Xây dựng công tác xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN LỆ HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN LỆ HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHĨM HẠ HUYẾT ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐƠNG DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 8720210 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người hướng dẫn bảo tơi tận tình suốt q trình nghiên cứu, hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ths Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương giúp đỡ q trình nghiên cứu, thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Công ty cổ phần Traphaco giúp đỡ tơi q trình tạo mẫu nghiên cứu Tôi xin gửi lời chân thành cám ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ mơn Hóa Phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia tạo điều kiện cho tơi q trình học tập làm luận văn Cuối xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln khích lệ, tạo động lực cho tơi q trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên Trần Lệ Hoa MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Phần : TỔNG QUAN 1.1 Tình hình trộn chất tân dược chế phẩm đông dược 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tình hình Việt Nam 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Amlodipin besylat 1.2.2 Nifedipin 1.2.3 Valsartan 10 1.2.4 Felodipin 11 1.3 Các nghiên cứu xác định thuốc hạ huyết áp trộn trái phép vào chế phẩm Đông Dược 12 1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 14 1.4.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 14 1.4.2 Phương pháp HPLC 15 Phần : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 19 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Chế tạo mẫu 20 2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21 2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 22 2.2.5 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành thị trường 22 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 Phần : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24 3.1 Chuẩn bị mẫu 24 3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 25 3.2.1 Xây dựng phương pháp HPLC 25 3.2.2 Xây dựng phương pháp HPTLC 29 3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32 3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 36 3.5 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành thị trường 49 3.5.1 Kết phân tích mẫu thực HPTLC 50 3.5.2 Kết phân tích mẫu thực phương pháp HPLC 52 Chương : BÀN LUẬN 54 4.1 Tạo mẫu 54 4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 54 4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 54 4.2.2 Xây dựng phương pháp sắc ký 55 4.2.3 Lựa chọn xử lý mẫu 56 4.3 Thẩm định phương pháp 57 4.4 Ứng dụng 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AML Amlodipin Besylat AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức (Association of Official Analytical Chemists) FEL Felodipin HPLC HPTLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc kí lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) ICH International Conference on Harmonisation LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) Max Maximum (Lớn nhất) Min Minimum (Nhỏ nhất) NIF Nifedipin RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) TB Trung Bình TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe VAL Valsartan VKN Viện Kiểm nghiệm WHO Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu 24 Bảng 3.2: Kết khảo sát thành phần pha động HPLC 26 Bảng 3.3: Kết khảo sát dung môi chiết (n=3) 35 Bảng 