TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o Phạm Ngọc Tuyên PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o PHẠM NGỌC TUYÊN PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH PHÂN LẬP TẠI VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN KẾ LONG Hà Nội - 2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng, cảm ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long - chủ nhiệm dự án “Tiếp cận gen khai thác sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Xenorhabdus Photorhabdus”, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện luận văn tốt nghiệp Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy, cô giáo cán Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia, Hà Nội có nhận xét, dẫn quý báu cung cấp tài liệu cần thiết giúp tơi hồn thành nghiên cứu Trong thời gian học tập, thực đề tài nghiên cứu luận văn nhận tạo điều kiện, giúp đỡ nhiệt tình lãnh đạo, đồng nghiệp Phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp khác Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ủng hộ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Học viên Phạm Ngọc Tuyên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i BẢNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 1.1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 1.1.3 Mối quan hệ EPN vi khuẩn cộng sinh 1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 1.2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học đại việc nghiên cứu tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh 21 1.3 KHÁI QUÁT ĐIỀU KIỆN ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN VƯỜN QUỐC GIA BA VÌ 22 1.3.1 1.3.2 Vị trí địa lý 22 Khí hậu 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.2 VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT25 2.2.1 Vật liệu 25 2.2.2 Trang thiết bị 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng28 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 34 2.3.3 Phân tích liệu 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA VÀ THU THẬP MẪU 38 ii 38 25 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LOẠI DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 3.2.1 Đặc điểm hình thái tuyến trùng 39 3.2.2 Kết hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 43 3.3 SẢN PHẨM PCR CỦA CÁC MẪU VỚI MỒI ĐẶC HIỆU 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN 3.4.1 3.4.2 3.4.3 Đối chiếu trình tự tuyến trùng 45 Đối chiếu trình tự vi khuẩn 56 Quan hệ di truyền 73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 81 4.1 KẾT LUẬN 81 4.2 KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 82 Tài liệu nước 83 PHỤ LỤC 82 91 iii 45 43 39 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT EPN VKCS IJs BTB TTC TBE EtBr EDTA TAF WLB : : : : : : : : : : Entomopathogenic nematodes Vi khuẩn cộng sinh Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles) Bromothymon Blue Triphenyltetrazolium Chloride Tris/Borate/EDTA Ethidium Bromide Ethylenediaminetetraacetic axit Triethanolamine formalin Worm Lysis Buffer iv DANH MỤC HÌNH Hình Vòng đời tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Hình Mối quan hệ họ hàng loài Steinernema phân lập Việt Nam (Phan Ke Long, 2004) 20 Hình Bản đồ hành Vườn Quốc Gia Ba Vì 23 Hình Màu sắc ấu trùng bướm sáp lớn tuyến trùng gây chết 39 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn .43 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose với cặp mồi đặc hiệu tuyến trùng 44 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose cặp mồi đặc hiệu vi khuẩn 44 Hình Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS tuyến trùng Steinernema sp.B1 với lồi nhóm 50 Hình Đối chiếu trình tự