KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VI SINH VẬT TRONG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CÁ TRA TẠI CÔNG TY CADOVIMEX II

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VI SINH VẬT TRONG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CÁ TRA TẠI CÔNG TY CADOVIMEX II Họ tên sinh viên: ĐINH THỊ MỸ DUNG Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN Niên hóa: 2007 - 2011 Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 07/2011 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VI SINH VẬT TRONG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CÁ TRA TẠI CÔNG TY CADOVIMEX II Tác giả Đinh Thị Mỹ Dung Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp kỹ sư ngành Chế Biến Thủy Sản Giáo viên hướng dẫn: Th.S Trương Quang Bình Th.S Trương Phước Thiên Hồng Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 07 năm 2011 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm mơn khoa Thủy Sản, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình theo học trường Th.S Trương Quang Bình nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Cơ Trương Phước Thiên Hồng chị Viện Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Anh Lâm Văn Chơn anh chị công nhân công ty CADOVIMEX II tạo điều kiện cho thời gian thực đề tài Tồn thể lớp DH07CT tận tình chia giúp đỡ suốt thời gian học làm đề tài tốt nghiệp Con chân thành cảm ơn ba mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập Sinh viên Đinh Thị Mỹ Dung ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát thành phần vi sinh vật nước thải chế biến cá tra công ty CADOVIMEX II” tiến hành Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, thời gian từ tháng 3/2011 đến tháng 6/2011 Sau thu mẫu, mẫu nước thải khảo sát, phân tích tiêu thành phần vi sinh vật có nước thải chế biến cá tra kết thu sau: + BOD20 = 400 (mgO /L), COD = 1006 (mgO /L), DO = 4,76 (mg/L), N tổng số = 80,47 (mg/L), P tổng số = 2,1 (mg/L), TS = 882 (mg/L), TSS = 68 (mg/L), NO - = 0,004 (mg/L), NO - = 0,21 (mg/L), C tổng số = 0,014 (%) + Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc nấm men Kết đếm vi khuẩn hiếu khí: 2,2×106 (CFU/ml), nấm mốc: 3,1×104 (CFU/ml), nấm men 4,1×104 (CFU/ml) + Làm quan sát hình thái số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc nấm men Kết làm giống vi khuẩn (1 giống vi khuẩn gram (-) hình ovan, giống trực khuẩn gram (+), giống trực khuẩn gram (-) giống cầu khuẩn gram (-)), giống nấm mốc (giống Aspergillus, Penicillum, Rhizopus) giống nấm men + Xác định Coliforms tổng số, Coliforms phân, E.coli phương pháp MPN Kết thu Coliforms tổng số: 9,3×105 (MPN/ml), Coliforms phân: 4,3×105 (MPN/ml), E.coli: 0,9×105 (MPN/ml) + Định lượng Clostridium mẫu nước thải phương pháp đếm khuẩn lạc Kết đếm Clostridium: 1,8×105 (CFU/ml) + Kiểm tra nước thải chế biến cá tra có hay khơng có diện Salmonella Kết khơng phát Salmonella nước thải iii MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách bảng vii Danh sách sơ đồ viii Danh sách hình ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Địa điểm, vị trí cơng ty CADOVIMEX II .3 2.2 Khái niệm đặc tính số tiêu nước thải thủy sản .4 2.3 Khái quát vi sinh vật nước thải 2.3.1 Khái niệm vi sinh vật 2.3.2 Phân loại vi sinh vật .6 2.3.3 Thành phần vi sinh vật nước thải 2.3.4 Sự phát triển vi