3.4: Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống 36 Bảng 3.5: Kết xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng AML, NIF, VAL, FEL HPLC 39 Bảng 3.6: Kết đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính 40 Bảng 3.7: Kết đánh giá độ độ lặp lại (phương pháp HPLC) 43 Bảng 3.8: Kết đánh giá độ lặp lại khác ngày (phương pháp HPLC) 44 Bảng 3.9: Kết xác định LOD phương pháp HPTLC 49 Bảng 3.10: Kết phân tích mẫu ứng dụng phương pháp HPLC 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Công thức cấu tạo amlodipin besylat Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo nifedipin Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo valsartan 10 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo felodipin 11 Hình 1.5: Sơ đồ hệ thống HPLC 16 Hình 3.1: Sắc ký đồ phân tích chất với pha động MeOH : Dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (55 – 45) 27 Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký 28 Hình 3.3: Phổ hấp thụ UV chất nghiên cứu 28 Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC 30 Hình 3.5: Sắc ký đồ lựa chọn hệ pha động HPTLC 31 Hình 6: Sắc ký đồ phát 366 nm 32 Hình 3.7: Kết khảo sát lựa chọn dung môi chiết 33 Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp (238nm) 38 Hình 3.9: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp (360 nm) 38 Hình 3.10: Sắc ký đồ LOD AML, NIF nồng độ 0,5µg/ml (nền N03) 39 Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ AML, NIF, VAL, FEL 41 Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp HPTLC 46 Hình 3.13: Sắc ký đồ xác định giới hạn phát phương pháp HPTLC 48 Hình 3.14: Sắc ký đồ analog xác định LOD phương pháp HPTLC 49 Hình 3.15: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực phương pháp HPTLC 51 Hình 3.16: Sắc ký đồ phổ UV mẫu chuẩn mẫu M05 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo công bố Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2000, tồn giới có tới 972 triệu người bị tăng huyết áp (THA) số ước tính vào khoảng 1,56 tỷ người vào năm 2025 Tại Việt Nam, năm 2000 có khoảng 16,3% người lớn bị THA, đến năm 2009 tỷ lệ THA người lớn tuổi 25,4% năm 2016 tỷ lệ người lớn tuổi bị THA mức báo động 48%, mức báo động đỏ thời điểm [16] Cùng với tỷ lệ người mắc bệnh tăng huyết áp ngày cao nhu cầu sử dụng thuốc hạ huyết áp ngày lớn Phác đồ điều trị thuốc hạ huyết áp thường xuyên liên tục, dẫn đến lo ngại người dùng tác dụng phụ thuốc hóa dược gây Xu hướng người sử dụng thường tìm với sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược Trên thị trường, có nhiều chế phẩm đơng dược có tác dụng điều trị hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp bệnh liên quan đến tăng huyết áp (tai biến mạch máu não, nhồi máu tim,…) lưu hành để đáp ứng nhu cầu người bệnh Tuy nhiên, với mục đích nâng cao lợi nhuận có số đơn vị sản xuất trộn thuốc tân dược vào chế phẩm thuốc đông dược hay thực phẩm bảo vệ sức khỏe Đã có nhiều cơng bố giới phát số thuốc hạ huyết áp amlodipin, nifedipin, valsartan, hydrochlorothiazid, clonidin,… thêm bất hợp pháp vào chế phẩm đông dược [32], [41], [23],[36] Sự gian lận thực nhằm tạo khả trị liệu từ thành phần khai báo Đây vấn đề đáng lo ngại Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu phát thuốc hóa dược trộn khơng khai báo sản phẩm Đông dược, chủ yếu tập trung vào nhóm thuốc glucocorticoid, thuốc chống viêm khơng steroid, thuốc giảm hạ glucose máu, thuốc giảm béo, thuốc ức chế PDE -5,… [2], [9], [10], [13], [15], chưa công bố nghiên cứu việc trộn lẫn nhóm thuốc hạ huyết áp thuốc đơng dược thực phẩm chức Phương