nucleotit đoạn gen ITS tuyến trùng Heterorhabditis sp.D9 với lồi nhóm 55 Hình 10 Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN VKCS Xenorhabdus sp.B1 với lồi nhóm 63 Hình 11 Đối chiếu trình tự nucleotit gen 16S-rARN VKCS Photorhabdus sp.D9 với lồi nhóm 72 Hình 12 Cây phát sinh chủng loại ME tuyến trùng Steinernema 74 Hình 13 Cây phát sinh chủng loại MP tuyến trùng Steinernema 74 Hình 14 Cây phát sinh chủng loại ME nhóm Heterorhabditis .76 Hình 15 Cây phát sinh chủng loại MP nhóm Heterorhabditis 76 Hình 16 Cây phát sinh chủng loại ME nhóm Xenorhabdus 78 Hình 17 Cây phát sinh chủng loại MP nhóm Xenorhabdus 78 Hình 18 Cây phát sinh chủng loại ME nhóm Photorhabdus 80 Hình 19 Cây phát sinh chủng loại MP nhóm Photorhabdus 80 v DANH MỤC BẢNG Bảng Tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh tương ứng Bảng Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 30 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 31 Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự ADN .33 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng xác định trình tự ADN .33 Bảng Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 36 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 36 Bảng Thành phần loài tuyến trùng thu VQG Ba Vì .38 Bảng Số đo tiêu ấu trùng cảm nhiễm BVB1 40 Bảng 10 Số đo ấu trùng cảm nhiễm BVD9 41 Bảng 11 Thống kê biến đổi nucleotit nhóm Steinernema .73 Bảng 12 Ma trận khoảng cách di truyền nhóm Steinernema theo mơ hình Jukes-Cantor 73 Bảng 13 Sự biến đổi nucleotit nhóm Heterorhabditis 75 Bảng 14 Ma trận khoảng cách di truyền nhóm Heterorhabditis theo mơ hình Jukes-Cantor 75 Bảng 15 Sự biến đổi nucleotit nhóm Xenorhabdus 77 Bảng 16 Ma trận khoảng cách di truyền nhóm Xenorhabdus theo mô hình Jukes-Cantor 77 Bảng 17 Sự biến đổi nucleotit nhóm Photorhabdus .79 Bảng 18 Ma trận khoảng cách di truyền nhóm Photorhabdus theo mơ hình Jukes-Cantor 79 vi MỞ ĐẦU Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có đa dạng phong phú lồi thực vật, bên cạnh nước ta có đa dạng lớn lồi trùng Hàng năm, trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản lượng sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999) Để bảo vệ suất trồng, người nông dân sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác Tuy nhiên, lồi trùng trở nên ngày kháng thuốc trừ sâu, họ phải tăng nồng độ thuốc trừ sâu chí số trường hợp phải sử dụng loại thuốc có độ độc hại cao Điều dẫn đến nồng độ ngày tăng hóa chất độc hại chuỗi thức ăn tự nhiên Xu hướng chung giới Việt Nam sử dụng sản phẩm sinh học để diệt sâu hại mà sản phẩm hữu ích thuốc sinh học tuyến trùng phòng trừ sâu hại Thuốc có nhiều đặc điểm như: có khả ký sinh gây chết cho nhiều loại sâu hại khác nhau; an tồn cho người, động vật, thực vật mơi trường; sâu hại khơng có khả kháng thuốc…(Vũ Tứ Mỹ et al., 2004) Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes – EPN) thuộc hai giống Steinernema Heterorhabditis quan tâm giới khả phòng trừ sinh học sâu hại chúng Cơ chế gây bệnh nhờ vi khuẩn cộng sinh (VKCS) (Xenorhabdus Steinernema Photorhabdus Heterorhabditis) Sau thâm nhập vào vật chủ, vi khuẩn sản sinh nhanh tạo độc tố giết chết vật chủ, thêm vào vi khuẩn tiết số chất chống lại tác nhân cạnh tranh khác môi trường vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993) Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, hoạt chất sinh trình trao đổi chất chủng/loài vi khuẩn có khả kháng sinh, kháng nấm, ngăn chặn tăng sinh tế bào ung thư vì chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus nguồn hợp chất tự nhiên 42.Noel Boemare and Raymond Akhurst (2006) “The genera Photorhabdus and Xenorhabdus”, The Prokaryotes, 6, pp.451-494 