CƠ CHẾ tác DỤNG của enzyme thủy phân hydrolase

Đa số các enzyme có bản chất hóa học là protein, một số khác có bản chất là acid nucleic trong trường hợp ở viruts có khả năng điều hòa, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa nên còn được gọ

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam



TIỂU LUẬN XÚC TÁC SINH HỌC

Đề tài:

CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME THỦY PHÂN - HYDROLASE

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Thiết

Học viên thực hiện: Hồ Ngọc Anh

Hà Nội, 24/05/2012

MỞ ĐẦU

Enzyme là những chất xúc tác hữu cơ có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất do tế bào sống tổng hợp nên, điều khiển vận tốc và sự chuyển hóa của hàng ngàn phản ứng hóa học xảy ra trong sinh chất Với những ưu điểm như có nguồn gốc từ tự nhiên nên ít tác hại đối với cơ thể, điều kiện xúc tác phản ứng ôn hòa, và có thể chiết tách được từ nhiều nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên… mà ngày nay Công nghệ enzyme rất phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong đời sống

Enzyme có 6 lớp, trong đó enzyme thủy phân (Hydrolase ) được ứng dụng đại trà nhất Đặc biệt trong công nghiệp chế biến thực phẩm, chúng được ứng dụng để tạo ra mùi vị và màu sắc đặc trưng cho sản phẩm, giúp thời gian sản xuất rút ngắn Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên, enzyme này cũng gây ra không ít bất lợi cho quá trình chế biến và bảo quản, làm ảnh hưởng đến chất lượng và cảm quan của sản phẩm thực phẩm

Vì vậy, chúng ta cần phải nắm rõ cơ chế tác dụng và các yếu tố điều chỉnh của chúng

để có những điều chỉnh phù hợp về điều kiện sản xuất, bảo quản…nhằm đạt được hiệu quả cao nhất khi ứng dụng vào sản xuất và cả trong chiết tách enzyme Những ứng dụng và những thông tin trên rất cần thiết cho việc mở rộng kiến thức, nghiên cứu, ứng dụng vào thực tiễn

Đó cũng là nội dung tôi sẽ trình bày trong đề tài tiểu luận : Cơ chế tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase)

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc biệt xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay fecmen Enzyme có trong mọi tế bào sống, vì vậy cũng được gọi là các chất xúc tác sinh học Tuy nhiên, enzyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống chúng vẫn

có thể xúc tác cho các phản ứng ở ngoài tế bào Qua những vần đề nêu trên cho thấy vai trò của enzyme thật phức tạp và đa dạng Trước khi đi vào tìm hiểu cơ chế tác dụng của enzyme thủy phân, và các yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme Tôi xin trình bày Tổng quan về enzyme để làm rõ các đặc trưng cơ bản của một enzyme

TỔNG QUAN VỀ ENZYME

Bất kỳ lúc nào trong cơ thể sống cũng có hàng trăm phản ứng hóa học xảy ra Các phản ứng này cung cấp năng lượng và duy trì sự cung cấp rất nhiều chất cần thiết cho tăng trưởng và tái tạo Ở đây, các phản ứng điều phối toàn bộ quá trình chuyển hóa có được là nhờ vào sự sản xuất các chất đặc biệt, gọi là enzyme (trong tiếng Hy lạp en là bên trong, zym là sự lên men)

Đa số các enzyme có bản chất hóa học là protein, một số khác có bản chất là acid nucleic (trong trường hợp ở viruts) có khả năng điều hòa, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa nên còn được gọi là các xúc tác sinh học

• Không tham gia vào thành phần cuối của phản ứng

• Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme

• Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng

• Theo cấu trúc hóa học thì tất cả enzyme là protein

• Có hiệu suất xúc tác sinh học cao hơn gấp nhiều lần xúc tác hóa học, tuy nhiên vận tốc

có thể tăng khi có xúc tác hóa học

• Enzyme có tính đặc hiệu cao và có tính chọn lọc đối với cơ chất

• Thực hiện sứ mệnh điều phối tất cả các quá trình trao đổi chất của cơ thể

• Có tính chất lý hóa học của protein

• Đa số có dạng hình cầu và không đi qua được màng bán thấm do kích thước lớn

• Tan tốt trong nước và trong dung dịch muối loãng (buffer)