pháp hay sử dụng 13/03/2018 4:40:41 CH Page / Peak# Total Name Ret Time 4.575 7.225 PDA Ch2 360nm Peak# Name Ret Time 6.032 7.228 Total Area 58516 114398 172913 Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) 6158 5614 -6890 4582 7.896 13047 Area 3976 40168 44144 Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) 287 5130 -2494 4750 3.163 2781 D:\HPLC\VAIDATION\2018\HoaCH21\06032018\ung dung\UD thu 9.lcd 25/03/2018 11:09:35 SA Page / Analysis Report Sample Name Sample ID Data Filename Method Filename Batch Filename Vial # Injection Volume Date Acquired Date Processed : M10 : : M10.lcd : huyetap.lcm : 07032018.lcb : 1-17 : 10 uL : 07/03/2018 5:24:03 CH : 13/03/2018 4:41:29 CH Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 5.280 PDA Multi 238nm,4nm 150 7.422 100 50 0 10 15 20 25 30 35 40 mAU PDA Multi 360nm,4nm 7.423 75 50 12.021 13.198 25 0 10 15 20 25 30 35 40 PDA Ch1 238nm D:\HPLC\VAIDATION\2018\HoaCH21\06032018\ung dung\UD thu 10.lcd 25/03/2018 11:09:35 SA Page / Peak# Total Name Ret Time 5.280 7.422 PDA Ch2 360nm Peak# Name Ret Time 7.423 12.021 13.198 Total Area 2269971 958540 3228511 Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) 151200 2799 -45593 4776 5.169 196793 Area 1344567 61662 68095 1474323 Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) 71669 4479 -2355 4795 8.081 2862 6376 1.736 76885 D:\HPLC\VAIDATION\2018\HoaCH21\06032018\ung dung\UD thu 10.lcd 15/03/2018 4:41:35 CH Page / Ung Dung 11 Sample Name : M11 Sample ID : Data Filename : M11.lcd Method Filename : huyetap.lcm Batch Filename : 13032018.lcb Vial # : 1-6 Injection Volume : 10 uL Date Acquired : 13/03/2018 8:20:33 CH Date Processed : 14/03/2018 8:36:35 SA Sample Type : Unknown Acquired by Processed by : System Administrator : System Administrator mAU 5.0 PDA Multi 238nm,4nm 2.5 0.0 10 15 20 25 30 35 40 45 mAU 1.25 PDA Multi 360nm,4nm 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 10 15 20 25 30 35 40 45 PDA Ch1 238nm D:\HPLC\VAIDATION\2018\HoaCH21\13032018\ung dung\mau 11.lcd 15/03/2018 4:41:35 CH Page / Peak# Total Name Ret Time Area Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) PDA Ch2 360nm Peak# Name Ret Time Total Area Height Number of Theoretical Plate(USP) Resolution(USP) D:\HPLC\VAIDATION\2018\HoaCH21\13032018\ung dung\mau 11.lcd PHỤ LỤC PHỔ UV CÁC CHẤT TRONG MẪU NGHI NGỜ a) b) c) d) Hình 5.1 Phổ UV chất mẫu nghi ngờ a) Phổ Nifedipin chuẩn b) Phổ mẫu nghi ngờ M04 c) Phổ mẫu nghi ngờ M05 d) Phổ mẫu nghi ngờ M10 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ THUỐC HÓA DƯỢC ĐIỀU TRỊ TĂNG HUYẾT ÁP TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) TRẦN LỆ HOA1,2, TRẦN THÚY HẠNH2, NGUYỄN THỊ KIỀU ANH3 Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ Phẩm – Thực Phẩm tỉnh Yên Bái Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương; 3Trường Đại học Dược Hà Nội Đặt vấn đề Tăng huyết áp bệnh ngày gia tăng tỷ lệ mắc nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tai biến mạch máu não, nhồi máu tim, suy tim Bên cạnh việc sử dụng thuốc hóa dược điều trị, sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu mang lại cho người dùng an tâm tính an tồn Tuy nhiên, nhằm tăng hiệu lợi nhuận số sở trộn trái phép thuốc hóa dược vào chế phẩm đơng dược Đã có số chế phẩm phát có trộn lẫn thuốc hạ huyết áp Amlodipin, Nifedipin, Valsartan, Atenolol [9], [10], [11], [12] Amlodipin, Nifedipin, Valsartan Felodipin thuốc điều trị tăng huyết áp dùng phổ biến nay, với liều dùng thấp có nhiều sản phẩm lưu hành thị trường với giá thấp Đây thuốc lựa chọn hàng đầu định điều trị cao huyết áp Chính thuốc dễ bị trộn trái phép vào chế phẩm đông dược Khi sử dụng chế phẩm này, với liều dùng khơng kiểm sốt kéo dài, người dùng chịu tác dụng khơng mong muốn chậm nhịp tim, rối loạn tiêu hóa, nghẽn nhĩ thất….[1], [2], [3] Chính việc phát chất có tác dụng hạ huyết áp trộn lẫn chế phẩm đông dược vấn đề cấp thiết để bảo vệ sức khỏe người sử dụng Do đó, nghiên cứu thực với mục tiêu xây dựng phương pháp phát đồng thời thuốc điều trị tăng huyết áp Amlodipin, Nifedipin, Valsartan Felodipin chế phẩm đơng dược HPLC nhằm góp phần vào công tác kiểm tra giám sát chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu điều trị hỗ trợ điều trị tăng huyết áp Thực nghiệm 1.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất chất chuẩn 1.1.1 Thiết bị, dụng cụ Máy HPLC Shimazu 20AD với Detector UV -PDA Nhật Cân phân tích, máy ly tâm, bể lắc siêu âm thiết bị dụng cụ thí nghiệm khác 1.1.2 Hóa chất, dung môi Acetonitril, ethanol, methanol loại dùng cho HPLC; kali dihydrophosphat, acid phosphoric loại PA Merck – Đức 1.1.3 Chất chuẩn Amlodipin besylat (AMP) hàm lượng 100,34%, số lô QT145060412; Nifedipin (NIF) hàm lượng 99,46%, số lô QT002090615 Viện kiểm nghiệm thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh Valsartan (VAL) hàm lượng 98,38%, số lô WS.0116335.0, Felodipin (FEL) hàm lượng 99,30%, số lô WS.0107222 Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nền: Nền mẫu viên nang cứng N01 dựa thuốc Giáng áp hợp tễ sách Thiên Gia Diệu Phương [4], Nền trà hòa tan N02 dựa thuốc chữa huyết áp có hoa hòe Những thuốc động vật làm thuốc Việt Nam [7], Nền viên nén dựa thuốc dân gian Hạ hồi đơn theo Hải Thượng Lãng Ông y tâm lĩnh chứa vị thuốc có tác dụng an thần, chữa tăng huyết áp [8] Bảng 1: Thành phần mẫu Mẫu Thành phần Huyền sâm 12g, hạ khô thảo 12g, táo nhân 16g, địa long 16g, giao đằng N01 16g, câu đằng 6g, hoa hòe 6g N02 Hoa hòe 10g, dừa cạn 4g, cúc hoa 4g, tâm sen 5g, cỏ 4g Táo nhân 6g, đỗ trọng 12g, câu đằng 8g, ngưu tất 12g, hạ khô thảo 10g, bạch N03 thược 12g, đẳng sâm 10g, sinh địa 8g, linh chi 8g, hòe hoa 4g 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Xác định điều kiện phân tích Phương pháp xử lý mẫu: Dựa vào tài liệu tham khảo [9], [6] có thay đổi, q trình xử lý mẫu thực sau: Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, nghiền mịn, đồng mẫu Cân xác lượng mẫu thử tương ứng liều dùng vào bình định mức 25 ml, thêm dung mơi chiết, lắc Siêu âm Thêm dung môi chiết vừa đủ thể tích Lắc Ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Lấy phần dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký: Dựa vào tài liệu tham khảo [9], [6], khảo sát loại cột sắc ký khác nhau, hệ pha động khác (thay đổi tỷ lệ pha động, tốc độ dòng) để tìm điều kiện sắc ký tối ưu tách chất tách khỏi mẫu 2.1.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Theo hướng dẫn AOAC 2016 [5] độ chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ độ lặp lại, giới hạn định lượng giới hạn phát Kết bàn luận 3.1 Kết xác định điều kiện sắc ký Dựa vào tính chất chất phân tích tài liệu công bố Dược điển châu Anh, Dược điển Mỹ nghiên cứu lựa chọn sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 để phân tích AML, NIF, VAL, FEL mẫu thử Sử dụng hệ dung môi methanol dung dịch đệm phosphat (nồng độ 50mM) pH 3,0 với tỷ lệ methanol từ 10 - 75% (C = 5%), kết cho thấy tỷ lệ methanol tăng thời gian lưu chất phân tích giảm, để chất tách không bị ảnh hưởng mẫu sử dụng tỷ lệ methanol 55% với tốc độ dòng 1,5 ml/phút Tuy nhiên, trì tỷ lệ thành phần pha động khơng đổi q trình rửa giải thời gian phân tích FEL kéo dài tỷ lệ thành phần tốc độ dòng pha động thay đổi để rửa giải tất thành phần mẫu thử thời gian khoảng 45 phút (hình 1) Hình 1: Sắc ký đồ tách AML, NIF, VAL, FEL với pha động MeOH : Dung dịch đệm phosphat pH 3.0 chạy chế độ gradient Quét phổ UV vị trí ứng với thời gian lưu pic chất sắc ký đồ xác định bước sóng cực đại hấp thụ Kết cho thấy chất cho hấp thụ cực đại bước sóng khoảng 238 nm, AML, NIF, FEL có cực đại khoảng 360 nm Khi phát 238 nm, kết chịu ảnh hưởng mẫu, 360 nm hạn chế ảnh hưởng lựa chọn 238 nm bước sóng phát VAL, bước sóng phát AML, NIF, FEL 360 nm Thể tích mẫu thử ảnh hưởng tới độ phân giải pic sắc ký, mặt khác mẫu dược liệu thể tích mẫu nhỏ góp phần hạn chế ảnh hưởng mẫu làm bẩn cột sắc ký dẫn đến ổn định phân tích Qua khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu 10 µl Từ kết khảo sát, điều kiện sắc ký lựa chọn sau: - Cột: InertSil ODS - (4,6 mm ì 25 cm; 5àm), ct bo v cựng loại, nhiệt độ cột 30oC - Pha động: Methanol – Dung dịch đệm phosphat 50 mM pH 3,0, chạy theo chương trình gradient dung mơi sau: từ 0-28 phút MeOH 55%; từ 28 – 32 phút tăng tuyến tính MeOH từ 55% đến 75% trì tỷ lệ tới 43 phút; từ 43-44 phút giảm tuyến tính MeOH từ 75% đến 55% trì tỷ lệ tới 50 phút; - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút; - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl; - Bước sóng phát hiện: 238 nm VAL 360 nm AML, NIF FEL 3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Quá trình xử lý mẫu ảnh hưởng lớn đến trình tách sắc ký chất Dựa vào độ tan chất tiến hành khảo sát dung môi chiết methanol, ethanol acetonitril Kết khảo sát cho thấy với dung môi chiết methanol hiệu suất chiết chất cao Đồng thời, khảo sát thời gian chiết siêu âm từ - 30 phút (t = phút) thấy thời gian siêu âm tăng, lượng chất chiết tăng, với khoảng thời gian 20 phút với mẫu viên nang cứng, viên nén thời gian 15 phút với trà hòa tan lượng chất chiết cao không tăng lên tăng thời gian chiết Trong trình khảo sát nhận thấy nhiệt độ cao gây nhũ hóa với mẫu N03 trà hòa tan nên trình chiết phải đảm bảo nhiệt độ ổn định 30oC Quy trình xử lý mẫu trình bày mục xử lý mẫu phương pháp nghiên cứu với dung môi chiết MeOH thời gian siêu âm 20 phút mẫu viên nén, viên nang 15 phút mẫu trà hòa tan nhiệt độ 30oC 3.3 Kết thẩm định phương pháp phân tích 3.3.1 Độ chọn lọc Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng mẫu N01, N02, N03; dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp dung dịch mẫu thêm chuẩn Tiến hành xử lý mẫu tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu Kết thể hình 2: (a) (b) Hình 2: Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp phát bước sóng 238 nm (a); bước sóng 360 nm (b) Kết hình cho thấy sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn xuất pic tương ứng với vị trí chất nghiên cứu sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp Trên sắc ký đồ mẫu không thấy xuất pic vị trí tương ứng với chất nghiên cứu Như phương pháp phân tích đảm bảo tính chọn lọc 3.3.2 Độ tuyến tính Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp chất nghiên cứu nồng độ khác nhau, tiến hành sắc ký, xây dựng mối tương quan diện tích pic nồng độ chất nghiên cứu, kết trình bày Bảng Bảng Kết đánh giá mối tương quan nồng độ diện tích pic chất nghiên cứu Mức nồng độ AML C (µg/ml) A (mAU.s) NIF C (µg/ml) A (mAU) VAL C (µg/ml) FEL A C (mAU.s) (µg/ml) A (mAU.s) Kết thống kê 2,02 9387 3,03 13944 5,05 22140 8,08 39346 10,10 47296 y = 4801,6x – 735,07 r = 0,9981 2,06 12462 6,17 36873 10,28 67792 16,45 100897 20,56 125432 y = 6116,1x + 777,84 r = 0,9987 2.01 27463 6.04 67932 10.07 136202 16.11 210873 20.13 270645 y = 13582x – 5042,8 r = 0,9982 2.03 17505 3.10 26658 5.17 41592 8.27 69786 10.34 90181 y = 8682,1x – 1055,5 r = 0,9987 Kết bảng cho thấy khoảng nồng độ khảo sát AML, NIF, VAL, FEL có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ chất với hệ số tương quan r lớn 0,99 3.3.3 Độ độ lặp lại Tiến hành theo phương pháp mẫu tự tạo Thêm thể tích xác dung dịch chuẩn hỗn hợp vào mẫu thử mẫu để thu mẫu tương ứng với lượng dung dịch chuẩn xử lý mẫu mức nồng độ 1, Làm đồng mẫu tiến hành phân tích Tại mức nồng độ thực lặp lại lần độc lập Dựa vào diện tích pic mẫu thêm chuẩn đường chuẩn tiến hành xây dựng ngày phân tích tính lượng thu hồi chất Độ tỷ lệ % lượng tìm lại lượng chuẩn thêm vào; độ lặp lại đánh giá thông qua giá trị RSD (%) Kết trình bày Bảng Bảng 4: Kết đánh giá độ lặp lại độ phương pháp (n = 7) Mức nồng độ (µg/mL) Amlodipin 3,44 4,86 8,06 Nifedipin 7,04 10,35 18,64 Valsartan 6,24 9,85 17,06 Felodipin 3,69 5,97 8,63 Nền N01 % tìm lại RSD (%) Nền N02 % tìm lại RSD (%) Nền N03 % tìm lại RSD (%) 91,95 83,40 95,99 5,16 2,61 4,62 97,01 85,76 86,64 3,11 2,03 3,93 91,19 87,02 94,55 4,04 1,39 3,77 105,24 98,52 94,16 4,60 1,95 4,61 106,56 105,91 97,37 2,41 2,28 3,48 102,16 99,67 91,95 3,33 1,23 1,47 103,53 100,38 92,28 4,19 1,07 3,15 92,84 104,56 93,81 1,33 3,87 4,11 93,17 100,98 96,07 3,61 2,77 2,08 102,04 90,84 92,99 2,40 3,25 3,54 101,58 97,54 95,20 2,84 3,20 3,33 104,14 94,25 91,75 2,56 1,59 0,89 Kết bảng cho thấy chất, mẫu, độ tìm lại mức nồng độ nằm khoảng từ 83,4 - 106,6%; phương pháp có độ lặp lại cao với RSD nằm khoảng 0,89 – 5,16% tất mẫu thử nghiệm đạt yêu cầu theo AOAC 2016 với tỷ lệ hàm lượng dược chất 0,001 độ thu hồi 80 – 110% RSD < 7,3% 3.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng Tiến hành phân tích với mẫu thêm chuẩn với nồng độ thấp dần Xác định tỷ lệ S/N Nồng độ có tỷ lệ S/N khoảng 10 coi LOD LOQ phương pháp Kết thu mẫu N01 cho tỷ lệ S/N mức nồng độ cao 10 xác định được: - AML, NIF: LOD LOQ 0,50µg/ml 1,67µg/ml - VAL, FEL: LOD LOQ 0,25 µg/ml 0,83 µg/ml 3.3.5 Ứng dụng 11 chế phẩm đông dược thực phẩm bảo vệ sức khỏe (trong có sản phẩm có số đăng ký, 10 sản phẩm có giấy phép xác nhận cơng bố sản phẩm Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm) gồm dạng bào chế viên nang cứng, trà hòa tan, viên nén sử dụng điều trị hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp lưu hành Việt Nam; mua nhà thuốc, cửa hàng bán thực phẩm bảo vệ sức khỏe, qua trang mạng internet Tiến hành phân tích mẫu phương pháp xây dựng Kết cho thấy 8/11 mẫu khơng phát có pic ứng với thời gian lưu chất phân tích sắc ký đồ; mẫu thấy xuất pic trùng thời gian lưu nifedipin qt phổ khơng thấy có cực đại hấp thụ nifedipin chuẩn Kết minh họa hình (a) (b) (c) Hình 3: Sắc ký đồ mẫu Trà hòa tan M05 (a); Phổ hấp thụ UV mẫu trà hòa tan M05(b); Phổ hấp thụ UV nifedipin chuẩn (c) Kết luận Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích đồng thời thuốc điều trị tăng huyết áp gồm Amlodipin, Nifedipin, Valsartan, Felodipin trộn lẫn chế phẩm đông dược HPLC Phương pháp có độ chọn lọc cao; khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan lớn 0,998; độ lặp lại cao với RSD nằm khoảng 0,89 – 5,16%; độ đảm bảo (83,40 – 106,56%) đáp ứng yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích theo AOAC 2016 Phương pháp có độ nhạy cao với LOD LOQ khoảng 0,50 µg/ml 1,67 µg/ml chất Phương pháp ứng dụng xác định có mặt chất 11 mẫu thực lưu hành thị trường không phát mẫu dương tính với chất nghiên cứu Tài liệu