43.Patrick Tailliez, Sylvie Pagès, Nadège Ginibre and Noel Boemare (2006), “New insight into diversity in the genus Xenorhabdus, including the description of ten novel species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, p 2805-2818 44.Phan Ke Long, (2004), “Diversity in entomopathogenic nematodes (Steinerrnema and Heterorhabditis spp.) in Vietnam and their potential for the biocontrol of pest insects”, University Gent pp 179 45 Rzhetsky A & Nei M (1992), “A simple method for estimating and testing minimum evolution trees”, Molecular Biology and Evolution, 9, pp.945-967 46.Rzhetsky A & Nei M (1992), “A simple method for estimating and testing minimum evolution trees”, Molecular Biology and Evolution, 9, p.945-967 47.S E Spiridonow et al (2004), “Steinernema jollieti sp n (Rhabditida : Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from the American Midwest” Russian Journal of Nematology, 12(1), p 85-95 48.S Patricia Stock, Christine T Griffin and Rani Chaerani (2004), Morphological hermaphroditum and n molecular sp characterisation (Nemmatoda: of Steinernema Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus”, Nematology, 6(3), pp 401-412 49.S Patricia Stock, Zdenek Mrácek and John M Webster (2000), Morphological variation between allopatric populations of Steinernema kraussei (Steiner, 1923) (Rhabditida: Steinernematidae)”, Nematology, 2(2), p.143-152 80 50.S S Hussaini, M A Ansari, W.ahmad and S A Subbotin (2001), “Identification of some Indian populations of Steinernema species (Nematoda) by RFLP analysis of the ITS region of rDNA”, International Journal of Nematology,11(1), pp 73-76 51.Saitou N, Nei M (1987), “The neighbour-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol 4: 406425 52.Selcuk Hazir, Patricia Stock and Nevin Keskin (2003), “A new entomopathogenic (Rhabditida: nematode, Steinernema Steinernematidae), from anatoliense Turkey”, n sp Systematic Parasitology, 55, pp.211-220 53.Sergei E Spiridonov, Alex P Reid Kasia Podrucka, Sergei A Subbotin and Maurice Moens (2004), “Phylogenetic relationships within the genus Steinernema (Nematoda: Rhabditida) as inferred from analyses of sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 region of rDNA and morphological features”, Nematology, 6(4), pp.547-566 54.Sudershan Ganguly and L K Singh (2000), “Steinernema thermophilum sp n (Rhabditida: Steinernematidae) from india”, International of Nematology, 10(2), pp.183-191 55.Tailliez P., Pagès S., Ginibre N and Boemare N.E (2006), “New insight into diversity in the genus Xenorhabdus, including the description of ten novel species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, p.2805-2818 56.Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007), “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 10.1093/molbev/msm092 57.Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994), “CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment 81 through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Axits Res 22(22):4673-80 58.Tímea Tóth and Tamás Lakatos (2008), “Photorhabdus temperata subsp cinerea subsp nov., isolated from Heterorhabditis nematodes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58, p 2579-2581 WEB SITES 59 Genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 60 http://vuonquocgiabavi.com.vn/ 82 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách loài tuyến trùng vi khuẩn sử dụng để so sánh STT Tên loài Mã Genbank Tuyến trùng Steinernema longicaudum AY230177 S.guangdongense AY170341 S.khoisanae EU727170 S diaprepesi GU173997 S.arenarium HM160095 S.apuliae HQ416968 S.cubanum AY230166 S.glaseri EU048543 S.aciari AY787660 10 S.puertoricense AF331903 11 Heterorhabditis indica FJ935792 12 H.amazonensis DQ665222 13 H.mexicana EF043444 14 H.taysearae EF043443 15 H.sonorensis FJ477731 16 H.bacteriophora FJ346826 17 H.megidis EU921442 18 H.safricana FJ791249 19 H.hepialus AF083004 Vi khuẩn Xenorhabdus beddingii AY278675 X.griffiniae DQ211710 X.doucetiae DQ211702 X.indica AB507813 X.cabanillasii AY521244 X.bovienii AB243429 83 X.hominickii AB507814 X.budapestensis DQ329379 X.ehlersii DQ208307 10 X.innexi AJ810292 11 Photorhabdus luminescens subsp akhurstii NR_028869 12 P.l.thracensis NR 029012 13 P.l laumondii AY278647 14 P.l luminescens AY27864 15 Photorhabdus tempeata tempeata AY278651 16 Photorhabdus asymbiotica australis NR 029093 17 P.a asymbiotica AY27867 18 P.asymbiotica NC 01296 84 Phụ lục Tọa độ điểm thu mẫu Tọa độ Kí STT hiệu L1 L2 L3 L4 L5 10 11 12 13 14 15 16 B1 B2 B3 B4 B5 D1 D2 D3 D4 D5 D6 17 18 19 D7 T1 T2 20 T3 21 T4 22 23 T5 L6 24 25 L7 L8 Địa điểm thu mẫu Gốc Dưới thân mục Khe gốc to Cạnh mục Gốc Gốc Bụi cỏ Cây đổ Hốc Khe đá Hốc to Gốc Gốc to mục Khe đá khe đá Đất Khe đá,gần đường mòn Gốc tre nhỏ Gốc đổ Gốc mục Gốc dương xỉ, nhiều mục Khe đá, nhiều rụng Khe đá Trong mục Vách đá Kinh Độ Vĩ Độ Độ Cao (m) Loài thu Steinernema sp 21.03.540 21.03.482 105.21.35 105.21.46 85 998 1047 26 L9 27 28 29 30 31 L10 B6 B7 B8 B9 32 D8 33 34 35 36 D9 D10 D11 D12 37 38 D13 D14 39 D15 40 T6 41 T7 42 T8 43 T9 44 45 46 47 T10 L11 L12 L13 48 49 50 51 L14 L15 L16 L17 Gốc mục Gốc mục Gốc tre Ven dốc Hốc đá Bụi Gỗ mục ven đường Gốc to Gốc to Gốc tre Gốc tre Hốc gần đường mòn Gốc Khe đá gần suối Gốc mục Khe suối cạn Gốc cạnh khe suối cạn Khe đá, nhiều bụi Thảm nhiều đá, nhiều rụng Ven dốc Gốc Gốc to Khu sỏi 21.03.406 nhỏ,cây nhỏ Ven dốc Hốc đá Hốc đá 86 Heterabditis sp 105.21.48 1092 52 53 54 L18 D16 D17 55 D18 56 57 58 59 60 D19 B10 B11 B12 B13 61 T11 62 T12 63 T13 64 T14 65 T15 66 67 68 69 70 T16 L19 L20 L21 L22 71 L23 72 73 L24 L25 74 75 L26 T17 Gốc Gốc Gốc Gỗ mục ven đường Đường lên đền thượng Gốc to Khe đá Gốc mục Đất sún Thân mục Sườn dốc, Lá mục, nhiều nhỏ Gốc cây, nhiều mục Gốc cây, nhiều mục Bụi cây, nhiều mục Gốc to Thân mục Gốc to Vách đá Khe đá gốc dương xỉ 21.03.286 Gốc mục Ven dốc Cạnh mục Gốc to 87 105.21.60 1192 76 T18 77 78 T19 T20 79 80 81 T21 T22 T23 82 T24 83 T25 Gốc ven đường, nhiều rụng Mùn ven đường Gốc mục Nhiều đá, nhiều rụng Khe đá Thân mục Trên thân mục Thân mục 88 Phụ lục Kết tìm kiếm trình tự tương đồng mẫu tuyến trùng BVD9 với trình tự có Genbank > gb|GQ497271.1| Heterorhabditis indica strain SSRK53 18S ribosomal ARN gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal ARN gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal ARN gene, partial sequence Length=780 Score = 1323 bits (716), Expect = 0.0 Identities = 719/720 (99%), Gaps = 1/720 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 37 Query 61 Sbjct 97 Query 121 Sbjct 157 Query 181 Sbjct 217 Query 241 Sbjct 277 Query 301 Sbjct 337 Query 361 Sbjct 397 Query 421 Sbjct 457 Query 481 Sbjct 517 Query 541 Sbjct 577 Query 601 Sbjct 637 Query 660 Sbjct 697 AGATGCCGATAATCATGGAATCAGGCTTGTTCTTGGTTCCAGTCGGTGTCTCACCCCATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGATGCCGATAATCATGGAATCAGGCTTGTTCTTGGTTCCAGTCGGTGTCTCACCCCATC 60 TAAGCTCTCGGTGAGGTGTCTATTCTTGATTGGAGCCGCTTTGAGTGACGGCAATGATAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAGCTCTCGGTGAGGTGTCTATTCTTGATTGGAGCCGCTTTGAGTGACGGCAATGATAG 120 TTGGGTATGTTCCCCGTGAGGGTAGAGCATAGACTTTATGAACAGAGCTGGGCTGTCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGGTATGTTCCCCGTGAGGGTAGAGCATAGACTTTATGAACAGAGCTGGGCTGTCGCC 180 