NGHIÊN cứu HOẠT CHẤT SINH học từ sản PHẨM TRAO đổi CHẤT của VI KHUẨN CỘNG SINH với TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21

BỘ GIÁO DỤC VIỆN KHOA HỌC VÀ VÀ ĐÀO TẠO CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN THỊ NHÃ “NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2009 VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC “NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21” Chuyên ngành: Hoá sinh Mã số: 60 42 30 Học viên: Nguyễn Thị Nhã Hướng dẫn khoa học: TS Phan Kế Long Hà Nội – 2009 LỜI CẢM ƠN Tơi xin cảm ơn phòng Đào tạo thầy cô giáo Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Tơi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long nghiên cứu viên Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, người tận tình hướng dẫn, bảo định hướng cho tơi suốt thời gian thực hoàn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình làm thực nghiệm chia kinh nghiệm công việc để tơi hồn thành luận văn thời gian qui định Tôi xin cảm ơn đồng chí lãnh đạo trường THPT Gia Bình - Bắc Ninh, đồng chí tổ mơn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên q trình học tập nghiên cứu Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân gia đình tạo điều kiện, động viên giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu đó./ Hà nội, ngày 19 tháng12 năm 2009 Học viên Nguyễn Thị Nhã LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết số liệu luận văn trung thực chưa công bố Học viên: Nguyễn Thị Nhã BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella BTB Bromothymol Blue DMSO Dimethyl sulfoxide EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic HPLC nematode) Sắc ký lỏng hiệu cao (high performance liquid HPLC/MS chromatography) Sắc ký lỏng khối phổ hiệu cao (high performance liquid HPLC/UV chromatography/Mass Spectrometry) Sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng máy dò tia tử ngoại (High LB performance liquid chromatography/ultraviolet) Một môi trường nhân nuôi vi khuẩn (Luria-Bertani) IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile) MeOH Methanol CH3OH NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance) RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction SEM Fragment Length Polymorphism) Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope) TTC Triphenyltetrazolium Chloride DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VKCS Vi khuẩn cộng sinh MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 12 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1Tuyến trùng EPN 14 1.1.1 Khái niệm 14 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế gây bệnh EPN 14 1.1.4 Vòng đời tuyến trùng EPN 15 1.1.5 Quan hệ cộng sinh tuyến trùng vi khuẩn 16 15 1.1.4.1 Vai trò tuyến trùng 16 1.1.4.1 Vai trò VKCS 17 1.1.6 Tình hình nghiên cứu EPN giới nước 17 1.1.6.1.Tình hình nghiên cứu EPN giới 17 1.1.6.2.Tình hình nghiên cứu EPN nước 18 1.2 Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 19 1.2.1 Địa điểm phát 19 1.2.2 Số đo 19 1.2.3 Đặc điểm hình thái 22 1.2.4 Đặc điểm phân biệt 27 1.2.5 Mối quan hệ phát sinh chủng loại 1.3.Vi khuẩn cộng sinh 28 28 1.3.1 Xenorhabdus 28 1.3.2 Photohabdus 29 1.4.Các chất trao đổi thứ cấp 30 1.4.1 Nguồn gốc hoạt tính sinh học 30 1.4.1.1 Nguồn gốc 31 1.4.1.2 Hoạt tính sinh học 32 1.4.2 Cơng thức hố học 38 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 