dị ứng nguyên trong phần chiết latex Trong phân tích này, trong phần chiết latex, các dị ứng nguyên có thể tan được cạnh tranh gắn vào các IgE đặc trưng trong huyết thanh những người mắc chứng dị ứng latex Khi các dị ứng nguyên phản ứng với IgE, các kháng thể bị cản trở do kết dính vào pha rắn dị ứng nguyên latex đã chuẩn bị từ trước Tổng số kháng thể bị cản trở phản ánh lượng dị ứng nguyên có trong phần chiết Phân tích cản trở RAST là một phương pháp rất nhạy để định lượng dị ứng nguyên latex Tuy nhiên, nó phụ thuộc vào mẫu huyết thanh của từng người IgE của người phản ứng lại protêin trong latex không đồng nhất, do đó cần một mẫu lớn huyết thanh của người nhằm chắc chắn bao gồm tất cả các dị ứng nguyên

có liên quan Hơn nữa, phân tích này cần sự đề phòng đặc biệt vì sử dụng huyết thanh ngươi và các đồng vị phóng xạ (Aprem A S và Pal S N., 2002)

2.3.2.2 Phân tích hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme trên protêin gây dị ứng trong latex (Phân tích LEAP)

Phân tích LEAP là một công cụ hữu dụng cho việc định lượng protêin kháng nguyên trong phần chiết latex Phân tích ELISA gần giống như phân tích RAST Tuy nhiên, nguồn và khối lượng huyết thanh miễn dịch có thể điều chỉnh được Khi kiến thức về dị ứng LTCSTN ngày càng mở rộng, các thủ tục về kiểm tra protêin chiết xuất được phát triển dựa trên phân tích LEAP Để đo được hàm lượng protêin trong phần chiết, có rất nhiều thông số phải được đánh giá Phân tích ELISA cung cấp một phương pháp nhạy không những để định lượng tổng lượng protêin trong latex mà còn

đo được protêin phản ứng miễn dịch trong latex (Aprem A S và Pal S N., 2002)

2.3.2.3 Phân tích cản trở ELISA sử dụng những kháng thể đơn dòng

Sử dùng cung nguyên tắc như thí nghiệm cản trở ELISA, nhưng thay vì sử dụng kháng thể của bệnh nhân, người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng cho bốn loại protêin latex hevien khác nhau Từ khi nhiều dị ứng nguyên chưa thể nhận biết được không được để ý và các dị ứng nguyên mới chưa được tìm ra, thì thí nghiệm này chỉ phát hiện ra một vài dị ứng nguyên đã biết Tuy nhiên, thí nghiệm này có ý nghĩa về phương diện lâm sàng khi đo lường được các dị ứng nguyên đã biết Các ý kiến cho rằng phân tích định lượng tổng lượng protêin sẽ thích hợp cho việc phòng ngừa các dị ứng nguyên, hơn là một phân tích bỏ qua hầu hết các dị ứng nguyên mới và có khả năng nhận biết được Giới hạn phát hiện bốn loại protêin nằm trong khoảng 0,1 - 2,3

μ g/ml

2.4 Tình hình nghiên cứu các phương pháp khử protêin trong latex cao su thiên nhiên

Latex từ cây cao su Hevea brasiliensis là một chất lỏng gần như thể keo trong

nước, chứa 30 - 35 % phân tử cis-1,4-polyisoprene và chứa xấp xỉ 5 % các hợp chất phi cao su protêin, lipid, hoáng và cacbohydrate… Các sản phẩm từ LTCSTN đã gây

ra dị ứng cho người sử dụng, nguyên nhân đã được xác định do lượng protêin trích có thể hòa tan trong nước của sản phẩm, khi tiếp xúc với da gây ra các phản ứng dị ứng

Do đó khử protêin trong latex cũng như các sản phẩm từ LTCSTN, phải được thực hiện nhằm làm giảm hoặc loại bỏ các tác nhân gây dị ứng trên da ( Seneviratne W.M.G và cộng sự, 2005)

Trong những năm qua, các nghiên cứu về phương pháp khử protêin trong LTCSTN đã được thực hiện Các phương pháp khử protêin được thực hiện đồng thời trên latex và sản phẩm từ LTCSTN

cô đặc lại được pha loãng với nước và quá trình ly tâm được lập lại nhiều lần

(b) Phân giải protein bằng enzyme: Một enzyme thuộc loại proteolytic được cho vào latex để phân giải protein có trong latex, có mặt hoặc không có mặt một chất hoạt động bề mặt

(c) Tách protein bằng liên kết hóa học: Một số chất hóa học (ví dụ polyvinyl alcohol) được cho vào LTCSTN Liên kết hóa học sẽ được tạo thành giữa protein và hóa chất được cho vào Sau đó latex được đem cô đặc bằng phương pháp ly tâm Lực

ly tâm sẽ tách hóa chất cho vào ra khỏi latex, kéo theo protein

(d) Vô hiệu hóa protein bằng liên kết hóa học: Một số chất hóa học (ví dụ chất chứa nhóm aldehyde, các halogen, một số kim loại) được cho vào latex để tạo liên kết hóa học với protein Protein được liên kết sẽ vẫn có mặt trong latex, nhưng không còn khả năng gây dị ứng

(e) Thay thế protein bằng fumed silica: Fumed silica được cho vào latex Do cơ chế chưa được biết rõ, fumed silica thay chỗ của protein trên bề mặt hạt cao su Protein

do đó dẽ thoát ra trong quá trình ngâm rửa sản phẩm về sau

Khử protein trong sản phẩm từ LTCSTN

Các phương pháp đã được nghiên cứu hoặc được áp dụng trong sản xuất nhằm làm giảm hàm lượng protein trích trong sản phẩm từ LTCSTN gồm có:

(a) Xử lý chlorine: Ôxy hóa protein trong sản phẩm bằng chlorine

(b) Che phủ bằng vật liệu khác: Các lớp phủ bề mặt bên trong hoặc bên ngoài sản phẩm được tạo thành từ các polymer không phải là LTCSTN (ví dụ polyurethane, polyethylene, polyacrilamide), nhằm ngăn chận sự khuếch tán protein ra ngoài mặt sản phẩm khi đang sử dụng

(c) Phân hủy protein bằng bức xạ: Sản phẩm từ latex được chiếu xạ bằng tia gamma Đồng thời với sự thực hiện quá trình lưu hóa, tia gamma sẽ phân hủy protein

có trong latex

(d) Ngâm rửa: Sản phẩm từ LTCSTN được ngâm rửa (rinsed) một hay nhiều lần trong các dung dịch có chứa một số hóa chất (ví dụ sodium chloride, silicate, ethanol) để tách protein ra khỏi sản phẩm, có mặt hoặc không có mặt một enzyme thuộc loại proteolytic.’

Trong giới hạn của đề tài, nhằm đánh giá hiệu quả khử protêin và tính chất cơ

lý của sản phẩm sau khử protêin của các nghiên cứu đi trước, các phương pháp khử protêin sau đây đã được thí nghiệm trong đề tài

2.4.1 Phương pháp khử protêin trong giai đoạn latex

Phương pháp vật lý : Gia công ly tâm để loại protêin – Thực hiện ly tâm mủ nước hoặc latex, phần kem thu được có hàm lượng protêin trích giảm đáng kể so với trước ly tâm Trong quá trình thực hiện ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, protêin hòa tan trong pha serum bị loại khỏi latex Có thể, pha loãng phần kem thu được sau ly tâm, tiếp tực ly tâm nhiều lần để loại lượng protêin còn lại

Phương pháp hóa học : Theo các nghiên cứu đã công bố, (a) các phân tử protêin bán trên bề mặt hạt cao su, có thể bị biến tính bởi urea và tách hỏi bề mặt hạt cao su, di chuyển vào pha serum (b) các phân tử protêin này tạo liên kết với dung dịch polymer tan trong nước ( PVA – Polyvinyl Acohol)

Với Urea : Về bản chất, khử protêin LTCSTN đề cập đến những phương pháp

làm thế nào điếu chỉnh tương tác giữa cao su và protêin trong latex, đó là tương tác vât

lí và tương tác hóa học Urea có chức năng vừa tương tác với protêin vừa tạo cầu nối hydrogen với nước Các phân tử protêin gắn trên hạt cao su bằng tương tác vật lí tại những khoảng cách nhỏ giữa các lipid trên bề mặt hạt cao su Có thể loại bỏ được các protêin này sau khi làm biến tính thay đổi hình thể của protêin bằng urea qua sự tương tác của urea với protêin và sự thành lập các cầu nối hydrogen với nước

Với PVA : Polyvinyl alcohol là một polymer tan trong nước có tác dụng làm

tăng độ sánh cũng như độ ổn định cơ học MST ( Mechanical Stabitily ) của latex Khả năng tạo liên kết giữa PVA và protêin trong latex được giải thích do các góc hydroxyl

của PVA tạo liên kết hydrogen với các góc carbonyl của protêin Kết quả, PVA bao phủ các protêin hiện diện trong latex và được loại bỏ qua quá trình ly tâm