TCACCAAAAACCATCGATAACTGGTGGCTGAGTGAGAAATCACTGGATCTGCTATGCAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACCAAAAACCATCGATAACTGGTGGCTGAGTGAGAAATCACTGGATCTGCTATGCAGG 240 GAGCCTTAATGAGTTGGTCTTCACCGACACAACCGCCACTATCGGTAATCTATTCCCAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCCTTAATGAGTTGGTCTTCACCGACACAACCGCCACTATCGGTAATCTATTCCCAAT 300 TTACTTGTTTCTAGTAAAAGGCTAAATTAGTCAGTGGAAAATAGCCTTAGCGATGGATCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACTTGTTTCTAGTAAAAGGCTAAATTAGTCAGTGGAAAATAGCCTTAGCGATGGATCG 360 GTTGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTATTTACCACGAATTGCAGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTTGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTATTTACCACGAATTGCAGAC 420 GCTTAGAGTGGTGAAGTTTTGAACGCACAGCGCCGTTGGGTTTTCCCTTCGGCACGTCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTAGAGTGGTGAAGTTTTGAACGCACAGCGCCGTTGGGTTTTCCCTTCGGCACGTCTG 480 GCTCAGGGTTGTTTAATAGACTTCGATATTGCTAGGAAGGCAGCAATATCGTGCACCGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTCAGGGTTGTTTAATAGACTTCGATATTGCTAGGAAGGCAGCAATATCGTGCACCGAA 540 CGGTGATAGTGTCTATAAAATAGTGGTGCATACCCCGTTTTAGGGTAAAATAAAGGTCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTGATAGTGTCTATAAAATAGTGGTGCATACCCCGTTTTAGGGTAAAATAAAGGTCGT 600 AA-CTGAAACTTCTTCCGCCCGAGAAGTTATAGGTAATACTTATGGATGTGCCATGTATG || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAACTGAAACTTCTTCCGCCCGAGAAGTTATAGGTAATACTTATGGATGTGCCATGTATG 659 AAATATGACGTGGTTATATACATAAATAGTATTTCCTTGAAGTCTCATTATGCAACCTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAATATGACGTGGTTATATACATAAATAGTATTTCCTTGAAGTCTCATTATGCAACCTGA 719 89 96 156 216 276 336 396 456 516 576 636 696 756 Phụ lục Kết tìm kiếm trình tự tương đồng mẫu tuyến trùng BVB1 với trình tự có Genbank > gb|AY230177.1| Steinernema longicaudum 18S ribosomal ARN gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal ARN gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal ARN gene, partial sequence Length=996 Score = 1186 bits (642), Expect = 0.0 Identities = 650/656 (99%), Gaps = 1/656 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 216 Query 61 Sbjct 276 Query 121 Sbjct 336 Query 181 Sbjct 396 Query 241 Sbjct 456 Query 301 Sbjct 516 Query 361 Sbjct 576 Query 421 Sbjct 635 Query 481 Sbjct 695 Query 541 Sbjct 755 Query 601 Sbjct 815 TGAAGTTCGGAACGGCACTGTGCGCATCTAGGTGTCGATTTCGTTCGCAAACGGCTTTGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || TGAAGTTCGGAACGGCACTGTGCGCATCTAGGTGTCGATTTCGTTCGCAAACGGCTTYGA 60 ATGGTTTCTATAGGTGTCTGGAGCAGCTGTATGAGCGTGGCTGTGGTGAAGGACATTTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGTTTCTATAGGTGTCTGGAGCAGCTGTATGAGCGTGGCTGTGGTGAAGGACATTTTA 120 CATCGCTTTGCTGATGTAGAATTAAAGAGGTCAGTCGGAGACCCGCCGTTCACAAACCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATCGCTTTGCTGATGTAGAATTAAAGAGGTCAGTCGGAGACCCGCCGTTCACAAACCCT 180 ACTATTAACATTTTACTTGATGATGCTCCATGCGTATGGTGCAAACAAAGTTATCAAGTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTATTAACATTTTACTTGATGATGCTCCATGCGTATGGTGCAAACAAAGTTATCAAGTC 240 TTATCGGTGGATCACTCGGTTCGTAGTTCGATGAAAAACGGGGCAAAAACCGTTATTTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTATCGGTGGATCACTCGGTTCGTAGTTCGATGAAAAACGGGGCAAAAACCGTTATTTGG 300 CGTGAATTGCAGACATATTGAACGCTAAAATTTTGAACGCAAATGGCACTATYAGGTTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| CGTGAATTGCAGACATATTGAACGCTAAAATTTTGAACGCAAATGGCACTATCAGGTTTA 360 TATCTGATAGTATGTTTGGTTGAGGGTCGATTAACTCGTGACTTGCAGTCAGCTGAGACT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| TATCTGATAGTATGTTTGGTTGAGGGTCGATTAACTCGT-ACTTGCAGTCAGCTGAGACT 420 GTTTTTTCGATGAGCTACTTTTTTGAAGTACCTTTTCGGTATGGTCGCAATGAAAAACGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTTTTTTCGATGAGCTACTTTTTTGAAGTACCTTTTCGGTATGGTCGCAATGAAAAACGC 480 GATAGGTTAATGGAAGTGTGCAACTTCTGCTATCATATCGGTTCTGTGCGTTGGTGGTTT |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || GATAGGTTAATGGAAGYGTGCAACTTCTGCTATCATATCGGTTCTGTGCGTTGGTGGYTT 540 GGCGCGTCTCTTGCCAGCTGACTTGTGCGGACAGCTTCGTTCGTGCGTAAGTTTCTAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGCGTCTCTTGCCAGCTGACTTGTGCGGACAGCTTCGTTCGTGCGTAAGTTTCTAGAA 600 GTCGGTAGCCATTTTAGTTTGACTCAACTTGTTTCCGTTGGTCAACGGACGTACGT ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCGGTAGCCAYTTTAGTTTGACTCAACTTGTTTCCGTTGGTCAACGGACGTACGT 90 656 870 275 335 395 455 515 575 634 694 754 814 Phụ lục Kết tìm kiếm trình tự tương đồng mẫu vi khuẩn BVD9 với trình tự có Genbank > ref|NR_028869.1| Photorhabdus luminescens subsp akhurstii strain FRG04 16S ribosomal ARN, partial sequence Score = 2052 bits (1111), Expect = 0.0 Identities = 1115/1119 (99%), Gaps = 0/1119 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 361 Query 61 Sbjct 421 Query 121 Sbjct 481 Query 181 Sbjct 541 Query 241 Sbjct 601 Query 301 Sbjct 661 Query 361 Sbjct 721 Query 421 Sbjct 781 Query 481 Sbjct 841 Query 541 Sbjct 901 Query 601 Sbjct 961 Query 661 Sbjct 1021 Query 721 Sbjct 1081 Query 781 Sbjct 1141 CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA 60 AGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGATTGAACTTGAACAGGGTTGGACCTTGACGTTACCCG |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||| ||||||||||||| AGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGATTKAACTTGAACAGRGTTGGAYYTTGACGTTACCCG 120 CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGT 180 TAATCGGAATGACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCAATTAAGTTAGATGTGAAATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATCGGAATGACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCAATTAAGTTAGATGTGAAATC 240 CCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCTAAGACTGGTTGACTGGAGTCTCGTAGAGGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCTAAGACTGGTTGACTGGAGTCTCGTAGAGGGGGG 300 TAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGG 360 CGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG 420 ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGGCCCTGAGCTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGGCCCTGAGCTGTG 480 GCTTCCGAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTCCGAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT 540 CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG 600 CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTCAGAATTTGCTGGAGACAGCGAAGTGCCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTCAGAATTTGCTGGAGACAGCGAAGTGCCTTC 660 GGGAACTGAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAACTGAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT 720 AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCACGTCGAGGTGGGAACTCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCACGTCGAGGTGGGAACTCA 780 AAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC 840 91 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 Query 841 Sbjct 1201 Query 901 Sbjct 1261 Query 961 Sbjct 1321 Query 1021 Sbjct 1381 Query 1081 Sbjct 1441 TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGATACAAAGTGAAGCGACCTCGCGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGATACAAAGTGAAGCGACCTCGCGAG 900 AGCAAGCGGAACACACAAAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAAGCGGAACACACAAAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT 960 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCT 1020 TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTCGGTAGCTTAACCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTCGGTAGCTTAACCT 1080 TTTTGGAGGGCGCTGACCACTTTGTGGCTCATGACTGGG ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTTGGAGGGCGCTGACCACTTTGTGGCTCATGACTGGG 