41 2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 41 2.3 Phương pháp phân loại VKCS 42 2.3.1 Tách chiết ADN tổng số 42 2.3.2 Nhân đoạn ADN đích kỹ thuật PCR 43 2.3.3 Điện di ADN gel agarose 44 2.3.4 Tinh sản phẩm PCR 44 2.3.5 Giải phân tích trình tự ADN 45 2.3.6 Phân tích số liệu 46 47 2.4 Phương pháp tách chiết hoạt chất 47 2.4.1 Nhân nuôi vi khuẩn In-vitro 2.4.2.Tách chiết hoạt chất 47 2.3.2 Tinh 48 2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học 52 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 VKCS với Steinernema robustispiculum TN21 53 3.1.1 Khuẩn lạc 53 3.1.2 Phân loại 54 3.2 Hoạt chất sinh học 57 3.2.1 Phân tích HPLC/MS HPLC/UV 58 3.2.2 Xác định công thức NMR 59 3.3 Đặc tính Diketopiperazine 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 69 MỤC LỤC BẢNG Trang Bảng Số đo tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 21 Bảng Các loài tuyến trùng VKCS tương ứng (Poinar G.O) 30 Bảng Các chất kháng vi sinh vật tổng hơp từ Xenorhabdus 32 Bảng Photorhabdus Các nồng độ nematophin phân lập từ X nematophilus ức 35 chế sinh trưởng số loài vi khuẩn nấm Bảng Nồng độ chất ST từ P.luminescens chống lại nấm 35 Bảng bệnh quan trọng nông nghiệp y học Phạm vi mức độ kháng khuẩn ES (Sundar Chang 36 Bảng FN, 1992) Danh mục chất kháng sinh hoạt tính chúng 37 Bảng biết từ Xenorhabdus spp Thành phần hỗn hợp cho PCR 43 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 44 Bảng10 Thành phần hỗn hợp phản ứng giải trình tự ADN 45 Bảng11 Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự ADN 45 Bảng 12 Tổng số nucleotide sai khác (số bên dưới), trung bình nucleotide sai khác có tính đến thiếu hụt nucleotide (số 56 bên trên) thông tin di truyền đoạn gen 16S Xenorhabdus sp TN21 lồi nhóm MỤC LỤC HÌNH Trang Hình Sơ đồ vòng đời EPN 15 Hình Steinernema robustispiculum TN21 22 Hình Ảnh SEM đực Steinernema robustispiculum TN21 24 Hình Ảnh SEM IJ Steinernema robustispiculum TN21 25 Hình Mẫu RFLP vùng ITS lồi Steinernema robustispiculum 26 TN21 cắt với 17 enzym Hình Sơ đồ phát sinh chủng loại Steinernema 28 robustispiculum với 13 lồi Steinernema dựa vào phân tích ITS-rDNA Hình Cơng thức hố học số chất kháng vi sinh vật từ 40 Xenorhabdus Photohabdus Hình Sơ đồ bước phân lập vi khuẩn Xenorhabdus sp 41 từ tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 Hình Sơ đồ bước nhân nuôi vi khuẩn In-Vitro 47 Hình 10 Sơ đồ bước tách chiết hoạt chất từ Xenorhabdus.sp Sơ đồ bước tinh hoạt chất RP- HPLC 48 51 Hình 13 Sơ đồ lý thuyết trình tiến hành chạy RP-HPLC Hệ thống Bruker DRX 500 Spectrometer Hình 14 Khuẩn 53 Hình 11 Hình 12 lạc tế bào VKCS với Steinernema 49 52 robustispiculum TN21 Hình 15 Mối quan hệ họ hàng VKCS phân lập từ Steinernema 54 robustispiculum TN 21 với lồi Xenorhabdus spp Dựa phân tích đoạn gen 16S phương pháp Maximum Parsimony Hình 16 So sánh đoạn gen 16S Xenorhabdus sp TN21 với loài nhóm 56 Hình 17 Đồ thị phân tích sản phẩm trao đổi chất thứ cấp 58 Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN 21 HPLC/MS HPLC/UV Hình 18 Cấu trúc 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2- 60 a]pyrazine-1,4-dione MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, côn trùng có hại, bệnh lồi người trồng ngày gia tăng Quá trình sử dụng thuốc trừ sâu hóa học kéo dài khơng ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể sinh vật mà dẫn đến kháng thuốc sâu bọ, vi