sinh vật 2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật nước .8 2.3.6 Đặc điểm số vi khuẩn phổ biến nước thải 10 2.4 Nước thải hoạt động chế biến thủy sản chế biến thủy sản đông lạnh .12 2.4.1 Nước thải hoạt động chế biến thủy sản .13 2.4.2 Nước thải chế biến thủy sản đông lạnh .15 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống môi trường xung quanh 17 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 iv 3.1 Thời gian địa điểm thực 19 3.2 Vật liệu thí nghiệm 19 3.2.1 Mẫu nước thải .19 3.2.3 Dụng cụ thiết bị .19 3.2.3 Hóa chất mơi trường 19 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 20 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Quy trình chế biến cá tra nhà máy 23 4.2 Sơ đồ xử lý nước thải nhà máy 27 4.3 Kết phân tích tiêu mẫu nước thải nhà máy 29 4.4 Kết khảo sát số lượng vi khuẩn, nấm mốc nấm men mẫu nước thải 30 4.5 Kết phân giống vi khuẩn, nấm men nấm mốc có mẫu nước thải .31 4.5.1 Kết phân giống vi khuẩn 31 4.5.2 Kết phân giống nấm mốc .33 4.5.3 Kết phân giống nấm men .34 4.6 Kết định lượng, định tính số vi khuẩn phổ biến nước thải 35 4.6.1 Kết định lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân E.coli phương pháp MPN 35 4.6.2 Kết định lượng Clostridium 36 4.6.3 Định tính Salmonella 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC .42 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BOD: Biochemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy sinh học) CBTS: Chế biến thủy sản CBTSĐL: Chế biến thủy sản đông lạnh CFU: Colony Forming Units COD: Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học) DO: Dissolved Oxygen (oxy hòa tan) EPEC: Enteropathogenic Escherichia coli EIEC: Enteroinvensive Escherichia coli ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli EHEC: Enterohaemorrhagic Escherichia coli EU: European Union HACCP: Hazard Analysis Critical Control Point IQF: Individual Quick Frozen ISO: International Standard Organization MPN: Most Probable Number NN & PTNT: Nông nghiệp phát triển nông thôn PE: Polyme Etylen QC: Quality Control (quản lý chất lượng) TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TS: Total Solids (tổng số chất rắn) TSS: Total Suspended Solids (tổng số chất rắn lơ lửng) NAFIQAD: National Agro – Forestry – Fisheries Quality Assurance Department (Cục Quản Lý Chất Lượng Nông Lâm Sản Thủy Sản) UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Nồng độ nhiễm trung bình nước thải số loại hình chế biến thủy sản 14 Bảng 3.1: Phương pháp phân tích tiêu nước thải nhà máy 26 Bảng 4.1: Kết phân tích tiêu nước thải nhà máy chế biến cá tra fillet đông lạnh .29 Bảng 4.2: Kết đếm số khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men nấm mốc 30 Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái, nhuộm gram phản ứng sinh hóa giống vi khuẩn .32 Bảng 4.4: Kết đặc điểm hình thái giống mốc 33 Bảng 4.5: Kết đặc điểm hình thái giống men 34 Bảng 4.6: Bảng phân tích định lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân E.coli phương pháp MPN 35 Bảng 4.7: Bảng kết đếm số khuẩn lạc điển hình định lượng Clostridium 36 Bảng 4.8: Bảng kết phân tích định tính Salmonella .37 vii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Vị trí địa lý cơng ty CADOVIMEX II Sơ đồ 2.2: Đường cong sinh trưởng vi sinh vật .8 Sơ đồ 2.3: Mơ tả dòng thải nước quy trình chế biến thủy sản đông lạnh .16 Sơ đồ 4.1: Quy trình chế biến cá tra fillet đơng lạnh 23 Sơ đồ 4.2: Quy trình xử lý nước thải nhà máy .27 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm mốc, nấm men (a) khuẩn lạc vi khuẩn (b) 30 Hình 4.2: Hình dạng màu sắc giống vi khuẩn 31 Hình 4.3: Kết nhuộm gram phản ứng sinh hóa giống vi khuẩn (a) Trực khuẩn G-, (b) Phản ứng sinh hóa theo thứ tự: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-), TSI (k/k) 33 Hình 4.4: Quan sát giống nấm mốc kính hiển vi: (a) giống Aspergillus, (b) Penicillum, (c) Rhizopus 34 Hình 4.5: Hình dạng tế bào (a)và khả nảy chồi (b) giống nấm men 35 Hình 4.6: Kết thử IMViC ++ (a) E.coli Indol (b) Coliforms phân 36 Hình 4.7: Kết phân lập Salmonella mơi trường XLD (a) HE (b) 38 ix Phụ lục 4: Phương pháp định lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân E.coli (phương pháp MPN) - Quy trình định lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân, E.coli phương pháp MPN 45 - Nguyên tắc Số lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân, E.coli mẫu nước chứa mật độ thấp nhóm vi khuẩn xác định phương pháp MPN Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy thập phân mẫu có độ pha lỗng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ đến ống lặp lại Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống thử nghiệm Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha loãng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện g 1ml mẫu ban đầu - Cách tính kết sau: Số lượng vi sinh vật ml = Trị số tra bảng MPN × hệ số pha lỗng 46 Phụ lục 5: Phương pháp định lượng Clostridium (phương pháp đếm đĩa) - Nguyên tắc Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng mơi trường có chứa ion Fe3+ ion S O 2-, ủ 370C – ngày Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt ủ thêm 500C Trên mơi trường khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphide (S2-) ion sắt (Fe2+) có mơi trường - Quy trình định lượng Clostridium - Cách tính kết theo cơng thức sau: M i (CFU/ml) = A i × D i /V Trong đó: M i : Mật độ tế bào trung bình/đĩa A i : Số khuẩn lạc trung bình/đĩa D i : Độ pha lỗng thứ i V: Thể tích cho vào đĩa (ml) 47 Phụ lục 6: Phương pháp định tính Salmonella nước thải - Nguyên tắc Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay không phát Salmonella mẫu lấy Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn giai đoạn (tiền tăng sinh, tăng sinh, phân lập khẳng định) + Tiền tăng sinh: Mẫu tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn lọc (peptone đệm) 370C khoảng 24 + Tăng sinh: Mẫu sau tiền tăng sinh chuyển qua tăng sinh môi trường tăng sinh chọn lọc (canh Rapparport Vassiliadis soy peptone), ủ 420C khoảng 24 + Phân lập: Cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc (XLD HE), ủ 370C khoảng 24 + Khẳng định: Cấy chuyển khuẩn lạc nghi Salmonella sang mơi trường thích hợp, thẩm tra thử nghiệm sinh hóa kháng huyết -.Quy trình định tính Salmonella nước thải 48 Phụ lục 7: Thành phần cách pha môi trường Nước muối sinh lý - Thành phần NaCl 8,5 g Nước cất 1000 ml - Cách pha: Hòa tan muối nước cất phân phối ml nước muối vào ống nghiệm Hấp 1210C 15 phút PCA (Plate Count Agar) - Thành phần Casein enzymic hydrolysate: 5g Yeast extract: 2,5 g Dextrose: 1g Agar: 15 g Nước cất: 1000 ml pH 7.0 ± 0.2 - Cách pha: Đun tan hợp phần lít nước cất, Phân phối PCA vào đĩa petri (15 ml/petri) Hấp 1210C 15 phút DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar) - Thành phần Glucose 10 g Peptone 5g KH PO 1g MgSO 0,5 g Rose bengal (dung dịch 5%, wv) 0,5 ml Dichloran (0,2 %, wv ethanol) ml Chloramphenicol 0,1 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml pH 5,6 ± 0,2 49 - Cách pha: Trộn lẫn thành phần, ngoại trừ chloramphenicol, đun nóng để hòa tan hết agar, hấp khử trùng 1210C, 15 phút Để nguội đến 500C, bổ sung ml dung dịch kháng sinh 100X vào 100 ml môi trường (như môi trường DG18) LB (Lactose Broth) - Thành phần Peptone 5g Lactose 5g Cao thịt 3g Nước cất 1000 ml - Cách pha: Đun tan hợp phần 1000 ml nước cất Hấp 1210C 15 phút BGBL (Brilliant Green Bile Lactose) - Thành phần Peptone 10 g Lactose 10 g Mật bò 20 g Brilliant green 0,0133 g Nước cất 1000 ml pH 7,4 - Cách pha: Hòa tan peptone lactose vào 500 ml nước cất Cho 20 g mật bò vào 200 ml nước cất (pH dung dịch khoảng đến 7,5) Trộn dung dịch , thêm nước cất đến 975 ml, chỉnh pH đến 7,4 Cho thêm 13,3 ml dung dịch Brilliant green 0,1 % nước cất Thêm nước cất cho đủ 1000 ml Phân phối vào ống nghiệm cỡ 16 mm có ống Durham (mỗi ống ml) Hấp 1210C 15 phút EC (Escherichia coli) - Thành phần Tryptose 20 g Muối mật 1,5 g Lactose 5g 50 K HPO 4g KH PO 1,5 g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH 6,9 ± 0,2 - Cách pha: Rót mơi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham Hấp 1210C 15 phút EMB (Eosine Methylene Blue Agar) - Thành phần Peptone 10 g Lactose 10 g K HPO 2g Eosine Yellowish 0,4 g Methylene blue 0,065 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml pH 7,2 - Cách pha: Đun tan hợp phần 1000 ml nước cất Hấp 1210C 15 phút ISA ( Iron Sulphite Agar) - Thành phần Môi trường Cao thịt 10 g pepton 10 g NaCl 5g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Dung dịch natri sunphit (Na SO ) Na SO 10 g 51 Nước cất 100 ml Dung dịch sắt (III) sunfat (FeSO ) FeSO 8g Nước cất 100 ml Môi trường hồn chỉnh Mơi trường 18 ml Dung dịch natri sunphit ml Dung dịch sắt (III) sunfat giọt - Cách pha: Đun tan môi trướng điều chỉnh pH đến 7,6 ± 0,1 Hấp khử trùng 1210C 15 phút Để nguội đến 500C, thêm ml dung dịch natri sunphit giọt dung dịch sắt (III) sunfat tiến hành đổ đĩa BPW (Buffered Peptone Water): Nước peptone đệm - Thành phần NaCl 5g Peptone 10 g Kali dihydrophotphat (KH P0 ) 1,5 g Dinatri hydrophotphat (Na HPO ) 9g Nước cất 1000 ml pH ± 0,2 250C - Cách pha: Hòa tan thành phần với nước cất bình có dung tích phù hợp Hấp 1210C 15 phút 10 RV (Rappaport Vassiliadis) - Thành phần Môi trường Tryptose 5g NaCl 8g K HPO 1,6 g Nước cất 1000 ml Dung dịch Magnesium chloride 52 MgCl 6H 400 g Nước cất 1000 ml Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate 0,4 g Nước cất 1000 ml Mơi trường hồn chỉnh Mơi trường 1000 ml Dung dịch MgCl 100 ml Dung dịch Malachite green oxalate 10 ml Tổng thể tích 1110 ml - Cách pha: Trộn thành phần theo tỷ lệ cho Phân phối 10 ml mơi trường hồn chỉnh vào ống nghiệm Hấp khử trùng 1150C, 15 phút pH cuối 5,5 ± 0,2 11 XLD (Xylose Lysin Desoxycholate Agar) - Thành phần Cao nấm men 3g L-lysine 5g Xylose 3,75 g Lactose 7,5 g Sucrose 7,5 g Sodium desoxycholate 2,5 g Ferric ammonium 0,8 g Sodium thiosulfate 6,8 g NaCl 5g Agar 15 g Phenol red 0,08 g Nước cất 1000 ml