92 1119 1479 1260 1320 1380 1440 Phụ lục Kết tìm kiếm trình tự tương đồng mẫu vi khuẩn BVB1 với trình tự có Genbank > gb|AY278675.1| partial sequence Length=1497 Xenorhabdus beddingii 16S ribosomal ARN gene, Score = 2037 bits (1103), Expect = 0.0 Identities = 1113/1118 (99%), Gaps = 0/1118 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 347 Query 61 Sbjct 407 Query 121 Sbjct 467 Query 181 Sbjct 527 Query 241 Sbjct 587 Query 301 Sbjct 647 Query 361 Sbjct 707 Query 421 Sbjct 767 Query 481 Sbjct 827 Query 541 Sbjct 887 Query 601 Sbjct 947 Query 661 Sbjct 1007 Query 721 Sbjct 1067 CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA 60 AGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGTGGACCTGAATACGGTTCACGAATGACGTTACCCG ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| AGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGTGGACCTGAATACGGTTCACGATTGACGTTACCCG 120 CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGT 180 TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCAATTAAGTTAGATGTGAAATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCAATTAAGTTAGATGTGAAATC 240 CCCGGGCTTAACCCGGGAACGGCATCTAAGACTGGTTGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCGGGCTTAACCCGGGAACGGCATCTAAGACTGGTTGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGG 300 TAGAATTCCACGTGTAGCGGTGTAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATGCCGGTGGCGAAGG |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| TAGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGG 360 CGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG 420 ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTG 480 GCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT 540 CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACACGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG 600 CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTTTGCAGAGATGCGAAAGTGCCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTTTGCAGAGATGCGAAAGTGCCTTC 660 GGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT 720 AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCA 780 93 406 466 526 586 646 706 766 826 886 946 1006 1066 1126 Query 781 Sbjct 1127 Query 841 Sbjct 1187 Query 901 Sbjct 1247 Query 961 Sbjct 1307 Query 1021 Sbjct 1367 Query 1081 Sbjct 1427 AGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGAAGACGTCAAGTCATCATGGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| AGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC 840 TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAGATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAGATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAG 900 GGCAAGCGGAACTCATAAAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCAAGCGGAACTCATAAAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT 960 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCT 1020 TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTCGGTAGCTTAACCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTCGGTAGCTTAACCT 1080 TCGGGAGGGCGCTGACCACTTTGTGATTCATGACTGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGGGAGGGCGCTGACCACTTTGTGATTCATGACTGGG 94 1118 1464 1186 1246 1306 1366 1426 ... CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG 1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng (Entomopathogenic nematode... BẢNG vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG, VI KHUẨN CỘNG SINH VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng. .. côn trùng 1.1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 1.1.3 Mối quan hệ EPN vi khuẩn cộng sinh 1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ VI KHUẨN CỘNG SINH 1.2.1 Tình