khuẩn, vi rút nấm hậu nặng nề ô nhiễm môi trường đất, nước không khí Sức khoẻ nhân loại đứng trước nguy đe doạ Cũng mà có hàng loạt thuốc trừ sâu hoá học phải đưa vào danh mục cấm sử dụng Tương tự lĩnh vực y học, thuốc kháng sinh mà trước tiêu diệt tác nhân 10 56 Hình 15: Mối quan hệ họ hàng Xenorhabdus sp TN21 với loài thuộc giống Xenorhabdus sở phân tích đoạn gen 16S phương pháp Maximum Parsimony Trong ngoặc vật chủ nơi phân lập Giá trị gốc bootstrap 3.2 Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Chủng vi khuẩn Xenorhabdus sp TN21 sản sinh hợp chất không phân cực hấp thu UV mức độ cao (Hình 17) Nhưng đáng tiếc chúng tơi khơng thu nhiều để xác định cấu trúc hóa học hợp chất Tuy nhiên, thu 2,9 mg hợp chất phân cực đủ để tiến hành xác định cấu trúc hóa học Sử dụng phương pháp NMR ( 1H 500 MHz 13C 125 MHz), chúng tơi xác định Diketopiperazine, 3-(4- hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione Diketopiperazine giống với 3-isopropylhexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione phân lập từ sản phẩm chuyển hóa Photorhabdus (Bode thơng tin riêng) 3.2.1 Phân tích HPLC/MS HPLC/UV 57 Hình 17: Đồ thị phân tích chất tiết từ Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN 21 HPLC/MS (trên) HPLC/UV (dưới): Hợp chất không phân cực (*) 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione Đa số phân tích HPLC sử dụng máy dò UV – máy dò tử ngoại đo khả hấp phụ tia UV hợp chất mẫu, thơng thường bước sóng 254nm Trên sắc phổ - đồ thị theo dõi tín hiệu vào máy dò tìm qua thời gian Những đỉnh nhỏ phút có lẽ tiếng ồn đưa mẫu vào chạy Những đỉnh lớn phút đại diện cho hợp chất có mẫu Mỗi đỉnh đồ thị tương ứng với có mặt hợp chất mẫu - Đỉnh có nhãn phút thứ xác định 3-(4hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione - hợp chất phân cực 58 - Đỉnh có nhãn phút thứ 20.5 xác định hợp chất không phân cực hấp thu UV mức độ cao 3.2.2 Xác định công thức NMR Phổ 1H-NMR: proton nhóm CH2 vị trí C3 có độ dịch chuyển hóa học = 3,39 3,24 ppm (2H) Các proton nhóm CH2 vị trí C4 có = 1,70 ppm (2H), vị trí C5 có =1,98 1,38 ppm (2H), vị trí C6 có = 4,04 ppm (1H) proton nhóm NH vị trí N8 có = 7.82 ppm (1H) Độ dịch chuyển hóa học proton nhóm CH vị trí C9 có = 4,23 ppm (1H) Các proton nhóm CH2 vị trí C10 có = 2,92ppm (2H) Các proton nhóm CH vị trí C12 có độ dịch chuyển hóa học = 7,03 ppm (2H) Các proton nhóm CH vị trí C13 có độ dịch chuyển hóa học = 6,62 ppm (2H) Bảng 13: Dữ liệu NMR 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a] pyrazine-1,4-dione Vị trí 10 11 12 13 14 13 C (125 MHz, DMSO-D6) H (500 MHz, DMSO-D6) 165.5 (s) 44.9 (t) 3.39 (m, 1H), 3.24 (dt, J = 11.6 Hz, 6.6 Hz, 1H) 22.2 (t) 1.70 (m, 2H) 28.2 (t) 1.98 (m, 1H), 1.38 (m, 1H) 58.8 (d) 4.04 (dd, J = 8,8 Hz, 7.6 Hz, 1H) 169.3 (s) 7.82 (s, 1H) 56.4 (d) 4.23 (br t, J = 4.7 Hz, 1H) 35.2 (t) 2.92 (m, 2H) 127.4 (s) 131.2 (d) 7.03 (m, 2H) 115.2 (d) 6.62 (m, 2H) 156.3 (s) Phổ 13C-NMR: Cacbon vị trí C1 có độ dịch chuyển hóa học  59 = 165,5 ppm Cacbon nhóm CH2 vị trí C3 có độ dịch chuyển hóa học 44,9 ppm Cacbon nhóm CH2 vị trí C4 có độ dịch chuyển hóa học  22,2 ppm Cacbon nhóm CH2 vị trí C5 có độ dịch chuyển hóa học  28,2 ppm Cacbon nhóm CH vị trí C6 có độ dịch chuyển hóa học  58,8 ppm.Cacbon nhóm CO vị trí C7 có độ dịch chuyển hóa học  169,3 ppm Cacbon nhóm CH vị trí C9 có độ dịch chuyển hóa học  56.4 ppm Cacbon nhóm CH2 vị trí C10 có độ dịch chuyển hóa học  35.2 ppm Cacbon nhóm CH2 vị trí C10 có độ dịch chuyển hóa học  35.2 ppm Cabon vị trí C11 có = 127.4 ppm Cabon nhóm CH vị trí vị trí C12 có = 131.2 ppm Cabon nhóm CH vị trí vị trí C13 có = 115.2 ppm cacbon vị trí C14 có = 156.3 ppm Dựa vào kết phổ 1H-NMR, 13C-NMR xác định hợp chất 3-(4hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione có CTPT là: C14H16N2O3 CTCT là: O 10 11 14 HO HN N O Hình 18: Cấu trúc 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine1,4-dione Cho đến nay, Diketopiperazine peptide vòng nhỏ biết, thông thường sinh tổng hợp từ amino acid nhiều loại sinh vật khác kể động vật có vú coi sản phẩm trao đổi chất thứ cấp sản phẩm phụ q trình phân tách peptide Mặc dù có hai đường sinh tổng hợp khác (Lautru et al., 2002), chúng sản 60 phẩm từ q trình phân hủy protein Điều đặc biệt proline mang dẫn xuất giống proline có khả bẻ cong mạch peptit tạo điều kiện để hình thành hợp chất Một đặc tính quan trọng Diketopiperazine khả kìm hãm yếu tố kích hoạt Plasminogen-1 (PAI-1) ngun nhân gây nên bệnh tim mạch trình hình thành ung thư (Folker et al., 2001; Wang et al., 2002; Brooks et al., 2004; Einholm et al., 2003) Ngồi ra, Diketopiperazine có khả chống ung thư, kháng virus, kháng nấm, kháng khuẩn chống tác nhân làm tăng đường huyết (Martins & Carvalho, 2007) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Vi khuẩn cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN 21 xác định Xenorhabdus sp dựa sở phân tích đoạn gen 16S 61 -Chủng vi khuẩn Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN 21 sản sinh hợp chất không phân cực hợp chất phân cực 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione - Lần 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine1,4-dione phân lập từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Xenorhabdus Kiến nghị: Vì điều kiện thời gian nên chúng tơi nghiên cứu, xác định hoạt chất tạo từ chủng vi khuẩn Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN 21 Cần phải tiếp tục nghiên cứu làm sáng tỏ hoạt tính kháng vi sinh vật 3-(4-hydroxybenzyl) hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione Phát ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn, virut nấm gây bệnh động vật thực vật Nhằm sử dụng chúng cách hữu ích việc phòng trị bệnh cho người động vật TÀI LIỆU THAM KHẢO Akhurst J, Antibiotic Activity of Xenorhabdus spp., Bacteria Symbiotically Associated with Insect Pathogenic Nematodes of the Families Heterorhabditidae and Steinernematidae, 1982 62 Xenorhabdus spp Bacteria symbiotically associated with the insect Akhurst, R.J 1980 Morphological and functional dirnorphism in pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis Joumal of General Microbiology 121, 303-309 Akhurst, R.J (1982) Antibiotic activity of Xenorhabdus spp, bacteriasymbiotically associated with insect pathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinemematidae Journal of General Microbiology 128, 3061-3065 Akhurst, R.J and Boemare , N.E (1988) A numerical taxonomic study of the genus Xenorhabdus (Enterobacteriaceae) and proposed elevation of the subspecies of X nematophilus to species Joumal of General Microbiology 134, 1835-1845 Akhurst, R.J and Boemare, N.E (1990) Biology and taxonomy of Xenorhabdus In: Gaugler, R and Kaya, H.K (eds) Entomopathogenic nematodes in Biological Control CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, pp 75-87 Akhurst, R.J and Dunphy , G.B (1993) Tripartite interactions between symbiotically associated entomopathogenic bacteria, nernatodes, and their insect hosts ln: Parasites and pathogens of insects, Volume 2: Pathogens.7.Bedding R.A, Akhurst R.J, 1975: Nematologica, 21: 109-110 Boemare, NE, A Givaudan, M Brehelin and C Laurnond- 1997 Symbiosis and pathogenicity of nematode-bacterium complexes Syrnbiosis 22: 21 -45 Boemare, NE, M.H Boyer-Giglio J.O Thaler and R.J Akhurst 1992 Lysogeny and bactenocinogeny in Xenorhabdus spp., bacteria associated with entomopathogenic nematodes Applied and Environmental Microbiology 58: 3032-3037 63 Boemare, N.E (2002) Biology, Taxonomy and Systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus In: Gaugler, R (ed) Entomopathogenic Nematology CABI Publishing, pp 35-56 10 Bowen, D., T.A Rocheleau, M Blackburn, O Andreev, E Golubeva, R Bhartia and R.H French-Constant 1998 Insecticidal toxins from the bacterium Photohabdus luminescens Science 280: 21 29-21 32 11 Brooks T.D, Wang S.W, Brünner N, Charlton P.A, 2004: AntiCancer Drugs, 15: 37 - 44 12 Chen, G 1992 Effect of antibiotics produced by Xenorhabdus spp on soi1 bacteria M.Sc Thesis, Simon Fraser University, British Columbia, Canada 13 Chen, G 1996 Antimicrobial activity of the nematode syrnbionts, Xenorhabdus and Photomabdus (Enterobacteriaceae) and the discovery of two novel groups of antimicrobial substances, Nematophin and Xenorxides Thesis, Simon Fraser University, British Columbia, Canada 14 Chen, G., G.B Dunphy, and J.M Webster 1994 Antifungal activity of two Xenorhabdus species and Photorhabdus luminescens species of Heterorhabditis megidis Biological Control4: 157-1 62 15 Chen, G., Y Zhang, J Li, G.B Dunphy, Z.K Punja and J.M Webster 1996 Chitinase activity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, bacterial associates of entomopathogenic nernatodes Journal of lnvertebrate Pathology 68: 101-108 16 Einholm A.P, Pedersen K.E, Wind T, Kulig P, Overgaard M.T, Jensen J.K, Bodker J.S, Christensen A, 2003: The Biochemical Journal, 373: 723 - 732 17 Folkes A., Roe M.B., Sohal S., Golec J., Faint R., Brooks T., Charlton, P., 2002: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11: 2589 - 2592 64 18 Hu, K and J.M Webster 1998 ln vitro and in vivo characterization of a smallcolony variant of the primary form of Photorhabdus luminescens MD (Enterobacteriaceae) Applied and Environmental Microbiology 64: 3214-3219 19 Hu, K., J Li, W Wang, H Wu, H Lin and J.M Webster 1999 Cornparison ofmetabolites produced in vitro and in vivo by Photorhabdus luminescens, a bacterial symbiont of the entomopathogenic nematode Heterorhabditis megidis Canadian Journal of Microbiology 44: 1072-1 077 20 Li J, G Chen, J.M Webster and E Czyceskwa 1995 Antimicrobial metabolites from a bacterial symbiont Joumal of Natural Products 58: 1081 -1085 21 Li J, G Chen, and J.M Webster 1997 Nematophin, a novel antimicrobial substance produced by Xenorhabdus nematophilus (Enterobacteriaceae).Canadian Journal of Microbiology 43: 770-773 22 Li, J., K Hu and J.M Webster 1998 Antibiotics from Xenorhabdus spp and Photohabdus spp (Enterobacteriaceae) Journal of Heterocyclic Compounds 11: 1561-1570 23 Li J, Chen G , Wu H Webster JM, Identification of Two Pigments and a Hydroxystilbene Antibiotic from Photorhabdus