• Cũng như protein enzyme không bền với nhiệt độ Bị biến tính không thuận nghịch bởi acid, base mạnh hay muối kim loại nặng

• Enzyme là những protein đơn giản (enzyme 1 cấu tử): chỉ cấu tạo bởi các L-amino acid, trung tâm hoạt động là các nhóm chức có trong phân tử của amino acid

• Enzyme phức tạp (enzyme 2 cấu tử): ngoài L-amino acid còn có nhóm ngoại (prosthetic) Trong enzyme phức tạp, phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải

protein có thể tách ra và tồn tại độc lập gọi là coenzyme (vitamin) Khi kết hợp chặt với phần protein gọi là nhóm ngoại

• Đa số các coenzyme là chất cho hoặc nhận điện tử

• Coenzyme trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác và giữ vai trò quyết định kiểu của phản ứng xúc tác

• Coenzyme là cầu nối giữa phần protein của enzyme và giúp ổn định phần apoenzyme

• Ngược lại apoenzyme có tác dụng nâng cao hiệu lực xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme

3 TÍNH ĐẶC HIỆU [1], [2], [3]

3.1 Đặc hiệu phản ứng: Một enzyme chỉ xúc tác cho một phản ứng

3.2 Đặc hiệu cơ chất:

• Đặc hiệu tuyệt đối: chỉ có tác dụng lên một cơ chất nhất định

• Đặc hiệu tương đối: có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định trong

phân tử cơ chất

• Đặc hiệu nhóm: có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học.

• Đặc hiệu quang học (còn gọi là đặc hiệu lập thể): chỉ tác dụng lên những đồng phân lập

thể nhất định

4 PHÂN LOẠI ENZYME [1], [2], [3]

4.1 Phân loại theo cấu tạo:

• Enzyme một thành phần: Chỉ có thành phần cấu tạo duy nhất là protein.

• Enzyme hai thành phần: Một phần là protein được kết hợp với một thành phần khác.

- Thành phần cấu tạo bởi protein gọi là Apoenzyme Quyết định tính đặc hiệu cơ chất

- Thành phần không cấu tạo bởi protein, mà có khả năng tách ra gọi là Coenzyme Quyết định tính đặc hiệu phản ứng

- Thành phần không cấu tạo bởi protein, mà không thể tách ra gọi là Cofacter

4.2 Phân loại theo kiểu phản ứng:

Enzyme được phân loại thành 6 nhóm chính:

 Oxidoreductase

 Transferase

 Hydrolase

 Lyase

 Isomerase

 Ligase

Trong cấu trúc của enzyme tồn tại trung tâm họat động Đây là phần rất nhỏ của enzyme, nhưng nó lại quyết định tính xúc tác, tính đặc hiệu của enzyme

Một trung tâm hoạt động của enzyme gồm 2 vùng:

– Tâm xúc tác: Tham gia kết hợp trực tiếp với cơ chất

– Miền tiếp xúc: Gắn cơ chất lên vị trí tác dụng

Đối với enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành do

sự tương tác lẫn nhau của một số gốc acid amin nhất định có trong cấu trúc của enzyme Đối với enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động thường là các nhóm ngoại như vitamin, ion kim loại, và các nhóm định chức của acid amin ở phần apoenzyme

Mô hình chìa khóa và ổ khóa: Trung tâm hoạt động phải có cấu trúc tương ứng với cấu trúc của cơ chất (khớp với nhau như chìa và ổ khóa)

Thuyết tiếp xúc cảm ứng: (theo Kosland) sự tương tác cảm ứng về cấu trúc không gian tạo nên phức hợp enzyme cơ chất

Năng lượng hoạt hóa (Ea): Là năng lượng cần cung cấp để phân tử đạt tới trạng thái hoạt hóa VD: Xăng có khả năng bốc cháy nhưng cần lửa mồi

Cơ chế tổng quát:

Cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất [ES]

Với tác dụng của enzyme, hoạt tính của cơ chất tăng lên rõ rệt và chỉ cần 1 năng lượng hoạt hóa nhỏ thì sẽ tạo thành sản phẩm