tham khảo Bộ Y Tế (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2007), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nhà xuất Y Học, Hà Nội Bộ Y Tế (2007), Hóa Dược Tập 1, Nhà xuất Y Học, Hà Nội Lý Văn Lượng (1989), Thiên Gia Diệu Phương, Viện thông tin thư viện học Trung Ưng Hà Nội AOAC International (2016), Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements QionglinLiang, JunQu, GuoanLuo, YimingWang (2006), "Rapid and reliable determination of illegal adulterant in herbal medicines and dietary supplements by LC/MS/MS", J Pharm Biomed Anal, 40 (2006), trang 305–311 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Lê Hữu Trác (2012), Hải Thượng Lãng Ông y tâm lĩnh, Nhà xuất Y Học Heo Seok, Yoo Geum Joo, Choi Ji Yeon, Park Hyoung Joon, Park Sung-Kwan, Baek Sun Young (2016), "A rapid method for the simultaneous determination of 25 antihypertensive compounds in dietary supplements using ultra-high pressure liquid chromatography", Food Additives & Contaminants: Part A, trang 17 - 36 10 Kesting J R., Huang J., Sorensen D (2010), "Identification of adulterants in a Chinese herbal medicine by LC-HRMS and LC-MS-SPE/NMR and comparative in vivo study with standards in a hypertensive rat model", J Pharm Biomed Anal, 51(3), trang 70511 11 Lu Y L., Zhou N L., Liao S Y., Su N., He D X., Tian Q Q., Chen B., Yao S Z (2010), "Detection of adulteration of anti-hypertension dietary supplements and traditional Chinese medicines with synthetic drugs using LC/MS", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 27(7), trang 893-902 12 Zhang Rui, Yin Lihui, Jin Shaohong (2014), "Detection of illegally added drugs in dietary supplements by near-infrared spectral imaging", Journal of innovative optical health sciences, 7(6), trang 1450032 1-6 SUMMARY A simple and sensitive high performance liquid chromatography (HPLC) method using PDA detection was developed for the determination of amlodipine, nifedipine, valsartan, felodipine in drug and supplement from medicinal plants The samples were prepared in methanol and, sonicated for complete dissolution Then, 10 µl of the extract was injected to the system The separation used an Inertsil ODS column (250 x 4.6 mm; µm) and a mobile phase consisting of methanol and buffer phosphate 50mM (pH 3,0) in gradient elution Amlodipien, nifedipine, felodipine was detected at 360 nm and valsartan was detected at 238 nm The specificity, linearity, precision (repeatability, intermediate precision), accuracy, LOD and LOQ were evaluated The validation results confirmed that the method satisfied the AOAC requirements The method was successfully applied in the analysis of 11 samples in the market The result showed that none of the samples contained the targeted compounds Key words: anti-hypertensive, undeclaration, herbal products, HPLC, quantification Từ khóa: thuốc hạ huyết áp, không khai báo, chế phẩm đông dược, HPLC, định lượng ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN LỆ HOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT NHÓM HẠ HUYẾT ÁP TRỘN LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPTLC VÀ HPLC LUẬN VĂN THẠC... phát chất cấm trộn lẫn chế phẩm đông dược, tiến hành đề tài nghiên cứu Xây dựng phương pháp xác định số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn lẫn chế phẩm đông dược HPTLC HPLC Với mục tiêu: Xây dựng. .. có tác dụng dược lý hạ huyết áp công bố số chế phẩm đông dược điều trị hỗ trợ điều trị tăng huyết áp có thị phần lớn thị trường Việt Nam - Mẫu chuẩn tự tạo : Chất chuẩn trộn mẫu với tỉ lệ định