PROTEOMICS TRONG NGHIÊN cứu BIOMARKER

Proteomics nghiên cứu biomarker I Mở đầu II Tổng quan tài liệu II.1 Biomarker II.1.1 Định nghĩa nhu cầu biomarker II.1.2 Phương pháp nghiên cứu biomarker II.1.3 Những thành nghiên cứu biomarker II.1.4 Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker II.1.5 Khả nghiên cứu lợi ích ứng dụng biomarker Việt Nam: II.2 Proteomic 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Ý nghĩa proteomics khoa học ngày II.3 III Proteomic nghiên cưứ biomarker Vật liệu phương pháp nghiên cứu III.1 Vật liệu nghiên cưứ III.2 Phương pháp nghiên cứu III.2.1Tinh lọc protein mẫu phẩm III.2.2Phân tách phân tích protein III.2.3Kỹ thuật khối phổ III.2.4Công nghệ cân hạt III.2.5Công nghệ ProteinChip SELDI IV Quy trình thí ngiệm IV.1 Thu mẫu IV.2 Chuẩn bị mẫu IV.3 Điện di hai chiều IV.4 Phân tích gel điện di IV.5 Cắt thủy phân spot IV.6 Chứng thực biomarker phát V Kết VI Khả nghiên cứu ứng dụng Việt Nam Proteomics nghiên cứu biomarker PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU BIOMARKER I Mở đầu Biomarker tập thể số gene hay protein tiêu biểu cho trạng thái thay đổi sinh học Vì vai trò nghiên cưứ proteomics biomarker thiết yếu Tuy nhiên số lượng lớn protein đặc biệt chất phức tạp protein trở ngại lớn cho nghiên cưứ biomarker Ý thức tầm quan trọng biomarker, viện Nghiên cứu Y tế Quốc Gia Hoa Kỳ (NIH) lập chương trình với ngân quỹ 100 triệu dollar đặc trách giải vấn đề đẩy mạnh tiến proteomics Mục đích thiết lập tài trợ mạng lưới liên kết nhứng phòng thí nghiệm giới nghiên cưứ proteomics, đồng hóa hồn chỉnh kỹ thuật phương pháp proteomics cho mạng lưới nghiên cứu Việc đồng hóa quan trọng phương diện kỹ thuật thực tế, thường có khác biệt số lượng biomarker thu nhận từ phòng thí nghiệm khác Việc liên kết mạng lưới phòng thí nghiệm nhằm tiến đến tạo dựng kho kiện biomarker cho loại bệnh lý đề tài sinh học.[2] II II.1 Tổng quan tài liệu Biomarker [3] II.1.1 Định nghĩa nhu cầu biomarker: Biomarker phân tử biểu kiện sinh học Biomarker đơn hóa chất, glucose dấu ấn bệnh tiểu đường, phân tử protein kháng thể (antibody) dấu ấn bệnh nhiễm trùng, gene hay DNA marker dấu ấn cho bệnh liên quan đến di truyền Với phát triển kỹ thuật tân sinh học có khả nghiên cứu nhiều phân tử mẫu phẩm microarray, proteonomics, ngày biomarker thường nhóm gene hay protein kiện sinh học Proteomics nghiên cứu biomarker Về bệnh lý, khác với yếu tố bệnh (pathogen agent) mô tả dạng thức phân tử gene hay vi khuẩn “nguyên nhân” gây bệnh, biomarker “biểu hiệu” (symbol) bệnh Những biểu bao gồm tất thay đổi tế bào có liên quan đến bệnh lý Như vậy, biomarker bao gồm phân tử gây bệnh phân tử tạo sau bệnh phát triển Biomarker gọi tượng sinh học, nghiên cứu gần chứng minh tính hữu dụng biomarker cho nhiều mơn sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng Các nhà nghiên cứu biomarker tin tưởng chữ ký sinh học chứa đựng bí ẩn bệnh lý, việc truy tìm chữ ký sinh học giúp đạt kết có tầm ứng dụng hữu hiệu lớn lao y học Những ứng dụng gồm phương pháp chẩn đốn xác cho bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh ), bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh yếu tố mơi trường Biomarker có nhiều kỳ vọng ứng dụng đo lường hiệu ứng thuốc Vì lý trên, biomarker nghiên cứu trọng yếu tân sinh học năm qua, có kết cho thấy tầm quan trọng biomarker việc mang lại ứng dụng gene cho chẩn đoán bệnh lý nhiều khía cạnh y học, khoa học khác Những ứng dụng chẩn đoán biomarker phác họa cho thấy tương quan lớn lao biomarker nhiều ngành mơn sinh học Thực khó trình bày khía cạnh biomarker giới hạn viết nàỵ 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu biomarker: Như nêu trên, biomarker bao gồm nhiều dạng, từ hóa chất gene protein Các phương pháp truy tìm biomarker chủ yếu dò tìm phân tử protein, protein sản phẩm cuối gene tác động trực tiếp đến tượng sinh học Lý quan trọng Proteomics nghiên cứu biomarker protein thành phần sinh học phong phú tế bào so với mRNA hay xa gene Một gene có nhiều mRNA chu trình dịch mã (translation) biến đổi sau dịch mã (post translational modification) thường tạo nhiều protein số mRNA Theo ước lượng nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein từ số lượng khoảng 30.000 gene gene người Sự phong phú dạng thức số lượng protein dấu ấn làm bật lên khác biệt tượng sinh học tế bào có thay đổi Một số nhóm nghiên cứu dùng kiện biểu gene (gene expression profile) làm biomarker, kết hợp protein RNA, DNA để có độ xác cao hơn, đương nhiên phức tạp Gần đây, tượng methyl hóa DNA RNAi đối tượng nghiên cứu biomarker vai trò quan trọng chúng việc điều hành chức gene liên hệ đến bệnh lý Có thể nói nguyên tắc, tìm kiếm biomarker đơn giản nhiều so với việc truy tìm gene bệnh lý Khác với nghiên cứu gene bệnh lý, biomarker khơng đòi hỏi tìm hiểu chế thường phức tạp mơ hình bệnh Theo định nghĩa, biomarker tất thay đổi tế bào biểu từ trạng thái sinh học so với trạng thái sinh học khác Nói bệnh tật, biomarker tất protein thay đổi từ trạng thái bình thường đến trạng thái bệnh lý Cho nên, phương pháp xác định biomarker dựa hai bước kỹ thuật là: ly trích protein so sánh thay đổi protein mẫu phẩm Về thực dụng, việc tìm kiếm biomarker qua số giai đoạn có khó khăn chưa giải chất mẻ mơn khoa học Các giai đoạn gồm: - Tinh lọc protein mẫu phẩm: Nhiều nghiên cứu biomarker cần tinh lọc mẫu phẩm để làm giàu (enrich) nồng độ protein liên hệ đến biomarker Việc tinh lọc nhằm mục đích loại bỏ protein có nồng độ cao Proteomics nghiên cứu biomarker thường khơng có vai trò quan trọng bệnh lý serum albumin máu, protein tạo thình tế bào actin, tubulin Việc lọc protein thực nhiều phương pháp sinh hóa sắc ký, dùng kháng thể đơn dòng để loại protein Việc làm giàu protein có tầm quan trọng kỹ thuật, nghiên cứu từ tiến trình sinh học tế bào bệnh lý cho thấy protein có vai trò chức (functional proteins) thường biểu nồng độ thấp, nM so với mM, protein cấu trúc (structural proteins) hay vận chuyển (carier proteins) - Các phương pháp ly trích phân tích protein: Có nhiều phương pháp ly trích protein áp dụng để khởi cơng truy tìm biomarker Các phương pháp nhằm phân lập protein sai biệt hai trường hợp sinh học Sắc ký cột (chromatography column), điện di protein hai chiều (2 D protein gel electrophoresis) hai phương pháp thông dụng Phương pháp sắc ký cột loại ion axit hay kiềm để ly trích protein dựa theo đặc tính axit kiềm; dựa vào độ ưa nước (hydrophyllic) hay kỵ nước (hydrophobic) Phương pháp điện di protein hai chiều giúp so sánh khác biệt protein dựa trọng lượng phân tử (molecular weight) điện tích (charges) protein Cả hai phương pháp sắc ký cột điện di có trở ngại số lượng protein phân tích giới hạn Điện di hai chiều phân tích khoảng từ 2.000 đến 10.000 protein điện di đồ; biết số nhỏ so với tổng số protein từ 300.000 đến 500.000 phân tử tế bào Trong nghiên cứu hậu genome, ngành proteomics cộng với kỹ thuật khối phổ (mass spectrometry) tạo bước tiến đột phá cho mơn nghiên cứu biomarker Kỹ thuật gọi Mass-spect /Proteonomic-based Approach Trong kỹ thuật này, protein ion hóa để tách khỏi phức hợp mẫu phẩm, sau phân tử protein phá tan thành mảnh nhỏ trải biểu đồ gồm đoạn peptide xếp theo tỷ số trọng lượng điện tích Các protein biểu đồ Proteomics nghiên cứu biomarker so sánh với kiện protein thiết lập từ proteomics từ loại (type) cấu trúc (structure) protein xác định xác Việc so sánh biểu đồ protein từ mẫu bệnh lý protein từ mẫu không mang bệnh cần hệ thống điện toán chuyên trách (như Correlogic Systems, Inc dùng NIH) để nhận diện số protein có khả biomarker bệnh Các mẫu phẩm máu, tế bào, mô (tissues), dịch tiết từ tuyến Với khả máy khối phổ nay, thí nghiệm biomarker xác định hàng ngàn protein từ lượng nhỏ mẫu giọt máu Việc xác định giá trị biomarker se đòi hỏi chương trình nghiên cứu lâm sàng thống kê qui mô 2.1.3 Những thành nghiên cứu biomarker: Vì giá trị khoa học biomarker, việc nghiên cứu đề tài triển khai nhiều trung tâm nghiên cứu sinh học y khoa nhiều quốc gia Về kỹ nghệ, hãng chuyên chẩn đoán Roche, Chiron, Abbott có phương hướng rộng lớn nghiên cứu biomarker; ngồi hãng cơng nghệ sinh học chuyên biomarker Ciphergene Biosystem, Pathway Diagnostics, Thirdwave, Digene đà phát triển Đặc biệt với nhóm đại kỹ nghệ dược khoa Pfizer, Novartis, Bristol Meyers, biomarker sử dụng chung với thí nghiệm thiết yếu độc tính (toxicology), dược tính (pharmacology) qui trình thẩm định giá trị lâm sàng dược phẩm Từ cơng trình nghiên cứu biomarker nhiều trung tâm nghiên cứu, có thành hứa hẹn ứng dụng tốt đẹp biomarker cho việc chẩn đoán bệnh trị liệụ Việc ứng dụng biomarker để hoàn chỉnh thay thử nghiệm thường quy vấn đề thời gian Những biomarker nhằm giúp tiên đốn sớm xác trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch biến dưỡng; biomarker có giá trị tiên đoán hiệu ứng thuốc để giúp chuyên gia y tế lấy định đắn cho việc điều trị bệnh nhân Đi xa nữa, biomarker Proteomics nghiên cứu biomarker có tiềm ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân (personalized medicine) Hiện có nhiều biomarker tìm thấy từ chương trình nghiên cứu trung tâm hãng dược phẩm giới Kết từ Viện nghiên cứu Y tế Hoa Kỳ (NIH) thu thập 14 protein có khả dùng làm biomarker cho bệnh ung thư vú (breast cancer) từ phân tích khối phổ với mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân Trong nhóm thử nghiệm, độ xác biomarker cao so với việc dùng gene BRCA (BRCA gene bệnh ung thư vú di truyền tìm thấy phả hệ ung thu vú; nhiên gen có tỉ lệ thấp từ 2-5% bệnh dùng chẩn đoán quần chúng); số protein biomarker khác khám phá từ nghiên cứu bệnh ung thư tiền liệt tuyến (prostate), ung thư phổi (lung), ung thư bàng quang (bladder), ung thư buồng trứng (ovarian); tim mạch có số biomarker protein đề cử liên hệ đến bệnh nghẽn động mạch (arterosclerosis) Như nhiều kết qủa từ trung tâm nghiên cứu khác, biomarker NIH khám phá từ số mẫu thử giới hạn, nên đối tượng cho thử nghiệm thống kê lâm sàng rộng lớn để thẩm định mức tương quan (frequency) quần chúng 2.1.4.Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker Như biết, biomarker tập thể số gene hay protein tiêu biểu cho trạng thái thay đổi sinh học Như nêu trên, tảng nghiên cứu Biomarker dựa protein, vai trò nghiên cứu proteomics thiết yếu Tuy nhiên số lượng lớn lao (dự đoán khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein), đặc biệt chất phức tạp protein trở ngại lớn cho nghiên cứu biomarker Ý thức trở ngại tầm quan trọng biomarker, Viện Nghiên cứu Y tế Quốc gia Hoa Kỳ (NIH) lập chương trình với ngân quỹ khoảng 100 triệu dollar đặc trách giải vấn đề đẩy mạnh tiến Proteomics nghiên cứu biomarker proteomics Mục đích chương trình là: Thiết lập tài trợ mạng lưới liên kết phòng thí nghiệm giới nghiên cứu proteomics; Đồng hóa hồn chỉnh kỹ thuật phương pháp proteomics cho mạng lưới nghiên cứu Việc đồng hóa quan trọng phương diện kỹ thuật thực tế, thường có khác biệt số lượng biomarker thu nhận từ phòng thí nghiệm khác loại bệnh Thu thập từ tài liệu nghiên cứu, có khỏang gần 1.500 biomarker proteins liên hệ đến ung thư đương nhiên việc tiêu chẩn hóa protein thật cần thiết để chọn lọc protein có gía trị ứng dụng Những yếu tố kỹ thuật bao gồm thuốc thử, kháng thể, peptide; quản lý mẫu phẩm, đặc biệt phương pháp ly trích phân tích protein Việc liên kết mạng lưới phòng thí nghiệm nhằm tiến đến tạo dựng kho kiện (consortium) biomarker cho loại bệnh lý đề tài sinh học Các nhà nghiên cứu tiên liệu kho kiện biomarker đóng vai trò trọng yếu chẩn đoán điều trị bệnh tương lai gần Quan trọng nữa, họ tin tưởng kết hợp ngành nghiên cứu gồm tin sinh học (bioinformatics), genomics, y học thực chứng (evidence based medicine), biomaker giúp tạo mô hình phân tử tế bào bệnh lý có khả khảo sát thí nghiệm cụ thể từ biomarker proteins Và đường hướng biomarker có khả đưa đến việc xác định gene có vai trò chủ yếu liên hệ đến bệnh lý phức tạp nhiều gene, thay coi biểu Từ đó, vai trò gene cho chẩn đoán trị liệu khẳng định rõ ràng cộng đồng y học xã hội ln mong đợi Về ứng dụng, nói gía trị biomarker chẩn đốn trị liệu xác định bình diện khoa học Tuy nhiên thực tế đòi hỏi thử nghiệm lâm sàng chi tiết dài hạn, trước triển khai thành sản phẩm có gía trị cộng đồng xã hội Ngòai ra, để sử Proteomics nghiên cứu biomarker dụng hữu hiệu biomarker cần huấn luyện có hệ thống thơng tin khoa học biomarker đến giới chưc y tế gồm bác sĩ chuyên viên thử nghiệm 2.1.5.Khả nghiên cứu lợi ích ứng dụng biomarker Việt Nam: Trong nghiên cứu tân sinh học, biomarker có tính khả thi ứng dụng cao mơi trường nghiên cứu Việt Nam Tính khả thi cao nói trên, biomarker khơng đòi hỏi bước nghiên cứu nhiều thử thách truy tìm gene liên hệ đến bệnh lý, hay việc tạo sản phẩm protein trị liệu, vaccine thường đòi hỏi kỹ thuật cao, cơng phu tốn Trang bị nghiên cứu biomarker máy khối phổ (mass spectrometry) cộng với khả sử dụng chương trình điện tốn proteonomics Đương nhiên, hai kỹ thuật cần đảm trách chuyên viên Ngoài ra, khoa học khác, người đảm trách chương trình khoa học gia có khả suy luận cao chủ đề sinh học để phân tích kiện thu từ nghiên cứu biomarker Trên thực tế, Việt Nam có lợi điểm so với trung tâm nghiên cứu nước tân tiến Những lợi điểm bao gồm số lượng mẫu phẩm dồi cho nhiều loại bệnh; yếu tố cần thiết cho thống kê để thu đựơc biomarker có độ xác cao qua việc xác định loại trừ protein nhóm biomarker Ngồi ra, Việt Nam dồi kiện lâm sàng có vai trò quan trọng việc đánh giá khả ứng dụng biomarker trị liệu Nhưng điểm quan yếu giá trị đặc thù biomarker liên hệ đến chủng tộc; có nhiều kiện lâm sàng kinh nghiệm dân gian cho biết tần số cao bệnh xảy người Việt so sánh với chủng tộc khác Việc xác định “dấu ấn” sinh học chủng tộc Việt Nam hứa hẹn cac ứng dụng thiết thực mang lại dịch vụ y tế hữu hiệu, có phẩm chất cao cho quần chu’ng Các dấu ấn chủ đề quan trọng cho nghiên cứu y học từ nguyên bệnh lý tác động môi trường, dược Proteomics nghiên cứu biomarker học việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu dược phẩm Việt Nam II.2 Proteomics 2.2.1 Định nghĩa Macr Wilkins người đưa khái niệm proteome (hệ protein ) bổ trợ genome Nếu proteome coi tập hợp protein mã hóa biểu genome, genome bao hàm tồn gen thể genomic khoa học nghiên cứu genome proteomics khoa học nghiên cứu proteome Proteomics coi môn khoa học nghiên cứu sản phẩm genome tập hợp protein biểu tế bào, mô thể dièu kiẹn thời gian xác dịnh Proteomics bao gồm nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung cấp kiến thức tổng quan cấu trúc, chức protein vai trò chúng điều hòa hoạt động hệ sinh học.Những cải tiến trang thiết bị phương pháp cho phép mở rộng phạm vu nghiên cứu từ phân tích hóa sinh protein đơn lẻ đến việc nhận dạng xác định phức hợp protein Cũng vậy, proteomics trở thành môn quan trọng khoa học sống công nghệ sinh học.[1] 2.2.2 Ý nghĩa proteomics khoa học ngày Sự tồn ORF (opne reading frame - tạm dịch khoảng đọc mở hay khoảng đọc bỏ ngõ) liệu gene khơng đơn giản ngụ ý tồn gene mang chức Bất chấp tiến công cụ hổ trợ bioinformatics, người ta khơng thể dễ dàng định cách xác chức gene từ liệu genome Ở đây, vài ý kiến đưa cho so sánh trình tự genome sinh vật với sinh vật khác (giống sư so sánh trình tự prortein) để tìm chức gene dựa gene biết Thực nghiệm cho thấy, 10 Proteomics nghiên cứu biomarker khuynh hướng có thành cơng định nhìn chung tỷ lệ thành công thấp Đặc biệt với trường hợp sinh vật có gene nhỏ, với gene có độ tương đồng thấp hay chí khơng có tương đồng với gene phương pháp so sánh tương đồng lại hồn tồn khơng dùng sai tồn Chẳng hạn với gen Mycoplasma genitalium, tính tốn gần cho thấy, lỗi sai phạm 8% số 340 gene ghi (gene ghi hiểu gene xác định trình tự, vị trí chức chưa biết) Do vây, suy luận rộng cho trường hợp gene người với lỗi sai phạm đó, người ta hình dung hậu Do vậy, việc thẩm tra sản phẩm gene xem bước quan trọng việc "ghi gene" Ở lên vai trò độc đáo phương pháp proteomics, người ta khơng thể "nhìn" trình tự DNA để phán đốn, nghiên cứu hiệu chỉnh protein sau phiên mã, trình tạo đãng isoform protein Rõ ràng có phương pháp proteomics cho phép nhà nghiên cứu làm công việc Hơn nữa, điều cần thiết người ta phải xác định mối tương quan mức độ mRNA mức độ biểu protein hai yếu tố này, có mà khơng có mối tương quan Một vấn đề mà thơng tin trình tự gene khơng thể cung cấp cho nhà nghiên cứu định vị sản phẩm gene (tức vị trí mà protein thể chức tế bào) Một vấn đề mà thơng tin trình tự gene khơng thể cung cấp cho nhà nghiên cứu định vị sản phẩm gene (tức vị trí mà protein thể chức tế bào) Mở rộng vấn đề, rõ ràng, chế điều hòa chức protein thơng qua phân giải (proteolysis), tái chế (recycling) hay cô lập (sequestration) tế bào khơng thể "nhìn thấy" tren thông tin gene Cuối cùng, tương tác protein-protein thành phần cắu trúc nên tế bào (các quan tử) xác định mức độ protein.Về mặt phương pháp luận Proteomics dựa 11 Proteomics nghiên cứu biomarker phương pháp có hiệu suất cao để phân tách phân tích protein hệ thống sống Việc sử dụng phương pháp cung cấp tất thơng tin tồn diện đặc tính sinh hóa protein hệ thống sống biểu hiện, hiệu chỉnh sau phiên mã, tương tác Lĩnh vực Proteomics phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia Nó, với genomics, nằm vị trí đầu chương trình nghiên cứu khoa học ứng dụng, khoa học bản, y-dược học ngành liên quan Năm 2001, tổ hợp quốc tế bao gồm nhà khoa học, kinh tế, trị đạ hình thành Tổ chức Proteome Người (HUPO-Human Proteome Organization) Mục đích HUPO khám phá tất phân tử protein người; lập đồ vị trí protein tế bào, mơ, quan; xác lập tất tương tác protein-protein; nâng cấp sở liệu thông tin quan trọng; dò tìm phân tử marker protein quan trọng để nhận diện bệnh Ngược lại với HUGO (Human Genome Organization), HUPO không đưa thời điểm định hồn tất dự án, với HPG, số nucleotide kiến tạo gene người xác định, số protein người biến thiên tuỳ thuộc điều kiện sống, điều kiện bình thường hay bệnh lý Mặc dù vừa có nhìn lướt qua proteoin câu hỏi: Proteome hay proteomics nghĩa gì? Phương pháp luận proteomics gì? Thành tựu quan trọng mà ngành mang lại cho nhân loại gì? Các phương pháp để nghiên cứu proteomics tương lai Thật sự, khơng trả lời trọn vẹn câu hỏi trên, đơn giản phương pháp luận kỹ thuật áp dụng phát triển theo ngày, khiến người ta khó lòng bắt kịp Trung bình hai năm lần, hãng cung cấp trang thiết bị dành cho nghiên cứu proteomics phải nâng cấp tất hệ máy móc mà họ bán để đáp ứng nhu cầu nhà nghiên cứu, ngược lại nhà khoa học phải thay đổi phương pháp tiếp cận, thay đổi máy móc để đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu không muốn bị tụt hậu Tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu khác cơng ty, trường, viện nghiên trang 12 Proteomics nghiên cứu biomarker bị dòng máy móc, trang thiết bị khác (cơ khác giá cả, hiệu xuất) Có điều cần ý là, khơng ngành nghiên cứu khác hình thành phát triển thời kỳ hậu genome (ví dụ transcriptome, nghiên cứa mRNA) vốn có đối tượng nghiên cứu hạn chế, proteomics ngược lại ngành nghiên cứu khơng có biên giới, không giới hạn đối tượng, hướng nghiên cứu 2.3 Proteomics nghiên cứu biomarker Protein thành phần sinh học phong phú tế bào so với mRNA hay xa gen Một số nhóm nghiên cứu dung kiện biểu gen làm biomarker, kết hợp protein RNA, DNA để có độ xác cao hơn, phức tạp hơn.Gần đây, methyl hóa DNA RNA đối tượng nghiên cứu biomarker Về nguyên tắc tìm kiếm biomarker đơn giản nhiều so với truy tìm gen bệnh lý Vì biomarker có thay đổi tế bào biểu từ trạng thái sinh học so với trạng thái sinh học khác Phương pháp xác định biomarker dựa hai bước ký thuật : phân tách protein so sánh thay đổi protein mẫu phẩm III III.1 Vật liệu – Phương phap nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu Các dịch thể người, đặc biệt huyết tương máu, huyết 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tinh lọc protein mẫu phẩm Có nhiều phương pháp để phân tách protein, phát biomarker: + Phương pháp sắc ký cột loại ion acid hay kiểm để phân tách protein dựa theo đặc tính acid,kiềm, dựa vào độ ưa nước hay kỵ nước + Phương pháp điện di protein hai chiều so sánh khác biệt protein dựa trọng lượng phân tử điện tích protein 3.2.2 Phân tách phân tích protein 13 Proteomics nghiên cứu biomarker Số lượng protein phân tích giới hạn: điện di hai chiều phân tích 2.000-10.000 protein điện di đồ (so với tổng số protein 300.000-500.000 phân tử tế bào).Phương pháp xác định ngày cung cấp thông tin cách phổ biến biến đổi cấu trúc protein đặc trưng mà không cần biết trước biến đổi MS tìm hiểu nhóm protein, xác định rõ ràng đầy đủ chức nóBiến đổi chuỗi gene trình biến đổi sau dịch mã phản ánh khối protein 3.2.3 Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry) Phương thức khối phổ từ lên ,Các mảnh peptit thành phần phát thông qua MS.Dễ dàng hơn: ion hóa hiệu quả,nhạy, xác Tăng phức tạp mẫu, vật liệu đưa từ vào, phần lớn chuỗi protein chưa phân tích nên khơng phát biến đổi chuỗi protein Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry)Phương thức khối phổ từ lên Xét nghiệm protein tự nhiên, làm điểm peptit Phần lớn phát marker ung thư làm sau ứng dụng công nghệ SELDI, vốn phương thức biến đổi từ xuống Việc xác định protein tương đồng khó khăn phân tích đồng thời lượng lớn protein Xu gần đây: tập trung loại protein huyết tương có hàm lượng cao (85% tổng khối lượng) Hầu hết protein marker phát qua SELDI mảnh peptit khu vực m/z thấp Mang tính chất số lượng, chưa tính đến bất hoạt protein Cách để thu lượng chuỗi protein đầy đủ giải mã khối lượng protein hoàn chỉnh Kỹ thuật khối phổ (Mass Spectrometry).Sử dụng thư viện hạt tảng phối thể dạng peptide tổ hợp 3.2.4 Công nghệ cân hạt Pha lỗng protein có nồng độ cao cố định protein nồng độ thấp Các phương pháp cố định khử muối thường mát protein gặp 14 Proteomics nghiên cứu biomarker vấn đề khả tái sinh Kết hợp công nghệ cân hạt SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization-tăng cường hiệu ứng laze phân tách/ ion hóa bề mặt) Các chuỗi ProteinChip phát triển để sử dụng trình phát BioMarker mẫu người Gồm in màu (chất bảo lưu) khối phổ 3.2.5 Công nghệ ProteinChip SELDI Ưu điểm: tính sắc phổ bề mặt giúp tách chiết hạt dựa chế lọc mạnh mẽ, nhanh chóng, đòi hỏi số lượng thấp mẫu IV Quy trình thí nghiệm 4.1 Thu mẫu Thu mẫu huyết thanh, nước tiểu, dịch tế bào bệnh viện Huyết hay huyết tương mẫu phẩm dễ lấy nhất, nguồn mẫu thường xuyên,nhưng có độ đa dạng cao protein, cản trở phát biomarker (nồng độ thấp ) Nứơc tiểu có nồng độ protein thấp nhiều muối ure gây khó khăn phân tích, protein cần thiết dễ bị phân tích 4.2.Chuẩn bị mẫu Làm giàu protein cần thiết Sắc kí: tách nhóm nhỏ protein có chung đặc tính Kháng thể đơn dòng: cung cấp nhân tố chọn lọc giống cấu trúc tinh lực kháng nguyên, cho phép khôi phục kháng nguyên từ hỗn hợp thô, loại bỏ chất bẩn đặc trưng từ giai đoạn chuẩn bị Phân lập công nghệ cân hạt: cho thấy kết phân tích có số đỉnh cao lớn gấp 2-3 lần so với mẫu Phương pháp lọc liên tiếp bước bước Tăng số lượng mẫu Chuẩn bị mẫu Lọc liên tiếp bước bước.Đều thực bước ban đầu giống Chỉ khác số lần lọc thành phần đệm lọc Huyết thanh: lọc liên tiếp bước số đỉnh nhọn xác định cao hơntrên tất chuỗi hóa học 15 Proteomics nghiên cứu biomarker Nước tiểu: phương pháp bước cho chất lượng quang phổ cao tất bước phân lập Dịch lọc TUC (2.2M thiourea, 7.7M urea, 4.4% CHAPS) lọc liên tiếp bước sử dụng trực tiếp cho trình điện di chiều Lọc liên tiếp bước bước Tăng số lượng mẫu khiến cố định nhiều protein thực thể hơn, đặc biệt phạm vi khối lượng nhỏ Chuẩn bị mẫu: Kĩ thuật điện di: hoạt động nhờ vào lực kéo điện trường tác động vào phân tử tích điện kích thước lỗ thể Dựa đặc điểm vật lý chúng kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích.Kết hợp điện di theo khối lượng phân tử điểm đẳng điện tạo nên kỹ thuật điện di chiều 4.3 Điện di hai chiều Nhiệm vụ chính: Xác định tất spot protein gel Tìm spot giống nhau, khác biệt gel với nhau.Tìm spot có gel mà khơng có gel khác Các spot protein biểu tăng, giảm gel khác Bản gel điện di quét vào thiết bị phân tích tự động xử lí phần mềm có sẵn 4.4 Phân tích gel điện di Các spot khác biệt gel so sánh với cắt riêng khỏi gel điện di 4.5 Cắt thuỷ phân spot Tiến hành: Tẩy màu thuốc nhuộm.Thủy phân thành oligopeptid, chuẩn bị cho việc phân tích khối phổ.Tất tiến hành tự động hệ thống thiết bị chuyên dụng Hệ thống Xcise (Shimadzu) Phân tích khối phổ tự động với chế độ MALDI-TOF MS Số liệu thu được đối chiếu với sở liệu NCBI (Trung tâm Thông tin CNSH Quốc gia Hoa Kì) nhờ phần mềm MASCOT để nhận dạng protein Máy khối phổ đại xác định hàng ngàn protein từ.Xác định spot protein phân tích khối phổ 16 Proteomics nghiên cứu biomarker lượng nhỏ mẫu giọt máu thí nghiệm biomarker Xác định giá trị biomarker đòi hỏi chương trình nghiên cứu lâm sàng thống kê qui mơ.Xác định spot protein phân tích khối phổ Đây phương diện khó khăn chẩn đốn biomarker Phương thức xác định miễn dịch :Được sử dụng nhiều bắt đầu cần chứng thực biomarker Dễ dàng sử dụng lọc tốc độ cao, quy mô lớn, nghiên cứu để xác thực biomarker phát chẩn đoán proteomic Không thể phát protein bị biến đổi cấu trúc mà có vai trò (ví dụ chất thị ung thư) Chứng thực liệu bắt nguồn từ chẩn đoán proteomics biến đổi cấu trúc protein dễ dàng thực sử dụng Mass Spectrometry 4.6 Chứng thực biomarkers phát Những thành triển khai nhiều trung tâm nghiên cứu sinh học y khoa nhiều quốc gia Những hãng chuyên chẩn đốn (Roche, Chiron, Abbott) có phương hướng rộng lớn nghiên cứu biomarker Các hãng công nghệ sinh học chuyên biomarker Ciphergene Biosystem, Pathway Diagnostics, Thirdwave, Digene đà phát triển Các nhóm đại kỹ nghệ dược khoa Pfizer, Novartis, Bristol Meyers, biomarker sử dụng chung với thí nghiệm thiết yếu độc tính, dược tính qui trình thẩm định giá trị lâm sàng dược phẩm V Kết Những thành hứa hẹn ứng dụng tốt đẹp biomarker cho việc chẩn đoán bệnh trị liệu Có giá trị tiên đốn hiệu ứng thuốc Tiên đốn sớm xác trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch biến dưỡng Biomarker có tiềm ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân Những vấn đề cần hoàn chỉnh để ứng dụng biomarker Sự phát triển ngành proteomics tảng nghiên cứu biomarker Viện Nghiên cứu Y tế Quốc gia Hoa Kỳ lập chương trình (với ngân quỹ 17 Proteomics nghiên cứu biomarker khoảng 100 triệu dollar) giải vấn đề đẩy mạnh tiến proteomics Về phương diện kỹ thuật: việc đồng hóa quan trọng thực tế có khác biệt số lượng biomarker thu nhận từ phòng thí nghiệm khác loại bệnh Về ứng dụng: Đòi hỏi thử nghiệm chi tiết (lâm sàng dài hạn), trước triển khai thành sản phẩm có gía trị cộng đồng xã hội Đào tạo có hệ thống thông tin khoa học biomarker đến giới chức y tế (bác sĩ chuyên viên thử nghiệm) Kết Biomarker có tính khả thi ứng dụng cao môi trường nghiên cứu Việt Nam nay.Tính khả thi cao: Khơng đòi hỏi bước nghiên cứu nhiều thử thách truy tìm gene liên hệ đến bệnh lý Khơng đòi hỏi kĩ thuật cao, công phu tốn tạo sản phẩm protein trị liệu, vaccine Thử thách: Trang bị chính: máy khối phổ chương trình điện tốn proteonomics, giá thành cao Cả hai kỹ thuật cần đảm trách chuyên viên Đảm trách phải nhà khoa học khả suy luận cao sinh học để phân tích kiện thu từ nghiên cứu biomarker VI Khả nghiên cứu ứng dụng Việt Nam Hiện nay, Việt Nam có nghiên cứu biomarker Thực tế, Việt Nam có lợi điểm so với trung tâm nghiên cứu nước tân tiến Số lượng mẫu phẩm dồi cho nhiều loại bệnh Dồi kiện lâm sàng để đánh giá khả ứng dụng biomarker trị liệu Quan trọng giá trị đặc thù biomarker liên hệ đến chủng tộc Nhiều kiện lâm sàng kinh nghiệm dân gian cho biết tần số cao bệnh xảy người Việt so sánh với chủng tộc khác Xác định biomarker chủng tộc Việt Nam hứa hẹn ứng dụng thiết 18 Proteomics nghiên cứu biomarker thực y tế, có phẩm chất cao cho quần chúng Khả nghiên cứu ứng dụng Việt Nam Tài liệu tham khảo Proteomics – Phan Văn Chi http://tailieu.vn/view-document/nhung-van-de-can-hoan-chinh-de-ungdung-biomarker.319267.html?lang=en http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/sinhhoc/12907_Biomarker-Dau-an-sinh-hoc-va-giai-phap-cho-chan-doan-trilieu-tuong-lai.aspx 19 .. .Proteomics nghiên cứu biomarker PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU BIOMARKER I Mở đầu Biomarker tập thể số gene hay protein tiêu biểu cho trạng thái thay đổi sinh học Vì vai trò nghiên cưứ proteomics. .. dụng biomarker Việt Nam: Trong nghiên cứu tân sinh học, biomarker có tính khả thi ứng dụng cao môi trường nghiên cứu Việt Nam Tính khả thi cao nói trên, biomarker khơng đòi hỏi bước nghiên cứu. .. phân tích kiện thu từ nghiên cứu biomarker VI Khả nghiên cứu ứng dụng Việt Nam Hiện nay, Việt Nam có nghiên cứu biomarker Thực tế, Việt Nam có lợi điểm so với trung tâm nghiên cứu nước tân tiến Số