2.4.2 Phương pháp khử protêin trong giai đoạn sản phẩm

Phương pháp ngâm rửa : Các nghiên cứu cho thấy rằng lượng protêin trích còn lại trên bề mặt sản phẩm từ latex tập trung ở mặt ngoài ( hoặc mặt không tiếp xúc với khuôn trong quá trình sản xuất ), phần lớn là do sự dịch chuyển của các protêin hoàn tan vào sản phẩm trong quá trình tạo sản phẩm Sự dịch chuyển này bắt đầu khi sản phẩm ở trạng thái gel ướt và tiếp tục trong suốt quá lưu hóa và sấy trong lò lưu hóa Thực hiện ngâm rửa sản phẩm trong các dung dịch Chlorine, NaCl ở trạng thái trước

và sau lưu hóa sẽ cho kết quả tách đáng kể lượng protêin còn lại

Tóm lại, các phương pháp khử protêin trong luận văn này được bố trí thí nghiệm và thực hiện theo các thí nghiệm đã được nghiên cứu Kết quả thu được từ các thí nghiệm dùng để đánh giá hiệu quả khử protêin, cũng như ảnh hưởng cường lực của sản phẩm trong từng phương pháp

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu

3.1.1 Hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình

Mua mủ ly tâm HA được cung cấp từ Công ty Cao su Phước Hòa, tỉnh Bình Dương Tổng khối lượng cho mỗi nghiệm thức : 15 lít Có thể mua một lần và tồn trữ trong thời gian thí nghiệm hoặc mua làm nhiều lần Các nghiệm thức khử protêin trong giai đoạn latex sử dụng mủ ly tâm đã khử protêin (mủ cô đặc) để chuẩn bị hỗn hợp sản phẩn nhúng điển hình, nên mủ ly tâm cần phải gia công ly tâm để loại protêin

Hỗn hợp sản phẩm nhúng được chuẩn bị gồm: Tính theo trọng lượng ướt ( wet weight (kg)):

-Mủ ly tâm đã khử hoặc chưa khử protêin (167 phần tính theo trọng lượng ướt) -Potassium laurate 20% (2)#

-Chất phân tán: Tamol 20% : 0,3 và Gum Arabic 20% : 0,2

#: Chuẩn bị Potassium laurate:

- 39.2 g nước cất được đun nóng lên đến 75 0 C cho từ từ 16.8 g Lauric acid vào khuấy

ở tốc độ cao ( khỏang 200 vòng/phút)

- 4.8g potassium hydroxide + 39.2 g nước cất khuấy đều, sau đó nhỏ từ từ vào dung dịch ở trên

- Cho tất cả các hóa chất như trên vào khuấy trộn Sau đó cho vào máy nghiền bi trong

5 ngày với tốc độ quay 75 vòng /phút

- Trộn hỗn hợp đơn pha chế: mủ ly tâm + hỗn hợp huyền phù + KOH + nước, sau đó khuấy đều trong 60 phút

- Ủ mủ trong 16 giờ

- Lọc mủ tránh bọt khí trước khi nhúng

3.1.2 Chuẩn bị dung dịch đông tụ

Dung dịch đông tụ được chuẩn bị với calcium nitrate ngậm nước cùng với calcium carbonate

Dung dịch đông tụ được chuẩn bị bằng

+ Ca(NO3)2.4H2O 43,5 %: Chất đông kết của hỗn hợp latex: 5

3.2.1 Thí nghiệm các phương pháp khử protêin trong giai đoạn latex

Nghiệm thức 1: khử protêin trong giai đoạn latex bằng PVA

Khuấy đều mủ ly tâm trong bình chứa và lấy ra 1 lít cho vào vật chứa (bằng nhựa PE hoặc bằng thủy tinh) có dung tích 2 lít, gọi là 1 mẻ Chuẩn bị dung dịch PVA 10% bằng cách cho PVA vào nước cất và khuấy đều Cho 180 g dung dịch PVA 10% vào từng mẻ mủ ly tâm (3% PVA so với hàm lượng cao su khô trong mẻ) và khuấy

Khuôn là miếng thủy tinh

ở 1000C trong 210 s

Nhúng khuôn đã khô vào dung dịch đông tụ 60s

Cho khuôn vào sấy ở

đều trong 15 phút Để yên mẻ trong 24 giờ Cho 820 ml nước sạch vào mẻ mủ ly tâm

đã để yên trong 24 giờ Khuấy đều Gia công trên máy ly tâm ở tốc độ ly tâm là 5000 x

g trong 30 phút để thu được mủ ly tâm đã khử protêin, có hàm lượng cao su khô (DRC) khoảng 60% Dùng mủ mủ ly tâm đã khử protêin này để chuẩn bị hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình, sau đó tạo màng cao su và lưu hóa trong tủ sấy ở 120 oC trong