luminescens, 1995 24 Li J, Chen G Webster JM, Nematophin, a novel antimicrobial substance produced by Xenorhabdus nematophilus (Enterobactereaceae), 1997 25.Lautru S, Gondry M, Genet R, Pernodet J.L 2002: Chemistry & Biology, 9: 1355-1364 26 Martins M.B, Carvalho I, 2007: Tetrahedron, 63: 9923-9932 27 Mclnemey, B.V., R.P Gregson, M.J Lacey, R.J Akhurst, GR Lyons, S.H Thodes D.R.3 Smith, M.E Lutz and A.H White 1991a Biologically active metobolites from Xenorhabdus spp Part Dithiolopyrrolone derivatives with antibiotic activity Journal of Natural Products 54: 774-785 65 28 Mclnemey, B.V., W.C Taylor, M.J Lacey, R.J Akhurst and R.P Gregson 1991 b Biologically active metobolites from Xenortiabdus spp Part Benzopyran-1 -one derivatives with gastroprotective activity Journal of Natural Products 54: 785-795 29 Ng , K.K and J.M Webster 1997 Antimycotic activity of Xenorhabdus bovienii (Enterobacteriaceae) metabolites against Phytophthora infestans on potato plants Canadian Joumal of Plant Pathology 19: 125-132 Nguyen, K.B and G.C Smart Jr 1992 Steinemema neocurtillis n sp (Rhabditida: Steinemematidae) and a key to species of the genus Steinemema Joumal of Nematology 24: 463477 30 Nguyễn Ngọc Châu, 2008 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Việt Nam Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội, 238 – 322 31 Nguyễn Ngọc Châu, 1998 Nghiên cứu sử dụng tuyến trùng phòng trừ sinh học sâu hại tròng Việt Nam Tạp chí khoa học cơng nghệ 36 (3): 24 -29) 32 Nguyễn Ngọc Châu, Lại Phú Hoàng, 2001 Hiệu lực gây chết khả sinh sản số chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng bướm sáp lớn Tuyển tập Cơng trình nghiên cứu Viên Sinh thái Tài nguên sinh vật (1996 – 2000).Nxb KHKT, Hà Nội, 182 – 187 33 Nguyễn Ngọc Châu,Vũ Tú Mỹ, Lại Phú Hoàng, Phan Kế Long, 2005 Một số thành tựu nghiên cứu sử dụng tuyến trùng cho phòng trừ sinh học sâu hại trồng Việt Nam Báo cáo khoa học Sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội thảo quốc gia lần thứ nhất.Nxb Nông nghiệp Hà Nội: 680 – 689 34 Maxwell, P.W., G Chen, J.M Webster and G.B Dunphy 1994 Stability and act ivities of anti biotics prod uced du ring infection of the insect Galleria mellonella by two isolates of Xenorhabdus nematophilus Applied and Environmental Microbiology 60: 715-721 66 35 Phan Kế Long, Nguyễn Ngọc Châu, Moens, M., 2003: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb KHKT, Hà Nội, 670-673 36 Phan, K.L, Subbotin, S.A Waeyenberge, L, Moens, M, 2005: A new entomopathogenic nematode, Steinernema robustispiculum n sp (Rhabditida : Steinernematidae), from Chumomray National Park in Vietnam Systematic Parasitology, 60: 23-32 37Phan Kế Long, 2004 Cây phát sinh chủng loại số chủng Steinernema Việt Nam sơ giải mã vùng ITS – rDNA Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống hướng nông, lâm nghiệp miền núi Nxb KHKT, Hà Nội 156 – 159 38 Poinar, GO 966 The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinemematidae: Nematoda) Nematologica 12: 105-1 08 39 Poinar, GO 1985 Neoaplectana intemedia n sp (Steinemematidae: Nematoda) from South Carolina Revue de Nematology 8: 321-327 35 Peter J lsaacson, Antimicrobial activity of Xenorhabdus sp (Enterobacteriaceae), symbiont of the entomopathogenic nematode, Steinernema riobrave (Rhabditida: Steinernematidae),1994 Stock, S.P., Campbell, J.F and Nadler, S.A (2001) Phylogeny of