pH 7,4 ± 0,2 - Cách pha: Đun sôi môi trường, không hấp Để nguội đến 500C đổ đĩa 53 12 Môi trường Clark-Lubs (canh MR-VP) - Thành phần Peptone 5g K HPO 5g Glucose 5g Nước cất 1000 ml pH 7,5 - Cách pha: Đun tan hợp phần 1000 ml nước cất Hấp 1210C, 15 phút 13 Tryptone Broth - Thành phần Tryptone 10 g NaCl 5g Nước cất 1000 ml pH 6,9 ± 0,2 250C - Cách pha: Đun tan hợp phần 1000 ml nước cất Hấp 1210C, 15 phút 14 Simmons Citrate Agar - Thành phần NH H PO 1g K HPO 1g Sodium chloride 5g Sodium citrate 2g MgSO 0,2 g Bromothymol blue 0,008 g Agar 13 g Nước cất 1000 ml pH 6,8 ± 0,2 - Cách pha: Hòa tan thành phần với nước cất, phân phối 1/3 ống nghiệm, đậy ống nghiệm Hấp 1210C 15 phút, đặt ống nghiệm nghiêng 54 15 Thuốc thử Kovac’s - Thành phần p – Dimethylaminobenzaldehyde 10 g Amyl alcohol 150 ml HCl 50 ml - Cách pha: Hòa p – Dimethylaminobenzaldehyde vào Amyl alcohol, đun nhẹ 50 550C cho tan hết, để nguội cho thêm acid vào 16 Thuốc thử Methyl red - Thành phần Methyl red 0,1 g Ethanol 95 % 300 ml Nước cất 500 ml - Cách pha: Hòa tan 0,1 g methyl red vào 300ml ethanol, thêm nước cất 500 ml 17 Lactophenol - Thành phần Phenol kết tinh 10 g Acid lactic 10 g Glycerin 10 ml Nước cất 10 ml - Cách pha: Hòa tan hỗn hợp dùng 18 Xanh Methyl Loffler - Thành phần Rượu ethylic 300 ml Xanh methylen 20 g - Cách pha: Hòa tan hỗn hợp dùng 55 Phụ lục 8: Một số hình ảnh trình phân tích mẫu nước thải nhà máy chế biến cá tra fillet đơng lạnh Hình khuẩn lạc nấm mốc nấm men a b c Hình 4.7: Hình khuẩn lạc nấm mốc nấm men sau ngày Hình nấm mốc sau làm a b c Hình 4.8: Hình thái màu sắc giống nấm mốc: (a) Aspergillus, (b) Penicillum, (c) Rhizopus Hình vi khuẩn sau làm a b c Hình 4.9: Hình dạng, màu sắc giống vi khuẩn: (a) giống 1, (b) giống 2, (c) giống 56 Hình nhuộm gram giống vi khuẩn a b c Hình 4.10: Hình nhuộm gram vi khuẩn: (a) giống 1, (b) giống 3, (c) giống 57 Phụ lục 9: Bảng tiêu chuẩn 5945 – 2005 Thông số Nhiệt độ pH BOD5 (200C) COD C mg/l mg/l Chất rắn lơ lửng mg/l 50 100 200 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 0,05 0,005 0,1 0,005 0,05 0,2 0,2 0,5 0,2 0,07 0,1 0,1 0,01 0,5 0,01 0,1 0,5 0,1 0,5 0,5 0,01 0,5 0,5 5 10 0,2 10 mg/l 10 20 30 mg/l mg/l mg/l mg/l 0,2 500 0,5 10 600 15 1000 mg/l 10 15 27 28 Asen Thủy ngân Chì Cadimi Crom (IV) Crom (III) Đồng Kẽm Niken Mangan Sắt Thiếc Xianua Phenol Dầu mỡ khoáng Dầu động thực vật Clo dư Sunfua Florua Clorua Amoni (tính theo Nitơ) Tổng nitơ Tổng phơtpho 15 30 60 29 Coliforms mg/l mg/l MPN/ 100ml 3000 5000 - 30 Tổng hoạt độ phóng xạ α Bq/l 0,1 0,1 - 31 Tổng hoạt độ phóng xạ β Bq/l 1,0 1,0 - 21 22 23 24 25 26 Đơn vị Giá trị giới hạn A B 40 40 đến 5,5 đến 30 50 50 80 TT 58 C 45 đến 100 400 Phụ lục 10: Bảng phân tích mẫu nước thải nhà máy cá tra fillet đông lạnh 59 ... chất dinh dưỡng: chủ yếu N P, chúng nguyên tố cần thi t cho thực vật phát triển hay chúng ví chất dinh dưỡng kích thích sinh học Trong xử lý sinh học, nên di trì lượng N P theo tỉ lệ 5:1 Nếu thi u... chất dinh dưỡng Chất dinh dưỡng chất giúp cho vi sinh vật đồng hóa tăng sinh khối thu lượng Bao gồm hợp chất vô hợp chất hữu Các hợp chất hữu carbonhydrat, protein, lipit…là chất dinh dưỡng cần thi t... thi t bị .19 3.2.3 Hóa chất mơi trường 19 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 20 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20