15 phút

Nghiệm thức 2 : khử protêin trong giai đoạn latex bằng urea

Khuấy đều mủ ly tâm trong bình chứa và lấy ra 1 lít cho vào vật chứa (bằng nhựa PE hoặc bằng thủy tinh) có dung tích 2 lít, gọi là 1 mẻ Cho 10 g urea và 10 g sodium dodecyl sulphate vào từng mẻ mủ ly tâm (1% urea và 1% sodium dodecyl sulphate so với trọng lượng mủ ly tâm trong mẻ) và khuấy đều trong 20 phút Để yên

mẻ trong 60 phút Cho 1 lít nước sạch vào mẻ mủ ly tâm đã để yên trong 60 phút Khuấy đều Gia công trên máy ly tâm ở tốc độ ly tâm là 5000 x g trong 30 phút để thu được mủ ly tâm đã khử protein, có hàm lượng cao su khô (DRC) khoảng 60% Dùng

mủ ly tâm đã khử protêin này để chuẩn bị hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình, sau đó tạo màng cao su và lưu hóa trong tủ sấy ở 120 oC trong 15 phút

Nghiệm thức 3 : đối chứng

Khuấy đều mủ ly tâm trong bình chứa và lấy ra 1 lít cho vào vật chứa (bằng nhựa PE hoặc bằng thủy tinh) có dung tích 2 lít, gọi là 1 mẻ Cho 1 lít nước sạch vào từng mẻ mủ ly tâm Khuấy đều Để yên trong 60 phút, gia công trên máy ly tâm ở tốc

độ ly tâm là 5000 x g trong 30 phút để thu được mủ ly tâm đã khử protêin, có hàm lượng cao su khô (DRC) khoảng 60% Dùng mủ ly tâm đã khử protêin này để chuẩn bị hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình, sau đó tạo màng cao su và lưu hóa trong tủ sấy ở

120 oC trong 15 phút

3.2.2 Thí nghiệm các phương pháp khử protein trong giai đoạn sản phẩm

Nghiệm thức 1 : khử protêin trong giai đoạn sản phẩm trước lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch chlorine

Khuấy đều mủ ly tâm trong bình chứa và lấy ra 1 lít cho vào vật chứa (bằng nhựa PE hoặc bằng thủy tinh) có dung tích 1 lít, gọi là 1 mẻ Dùng mủ ly tâm này để chuẩn bị hỗn hợp sản phẩm nhúng điển hình, sau đó tạo màng cao su Cho 10,5 g NaOCl vào bồn gia nhiệt chứa 5 lít nước sạch (để đạt nồng độ 0,1% tính theo Cl) và

khuấy đều Gia nhiệt cho nước trong bồn lên đến 60oC Cho màng cao su chưa lưu hóa vào bồn và để yên trong khoảng 20 phút Lấy màng cao su ra khỏi bồn Màng được làm khô trong tủ sấy ở 60 oC trong 1 giờ, sau đó tiếp tục được lưu hóa trong tủ sấy ở

oC trong 15 phút Cho 10,5 g NaOCl vào bồn gia nhiệt chứa 5 lít nước sạch (để đạt nồng độ 0,1% tính theo Cl) và khuấy đều Gia nhiệt cho nước trong bồn lên đến 60oC Cho màng cao su đã lưu hóa vào bồn và để yên trong khoảng 20 phút Lấy màng cao

su ra khỏi bồn Màng được trong tủ sấy ở 60 oC trong 1 giờ

Nghiệm thức 4 : Khử protêin trong giai đoạn sản phẩm sau lưu hóa bằng ngâm rửa trong dung dịch NaCl

Tạo màng cao su rồi đem lưu hóa nghiệm thức 3 trong quy trình của thí nghiệm này Cho 100 g NaCl vào bồn gia nhiệt chứa 5 lít nước sạch (để đạt nồng độ 2 %) và khuấy đều Gia nhiệt cho nước trong bồn lên đến 60 oC Cho màng cao su đã lưu hóa vào bồn và để yên trong khoảng 20 phút Lấy màng cao su ra khỏi bồn Màng được làm khô trong tủ sấy ở 60 oC trong 1 giờ

Nghiệm thức 5 : nghiệm thức đối chứng