Steinernema Travassos, 1927 (Cephalobina: Steinernematidae) inferred from ribosomal DNA sequences and morphological characters Joournal of Parasitology 87, 877-889 Spiridonov, S.E., Reid, A.P., Podrucka, K., Subbotin, S.A and Moens, M (2004) Phylogenetic relationship within the genus Steinernema (Nematoda: Rhabditida) as inferred from analyses of sequences of the ITS15.8S-ITS2 region of rDNA and morphological features Nematology 6, 547566 67 Swofford, D.L (1998) PAUP* Phylogenetic analysis using parsimony Version Sinauer, Sunderland, MA 128 pp 40 Sundar Chang FN,The role of guanosine-3',5'-bis-pyrophosphate in mediating antimicrobial activity of the antibiotic 3,5-dihydroxy-4-ethyltrans-stilbene, 1992 41 Seunguk Paik, Young Hwan Park, Seong Suh, Hyun Su Kim, In Sun Lee, Myung Kwang Park, Chun Soo Lee, and Sun Ho Park, Unusual Cytotoxic Phenethylamides from Xenorhabdus nematophilus, 2001 Tailliez, P., Pages, S., Ginibre, N and Boemare, N (2006) New insight to diversity in the genus Xenorhabdus, including the description of ten novel species International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56, 2805-2818 42 Thaler, J.O, S Baghdiguian and NE Boemare 1995 Purification and characterization of nematophilicin, phage tail like bacteriocin, from the lysogenic strain FI of Xenorhabdus nematophilus Applied and Environmental Microbiology 61 : 2049-2052 43.Thaler, J.O, M.H Boyer-Giglio and N.E Boemare 1997 New antimicrobial barriers produced by Xenorhabdus spp and Photohabdus spp to secure the monoxenic development of entomopathogenic nematodes Symbiosis 22: 205-215 44.Wang S, Golec J, Miller W; Milutinovic S, Folkes A, Williams S, Brooks T, Hardman K, Charlton P, Wren S, Spencer J, 2002: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 12: 2367 - 2370 45 Webster J.M, Chen G, Hu K, Li J, 2002: Bacterial Metabolites Entomopathogenic Nematology CABI Publishing: 99-114 68 PHỤ LỤC MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NHÂN NI VI KHUẨN Mơi trường MacConkey Agar (Difco 1969) 15,0 gr Pepton 3,0 gr Proteose Pepton 10,0 gr Lactose 1,5 gr Bile Salt #3 5,0 gr Sodium Chloride 13,5 gr Bacto Agar 0,03 gr Neutral Red 0,001 gr Crystal Violet 69 1lit nước cất Hoà tan hỗn hợp khơ nước, đun nóng đến nhiệt độ sôi để Agar tan Hấp 121 0C 15 phút Pha vô trùng nguội chưa đông đặc Môi trường NTBA (Akhurst, 1986) 15,0 gr Pepton 3,0 gr Proteose Pepton 13,5 gr Bacto Agar 0,025 gr Bromothymon Blue (BTB) 0,04 gr Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) 1lit nước cất Hoà lẫn NA BTB.Hấp 121 0C 15 phút Chỉ trước rót đĩa(agar < 500C), thêm TTC Nếu TTC vô trùng , cân cẩn thận tí cốc khuẩn rót vào mơi trường hấp Xốy nước để trộn Nếu TTC khô, thêm vài nl nước cất cho qua siêu phin lọc trước cho vào môi trường nguội.TTC hỏng thêm vào mơi trường q nóng 70 .. .VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC “NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM. .. Long cộng sự, 2003) nhiên chưa có nghiên cứu VKCS sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chúng chúng tơi thực hiên đề tài Nghiên 11 cứu hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn cộng sinh với. .. rộng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (entomopathogenic nematodes – EPN) đối tượng để tìm hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp vi khuẩn cộng sinh với chúng, Xenorhabdus Steinernema