Cơ chế tác dụng theo Michaelis-Menten

• Tạo nhanh phức ES, phức này không bền, phức được tạo nên do các liên kết hóa học

• Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất được biến đổi thành sản phẩm

• Sau khi tạo sản phẩm (P), enzyme được giải phóng ra và trở về trạng thái ban đầu

• Phản ứng tổng quát:

E + S  ES  ES  EP  E + P

 Nồng độ enzyme

 Nồng độ cơ chất

 Nhiệt độ

 Chất hoạt hóa

 Chất kìm hãm

CƠ CHẾ TÁC DỤNG

Tính chất chung của nhóm enzym này là xúc tác các phản ứng thủy phân, nghĩa là phân giải các hợp chất phức tạp với sự tham gia của nước, thành những hợp chất đơn giản hơn Các hyddrolase phần lớn là các enzym một thành phần nên chúng không cần coenzym cho hoạt động xúc tác

Trung tâm hoạt động của chúng bao gồm tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide Các nhóm định chức có thể ở xa nhau trong mạch polypeptide nhưng lại gần nhau trong không gian, được định hướng xác định trong không gian cách nhau những khoảng cách nhất định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác

Nhóm hydrolase ( EC3) được chia thành 11 phân nhóm sau: [4]

3.1 : enzym thủy phân các liên kết ester

3.2 : enzym thủy phân các liên kết glycoside

3.3 : enzym thủy phân các liên kết eter

3.4 : enzym thủy phân các liên kết peptide

3.5 : enzym thủy phân các liên kết C—N không phải peptide (các amide)

3.6 : enzym thủy phân các liên kết anhydride acid

3.7 : enzym thủy phân các liên kết C—C

3.8 : enzym thủy phân các liên kết haloid – rượu

3.9 : enzym thủy phân các liên kết P—N

3.10 : enzym thủy phân các liên kết S—N

3.11 : enzym thủy phân các liên kết C—P

Sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân là yếu tố quan trọng quyết định khả năng

và sự dễ dàng của phản ứng thủy phân

Tác dụng xúc tác của enzym phụ thuộc vào từng trường hợp và do sự phân bố electron đã tồn tại trước đó quyết định

Enzym có thể tác dụng bằng các cách khác nhau Cơ chế đơn giản nhất cho phép liên hệ

"phần dương" của liên kết bị thủy phân với tác dụng của enzym là: tâm ái nhân của enzym sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và

sự thủy phân được dễ dàng, thuận lợi Enzym colinesterase và nhiều esterase khác đều tác dụng thủy phân cơ chất theo cơ chế này

Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của enzym với sự khuyết electron của liên kết bị thủy phân là: enzym làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần gũi với liên kết bị thủy phân Nhờ vậy ,làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo một chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho một trong hai nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân

Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại Như vậy bắt buộc tâm hoạt động của chúng phải có các gốc axitamin đặc hiệu

Tâm hoạt động của enzyme hydrolase thường chứa nhóm imidazol của histidin và nhóm hydroxyl của một trong số các gốc serin

Nhiều hydrolase, người ta đã biết được thứ tự sắp xếp của các axitamin chung quanh tâm hoạt động:

Kimotripxin A — Gly — Asp — Ser — Gly —

Kimotripxin — Asp — Ser — Gly —

Colinesterase — Gly — Glu — Ser — Ala —

Carboxylesterase — Gly — Glu — Ser — Ala —

4 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CƠ CHẤT BỊ ENZYME THỦY PHÂN [4]

4.1 Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là protein, gluxit, lipit v.v

Theo Bernard Pullman và Alberte Pullman, đặc điểm chung của những cơ chất này là có

"liên kết bị thủy phân" do các nguyên tử tích điện dương tạo nên Người ta gọi các liên kết này

là "liên kết nhị dương"

Chẳng hạn, liên kết peptide trong protein:

O

R1 C N R2

H Liên kết này do các electron σ định vị của liên kết đơn và một hệ thống eletron π linh động tạo nên Hệ thống đó gồm bốn electron trong đó hai electron của nối kép C = O và hai electron của cặp không chia của nitơ Bốn electron này tạo thành một hệ thống cộng hưởng và theo qui tắc chung: khi ở nguyên tử dị mạch nằm kề liền với nối kép có cặp electron không chia thì sẽ xảy ra sự chuyển dịch một phần điện tích của cặp không chia từ nguyên tử dị mạch tới nguyên tử cuối của nối kép Như vậy, sự phân bố điện tích trong liên kết peptide có thể như sau:

O

R1 C- N+ R2

H Khi đó nguyên tử nitơ tích điện dương, nghĩa là thay cho hai electron của cặp không chia,

nó sẽ chỉ giữ lại một phần nào đó của hai electron này thôi

Ngoài ra do sự khác nhau về độ âm điện của nguyên tử carbon và oxy của liên kết C = O, (có thể xem liên kết C = O như là sự lai hóa giữa cấu trúc đồng hóa trị C = O và cấu trúc ion C+

= O-) mà nguyên tử carbon cũng phải có điện tích tổng dương Như vậy các nguyên tử carbon

và nitơ góp vào hệ thống electron π ít hơn một electron π Còn nguyên tử oxy góp vào hệ thống hơn một electron π, do đó có điện tích tổng âm

Nếu biểu diễn các phần điện tích đó bằng δ thì sự phân bố điện tích trong liên kết peptide như sau:

-δ3

O

+δ1

R1 C N R2

H

Rõ ràng δ3 = δ1 + δ2

+ δ2

Và (1+ δ3) + (1- δ2) + (2 - δ1) = 4.

Bằng phương pháp quĩ đạo phân tử người ta đã tính được sự phân bố bốn electron của hệ thống như sau:

O1.397

1.859

R1 C N R2

H

Từ đây điện tích sẽ được phân bố như sau:

O-0.397

+0.141

R1 C N R2

H Thuật ngữ "liên kết nhị dương" chỉ sự khuyết electron π ở cả hai nguyên tử tạo nên liên kết đó

Đặc trưng nhị dương này của liên kết được bảo toàn trước mọi công kích bất kỳ kể cả sự tấn công của enzyme

Các liên kết nhị dương thường gặp

+ Liên kết este:

trong este của axit carboxylic

O

+0.214

R1 C O R2

+0.326

O Trong este của axit sulfuric:

este của phenol: Ph — O — R

0.744

+0.25

+ Liên kết trong các anhidrit, đặc biệt liên kết — P — O — P trong hợp chất phosphat giàu năng lượng ATP:

O+0.393 O+0.397 O+0.364

+ Liên kết glucozit trong các polysacarit: Khác với các liên kết kể trên, liên kết glucozit chỉ có các electron σ mà không có electron π tham gia Trong trường hợp này, đóng vai trò phân cực là bộ electron σ Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm, gây ra một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử Oxy, do đó oxy tích điện âm, còn các nguyên tử carbon kết hợp với nó bị khuyết electron nên tích điện dương

4.2 Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân càng lớn.

Sự khuyết đó có thể được tăng lên khi tăng tổng điện tích dương của cả hai nguyên tử tạo thành liên kết hoặc khi chỉ tăng điện tích của một trong hai

Nếu trong phân tử cơ chất có nhiều liên kết giống nhau thì liên kết nào nhị dương hơn cả

sẽ bị phân ly thủy phân bởi enzyme ( với điều kiện không có án ngữ không gian và đặc hiệu lập thể của từng liên kết)

Chẳng hạn như trong phân tử alantoin có năm liên kết peptide, nhưng liên kết bị thủy phân trước tiên là liên kết có màu xanh như trong hình bên:

O

+0.121 +0.26 +0.228

+0.236

+0.121 +0.124

5 MỘT VÀI ENZYME HYDROLASE ĐIỂN HÌNH VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG THỰC PHẨM

5.1 Enzym amilase [1]

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với

sự tham gia của nước:

R-R’ + H-OH  R-H + R’-OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: - Endoamylase ( enzyme nội bào)

- Exoamylase ( enzyme ngoại bào) Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh

Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase

Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

+ Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase:

Tùy vào mỗi loại và vào các nguồn khác nhau sẽ có thành phần amino acid khác nhau

a) Đặc tính của enzyme amylase:

 Tính chất vật lý:

- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 D

- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

Mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme

α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa từ 1 đến 30 nguyên

tử gam Ca/1 mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành